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문제 정의
- 본 연구는 갈파래(Ulva lactuca) 추출분획의 암세포주에 대한 세포독성 및 면역활성 효과를 조사하였다. 갈파래의 에탄올 추출물로부터 분획물의 제조는 hexane, ethyl ether, methanol, butanol, HQ의 용매를 이용하여 행하였다.
- 4종류의 세포 모두에서 농도의존적 경향을 나타냈다. 갈파래 분획물의 큰쥐 대식세포주(RAW264.7)에 대한 면역활성 효과도 조사하였다. 갈파래 추출물의 5가지 분획물 모두에서 농도 의존적으로 NO 생산을 활성화시켰다.
- 본 연구는 갈파래의 에탄올 추출물에 대한 용매별 분획을 행하여 얻은 각각의 분획물들의 생리활성을 연구하기 위해 다양한 암세포주들에 대한 세포독성 및 면역활성을 검증하였다.
제안 방법
- 3 여과지 (Whatman International Ltd, , Maidstone, England)로 2회 여과하였다. 이를 butanol, ethyl ether, hexane, methanoL HQ 등을 이용하여 Fig. 1에 나타낸 방법으로 분획을 행한 후, 농축하여 분획물을 제조하였다.
- Louis, MI, USA) 제품을 이용하였다. 배양된 인체 혈구암세포주 U937, 생쥐 신경 아종 세포주 NB41A3, 인체 간암세포주 HepG2z 큰쥐 신경교 세포주 C6를 96-well plate (Roche Incv Indianapolis, IN, USA)에 180㎕씩 분주하고, 갈파래 분획물들을 phosphate- buffered saline (PBS, Bio Whittaker)에 희 석 하여 20 ㎕씩 첨가하였다 (최종농도 0.5, 0.1, 0.01 mg/ml). 대조군은 갈파래 분획물 대신 동량의 PBS를 가하였다.
- 01 mg/ml). 대조군은 갈파래 분획물 대신 동량의 PBS를 가하였다. 37℃, 5% C6에서 48 시간 추가 배양한 후 배양액을 제거하고 MTT (5 mg/ml in PBS)용액을 100㎕씩 가하고 37C, 5% CO2에서 4시간 동안 배양하였다.
- )에 분주하고 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 배양세포를 PBS로 세정한 후 갈파래 분획물들을 PBS에 희석하여 20 ㎕씩 첨가하였다 (최종농도: 03 0.1, 0.01 mg/ml). 대조군은 갈파래 분획물 대신 동량의 PBS를 가하였다.
- 37C 5% CO에서 24시간 배양한 후 배양액 100μl에 reaction diluent 400 ill를 첨가하여 희석을 행하였다. Total NO assay는 Total NO/Nitrite/Nitrate Assay Kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)> 사용하여 제조사의 manual을 토대로 행하였으며, Synergy HT Multi-detection microplate reader (Biotek Instruments, Inc.)를 이용하여 540 nm의 파장에서 OD값을 즉정하였다.
- 갈파래 시료 800 g에 대한 에탄올 추출을 행하고 이를 Rotary evaporator (EYELA Inc., Tokyo, Japan)로 농축을 행하여 최종적으로 3 L의 에탄올 추출시료를 얻었다. 이를butanol, ethyl ether, hexane, methanol, HQ 등을 이용하여분획을 행하고(Fig.
- 세포독성 및 면역활성 효과를 조사하였다. 갈파래의 에탄올 추출물로부터 분획물의 제조는 hexane, ethyl ether, methanol, butanol, HQ의 용매를 이용하여 행하였다. 인간백혈암세포주(U937), 생쥐 신경아종세포주(NB41A3), 인체간암 세포주(HepG2), 큰쥐 신경교세포주(C6) 등에 대한 갈파래 분획물의 세포독성을 측정하였다.
- 갈파래의 에탄올 추출물로부터 분획물의 제조는 hexane, ethyl ether, methanol, butanol, HQ의 용매를 이용하여 행하였다. 인간백혈암세포주(U937), 생쥐 신경아종세포주(NB41A3), 인체간암 세포주(HepG2), 큰쥐 신경교세포주(C6) 등에 대한 갈파래 분획물의 세포독성을 측정하였다. 갈파래의 Ethyl ether 층은 4종류의 세포 모두에서 가장 높은 세포독성을 나타냈다.
대상 데이터
- 7 은 10% feal bovine serum (Bio Whittaker, Walkersville, MD, USA) 과 penicillin-streptomycin (100 units/ml, Bio Whittaker)을 포함하는 RPMI 1640 (Bio Whittaker)배지를 이용하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 생쥐 신경아종세포주 NB41A3, 인체 간암세포주 HepG2z 큰쥐 신경교세포주 C6는 10% feal bovine serum (Bio Whittaker)과 penicillinstreptomycin (100 units/ml)^7 포함하는 Delbecco's modified eagle medium (DMEM)배지를 이용하여 37℃, 5% CO2에서배양하였다.
- 갈파래(LHw ImMw)는 부산 광안동 수변공원에서 채취하여 증류수로 수세, 정선 및 탈수과정을 거쳐서 건조시킨 후 분쇄한 시료 무게의 10배 량 (w/v)의 80% 반hanol로 약 60℃ 에서 8시간 동안 추출을 행하였으며, 추출액은 Whatman NO.3 여과지 (Whatman International Ltd, , Maidstone, England)로 2회 여과하였다. 이를 butanol, ethyl ether, hexane, methanoL HQ 등을 이용하여 Fig.
- MTT (3-[4/5-dimethylthiazol2yl"2, 5-diphenyitetrazolium bromide) 는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI, USA) 제품을 이용하였다. 배양된 인체 혈구암세포주 U937, 생쥐 신경 아종 세포주 NB41A3, 인체 간암세포주 HepG2z 큰쥐 신경교 세포주 C6를 96-well plate (Roche Incv Indianapolis, IN, USA)에 180㎕씩 분주하고, 갈파래 분획물들을 phosphate- buffered saline (PBS, Bio Whittaker)에 희 석 하여 20 ㎕씩 첨가하였다 (최종농도 0.
- 인체 혈구암세포주 U937과 생쥐 대식세포주 RAW 264.7 은 10% feal bovine serum (Bio Whittaker, Walkersville, MD, USA) 과 penicillin-streptomycin (100 units/ml, Bio Whittaker)을 포함하는 RPMI 1640 (Bio Whittaker)배지를 이용하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 생쥐 신경아종세포주 NB41A3, 인체 간암세포주 HepG2z 큰쥐 신경교세포주 C6는 10% feal bovine serum (Bio Whittaker)과 penicillinstreptomycin (100 units/ml)^7 포함하는 Delbecco's modified eagle medium (DMEM)배지를 이용하여 37℃, 5% CO2에서배양하였다.
성능/효과
- 인간백혈암세포주(U937), 생쥐 신경아종세포주(NB41A3), 인체간암 세포주(HepG2), 큰쥐 신경교세포주(C6) 등에 대한 갈파래 분획물의 세포독성을 측정하였다. 갈파래의 Ethyl ether 층은 4종류의 세포 모두에서 가장 높은 세포독성을 나타냈다. 또한 수층 역시 비교적 높은 세포독성을 나타냈다.
- , Tokyo, Japan)로 농축을 행하여 최종적으로 3 L의 에탄올 추출시료를 얻었다. 이를butanol, ethyl ether, hexane, methanol, HQ 등을 이용하여분획을 행하고(Fig. 1), 얻어진 분획물을 Centrifugal evaporator (Sovall RC 5C+, Ashevrlle, NC, USA)t 이용하여 용매 제거 및 농축을 행한 결과 각각의 갈파래 분획물 시료들을 10 mg 전후의 비슷한 양으로 얻을 수 있었다.
- 2에 나타냈다. Ethyl ether층 분획물의 경우 0.5 mg/ml의 농도에서 미처리대조군에 비해 92%의 탁월한 생육저해 활성을 보였고 수층 분획물의 경우 0.5 mg/ml의 농도에서 80%의 생육저해 활성을 나타냈다(Fig. 2). 이는 다른 분획물인 Hexane층, BuOH 층, MeOH층에 비해 높은 활성을 나타내는 것이었다.
- 이는 다른 분획물인 Hexane층, BuOH 층, MeOH층에 비해 높은 활성을 나타내는 것이었다. 가장 높은 생육저해 활성을 보이는 Ethyl ether층 분획물을 각각 0.1, 0.01 mg/ml로 처리했을 때 대조구에 비해 70%와 50%의 생육 저해 활성을 보였고, 수층분획물은 0.1, 0.01 mg/ml 농도에서 각각 50%와 28%의 생육저해 활성을 보였다. 즉, 갈파래 추출물은 농도의존적으로 혈구암 세포에 대한 생육 저해 효과를 보이는 것으로 나타났다(Fig.
- 01 mg/ml 농도에서 각각 50%와 28%의 생육저해 활성을 보였다. 즉, 갈파래 추출물은 농도의존적으로 혈구암 세포에 대한 생육 저해 효과를 보이는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 3에 나타냈다. Ethyl ether층 분획물의 경우 0.5 mg/ml의 농도에서 미처리 대조군에 비해 70%의 탁월한 생육저해 활성을 보였고 수층 분획물의 경우 0.5 mg/ml의 농도에서 45%의 생육저해 활성을 나타냈다(Fig. 3). 이는 다른 분획물인 Hexane층, BuOH층, MeOH층에 비해 높은 활성을 나타내는 것이었다.
- 이는 다른 분획물인 Hexane층, BuOH층, MeOH층에 비해 높은 활성을 나타내는 것이었다. 가장 높은 생육저해 활성을 보이는 Ethyl ether층 분획물을 각각 0.1, 0.01 mg/ml로 처리했을 때 대조구에 비해 50%와 20%의 생육 저해 활성이 나타났으며, 수층분획물은 0.1, 0.01 mg/ml 농도에서 각각 40%와 17%의 생육저해 활성을 보였다. 갈파래 분획물은 혈구암 세포의 경우와 비슷하게 신경아종 세포에서도 전반적으로 농도에 의존하는 생육저해 효과를 보였고 그 중에서도 Ethyl ether층과 수층에서 높은 활성을 나타냈다(Fig.
- 01 mg/ml 농도에서 각각 40%와 17%의 생육저해 활성을 보였다. 갈파래 분획물은 혈구암 세포의 경우와 비슷하게 신경아종 세포에서도 전반적으로 농도에 의존하는 생육저해 효과를 보였고 그 중에서도 Ethyl ether층과 수층에서 높은 활성을 나타냈다(Fig. 3).
- 4에 나타냈다. 간암 세포주에 갈파래의 각 분획물을 첨가하여 생육저해 활성을 측정한 결과 전반적으로 높은 활성을 나타냈고 특히 Ethyl ether층 분획물의 경우 0.5 mg/ml의 농도에서 미처리대조군에 비해 75%의 생육저해 활성으로 다른 분획물에 비해 월등히 높은 활성을 나타냈다(Fig. 4). 분획물의 농도를 0.
- 4). 분획물의 농도를 0.01 mg/ml 의로 처리하였을 때는 0.5, 0.1 mg/ml의 농도보다 낮은 활성을 보여, 갈파래 추출물의 농도가 증가함에 따라 암세포 성육저해 효과도 증가한 것으로 나타났다 (Fig. 4).
- 5에 나타냈다. 분획물들은 전반적으로 높은 생육저해 활성을 보였으며 특히 Ethyl ether층 분획물의 경우 0, 5 mg/ml의 농도에서 미처리대조군에 비해 95%의 생육저해 활성을 나타냈고 다음으로 수층 분획물의 생육저해 활성이 높았다(Fig. 5). 갈파래의 Ethyl ether층 및 수층의 분획물들은 신경교 세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하였다(Fig.
- 6). 하지만 미처리대조군에 비하여 시료 전반에 걸쳐 탁월한 면역활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 일반적으로 이 종양은 주변의 뇌로 퍼져나가기 때문에 정상적인 뇌와의 경계가 명확하지 않아 수술로 전부 적출하는 것은 어렵기 때문에 약물치료제의 연구가 시급한 실정이다. 본 연구 결과로 갈파래로부터 추출한 생리활성 물질을 이용하여 암세포들에 대해 세포독성을 나타내는 성분을 밝혀내고 연구를 계속해 나간다면 새로운 항암활성 소재의 개발에 도움이 될 것으로 기대된다.
- 본 연구의 결과로 현재 식용으로 사용되고 있지 않아 버려져 있는 해조류인 갈파래(Uta? hzctuca)를 이용하여 암 예방 및 면역활성 강화를 위한 기능성 소재의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 갈파래 추출물의 5가지 분획물 모두에서 농도 의존적으로 NO 생산을 활성화시켰다. 이러한 결과들로 갈파래가 항암 및 면역활성을 나타내는 천연 소재개발에 있어 유용한 후보가 될 수 있을 것으로 사료된다.
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