[논문]사료 첨가제에 의한 대하의 혈액학적 특성

김영진; 이선이; 조효진; 유선녕; 김광연; 최원철; 허문수; 안순철

doi:10.5352/jls.2006.16.7.1087

[국내논문] 사료 첨가제에 의한 대하의 혈액학적 특성
Hematological Characterization of Penaeus chinensis by Feed-additives 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.16 no.7 = no.80, 2006년, pp.1087 - 1089

김영진 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학교실) , 이선이 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학교실) , 조효진 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학교실) , 유선녕 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학교실) , 김광연 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학교실) , 최원철 (부산대학교 자연과학대학 생물학과) , 허문수 (제주대학교 해양과학대학 해양과학부) , 안순철 (부산대학교 의과대학 미생물학 및 면역학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Shrimp has efficient non-specific defense mechanisms based on activities of the hemocytes against pathogens. Up to now, it has been known that one of the non-specific immune reactions is related to mutual association among types of hemocyte, granular cell, semi-granular cell, and hyaline cell. In this study, we tried to know the effectiveness of feed-additives such as 5-aminolevulinic acid(ALA), chitosan, and hot-water extract of herb on immunity of shrimp (Penaeus chinensis) by hemocytic observation and SDS-PAGE analysis. Finally, we suggest a principle of the examination system for effects of various feed-additives.

주제어

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문제 정의

그러므로 본 연구에서는 현재 새우양식산업에 있어 질병에 따른 폐사와 관련하여 가장 시급한 것은 면역과 관련하여 기존에 보고되어 있는 다양한 천연물 중 대하의 체내 면역력을 강화시킬 수 있는 물질을 탐색할 수 있는 시스템을 확립 하는 것이라 예상하여 이를 위해 새우의 체내 요소 중 면역 과 직접적인 관련이 있는 hemocyte를 중심으로 연구를 진행 하였으며, 면역관련물질의 투여를 통해 hemocyte의 조성과 hemolymph 단백질, 그리고 병원성 지표로서 Vibrio 균의 배양결과에 대한 특이성을 확인하였으므로 이를 새우의 체내 면역력을 검증할 수 있는 시스템 개발에 대한 기초 자료로 이용하고자 한다. 또한 ALA와 한약재 열수 추출물을 투여했을 경우, 새우의 hemolymph 내에서 hemocyanin으로 추정 되는 75 kDa 크기의 단백질과, 미확인된 hemolymph pro- tein의 일종인 60 kDa 크기의 단백질이 각각 특이적으로 발현된 데 대해 추가적인 연구를 통해 hemocyte를 중심으로 한 해양 무척추동물의 면역기작을 규명해 나갈 예정이다.
이에 본 연구에서는 그동안 대하의 면역에 대한 기초 연구가 미비한 점에 감안하여 사료첨가제 성분을 급이한 후, 진행되는 대하의 체내 면역력에 대한 기본적인 이해와 함께 사료첨가제의 효과를 검증할 수 있는 시스템 개발을 위한 기초 연구를 실시하였다.

제안 방법

7%가 포함되어 있다. 그런 다음 일반사료, ALA 첨가사 료, 키토산 첨가사료, 한약재 열수 추출물 첨가사료를 2주간 지속적으로 체중의 10% 분량으로 1일 2회 급이 하였다. 실험 종료 후, 각 시험구별로 시료 개체당 0.
또한 각 시험구의 차이를 확인하기 위한 방법으로 hemo lymph 내 단백질의 변화를 확인하기 위해 SDS-poly- acrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)[6]를 실시하였다. 우선 시료는 PBS로 수세한 다음, SDS sample buffer로 처리하였고, 1% polyacrylamide gel로 전기영동 후, 0.
또한 각 시험구의 차이를 확인하기 위한 방법으로 hemo lymph 내 단백질의 변화를 확인하기 위해 SDS-poly- acrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)[6]를 실시하였다. 우선 시료는 PBS로 수세한 다음, SDS sample buffer로 처리하였고, 1% polyacrylamide gel로 전기영동 후, 0.5% Coomassie brilliant blue R-250 solution으로 염색하여 mo lecular weight standard marker(Roche, Germany)와 비교하면서 확인한 결과, 각 시험구별로 특정 위치에서 단백질량의 변화를 나타내었다(Fig. 2). ALA-사료첨가제 투여구의 경우 에는 60 kDa 위치에서, 그리고 한약재 열수추출물 사료첨가제 투여구의 경우에는 75 kDa 위치에서 각각 일반사료를 투여한 대조구에 비해 높은 수준의 단백질 함량을 보이고 있는데 이 중 75 kDa 크기의 단백질은 이전의 연구[3, 8]에서 보 고되었던 것처럼 hemocyanin으로, 60 kDa 크기의 단백질의 경우 미확인된 hemolymph protein 중한 종류일 것으로 각각 추정된다.
한편, 상기의 이러한 시험구별 차이에 대해 간접적인 외부 병원체에 대한 지표로서 Vibrio 균의 존재 여부를 확인하기 위해 혈액채취 후 각 시험구별로 3미씩 남은 시료의 간췌장과 아가미 등 내부 장기를 시료로 하여 TCBS agar plate (DIFCO, USA)에 접종한 다음, 25℃에서 3일간 배양하였다. 각 시험구별로 Vibrio 균의 배양 결과를 확인해 본 결과, 일반 사료 급이구에서는 평균 3xl03 CFU/ml 인데 비해 나머지 3개 사료첨가제 시험구에서는 모두 bio? CFU/ml 미만의 낮은 수치를 나타내었다(Fig.

대상 데이터

우선 본 연구를 위해 전남 신안 지역의 양식장에서 사육 중인 평균 체중 5~6 g 정도의 대하 치하를 구입하여 4개 수조에 각 10미씩 분산 수용하고 1주일간 일반사료를 급이하면서 순치시켰으며, 사료 첨가제로 사용된 5-aminolevulinic acid(ALA), 수용성 키토산, 그리고 감초와 녹용이 각각 5% 정도 포함된 한약재의 열수 추출물 등은 1 g/L 농도로 조절 하여 각각 시판되는 새우 일반사료(치하용 사료, (주)천하제 일사료)에 분무하여 흡착시킨 후, 4E에서 3일간 저온 건조 시켜 준비하였다. 이때 사용된 치하용 사료에는 조단백 45%, 조지방 5%, 조회분 17%, 조섬유 5%, 칼슘 1.

이론/모형

채혈된 hemolymph로부터 hemocyte의 수와 조성을 확인 하기 위해 Kondo 등의 방법 [5]에 따라 5, 000 rpm으로 5분간 원심분리하고 동량의 medium 199과 혼합한 다음, Giemsa 용액으로 염색하여 광학현미경 상에서 관찰하였다. 먼저 he- mocyte의 수에 있어서는 전체적으로 평균 3~3.

성능/효과

한편, 상기의 이러한 시험구별 차이에 대해 간접적인 외부 병원체에 대한 지표로서 Vibrio 균의 존재 여부를 확인하기 위해 혈액채취 후 각 시험구별로 3미씩 남은 시료의 간췌장과 아가미 등 내부 장기를 시료로 하여 TCBS agar plate (DIFCO, USA)에 접종한 다음, 25℃에서 3일간 배양하였다. 각 시험구별로 Vibrio 균의 배양 결과를 확인해 본 결과, 일반 사료 급이구에서는 평균 3xl03 CFU/ml 인데 비해 나머지 3개 사료첨가제 시험구에서는 모두 bio? CFU/ml 미만의 낮은 수치를 나타내었다(Fig. 3).
그런 다음 일반사료, ALA 첨가사 료, 키토산 첨가사료, 한약재 열수 추출물 첨가사료를 2주간 지속적으로 체중의 10% 분량으로 1일 2회 급이 하였다. 실험 종료 후, 각 시험구별로 시료 개체당 0.5〜1 ml 정도의 he- molymph를 심장으로부터 직접 채혈하여 준비하였는데 시 료 채집 시, 체강도와 자극에 대한 반응성을 기준으로 각 시 험구별 외형적 건강도를 조사한 결과, Table 1에서 보는 것 처럼 대조구인 일반사료 급이구와 비교하여 ALA, 키토산, 한약재 추출물 사료첨가제 급이구에서 전반적으로 더 좋은 건강상태를 보였다.
ALA-사료첨가제 투여구의 경우 에는 60 kDa 위치에서, 그리고 한약재 열수추출물 사료첨가제 투여구의 경우에는 75 kDa 위치에서 각각 일반사료를 투여한 대조구에 비해 높은 수준의 단백질 함량을 보이고 있는데 이 중 75 kDa 크기의 단백질은 이전의 연구[3, 8]에서 보 고되었던 것처럼 hemocyanin으로, 60 kDa 크기의 단백질의 경우 미확인된 hemolymph protein 중한 종류일 것으로 각각 추정된다. 특이적으로 증가한 이들 단백질들에 대해 ALA 의 경우에는 각종 유기체의 tetrapyrrole 생합성 (porphyrin, chlorophyll, heme 및 vitamin Bn 등) 과정에서 발견되는 중 간물질의 하나로서, C-5의 지방족 화합물이며 heme 구조를 가진 각종 효소나 porphyrin 중간물질, 비타민 등의 제조에서 전구물질로 사용되고 있다는 점[기과, 한약재 열수 추출물의 경우에도 주로 보혈작용을 하는 것으로 알려진 녹용과 감초 등이 포함되어 있다는 점이 본 연구에서 나타난 결과에 대한 근거가 될 수 있을 것으로 예상된다.

후속연구

그러므로 본 연구에서는 현재 새우양식산업에 있어 질병에 따른 폐사와 관련하여 가장 시급한 것은 면역과 관련하여 기존에 보고되어 있는 다양한 천연물 중 대하의 체내 면역력을 강화시킬 수 있는 물질을 탐색할 수 있는 시스템을 확립 하는 것이라 예상하여 이를 위해 새우의 체내 요소 중 면역 과 직접적인 관련이 있는 hemocyte를 중심으로 연구를 진행 하였으며, 면역관련물질의 투여를 통해 hemocyte의 조성과 hemolymph 단백질, 그리고 병원성 지표로서 Vibrio 균의 배양결과에 대한 특이성을 확인하였으므로 이를 새우의 체내 면역력을 검증할 수 있는 시스템 개발에 대한 기초 자료로 이용하고자 한다. 또한 ALA와 한약재 열수 추출물을 투여했을 경우, 새우의 hemolymph 내에서 hemocyanin으로 추정 되는 75 kDa 크기의 단백질과, 미확인된 hemolymph pro- tein의 일종인 60 kDa 크기의 단백질이 각각 특이적으로 발현된 데 대해 추가적인 연구를 통해 hemocyte를 중심으로 한 해양 무척추동물의 면역기작을 규명해 나갈 예정이다.

참고문헌 (9)

Bachere, E., E. Mialhe and J. Rodriguez. 1995. Identification of defense effectors in the haemolymph of crustaceans with particular reference to the shrimp P. japonicus (Bate): prospects and applications. Fish Shellfish Immunol., 5, 597-612

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Kim, Y. J., W. C. Choi, H. R. Kim, J. H. Kim, S. J. Jung and M. J. Oh. 1999a. Detection of white spot baculovirus from Penaeus chinensis in Korea. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 19(2), 170-172
Kim, Y. J., W. C. Choi, H. R. Kim, S. J. Jung and M. J. Oh. 1999b. Change in Penaeus chinensis haemocytes during white spot baculovirus (WSBV) infections. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 19(5), 213-215
Kim, Y. J., S. J. Jung and M. J. Oh. 2001. Investigation of the pathway of white spot syndrome virus (WSSV) infection. J. Fish Pathol. 14(3), 129-136
Kondo, M., H. Matsuyama and T. Yano. 1992. The opsonic effect of lectin on phagocytosis by haemocytes of kuruma prawn, P. japonicus. Fish Pathol. 27(4), 217-222

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Laemmli, U. K 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685

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Sasaki, K., M. Watanabe, T. Tanaka and T. Tanake. 2002. Biosynfhesis, biotechnological production and applications of 5-aminolevulinic acid, Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, 23-29

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Sellos, D., S. Lemoine and A. V. Wormhoudt. 1997. Molecular cloning of hemocyanin cDNA from Penaeus vannamei (Crustacea, Decapoda): structure, evolution and physiological aspects. FEBS Lett. 407, 153-158

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Soderhall, K. and L. Cerenius. 1992. Crustacean Immunity. Ann. Rev. Fish Dis. 2, 3-23

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