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문제 정의
- 본 연구에서는 콩 식품의 품질 및 가공적성을 최적화하기 위 해 대두 이소플라본 추출물의 생리활성과 가공적성 에 대한 실험을 수행하였다. 메탄올 추출 이소플라본의 free radi cal 소거능이 가장 우수하였고, 아질산 소거능은 메탄올, 에탄올과 열수추출물의 순으로 나타났다.
- 그러나 아직 국내에서는 이소플라본의 생리활성 특성, 품종별 함량 분포, 콩 및 일부 콩 가공식품의 이소플라본 함량 분석 등 기초적 인 연구가 진행되었을 뿐이다(16, 17). 따라서 본 연구에서는 콩 식품의 품질 및 가공적성을 최적화하기 위해 콩 함유 이소플라본의 기능 특성을 연구하였다.
- 이소플라본의 항종양활성에 대한 국외 연구 보고는 많으나 한국인에게 빈발하는 암세포를 대상으로 한 연구가 없으므로 이에 대한 활성시험을 실시하였다. 서울대학교 암연구센타로부터 한국인에게 호발하는 cancer cell line인 위암세포(SNUT)과 대장암세포(SNU-C4)를 분양받아 MTT법으로 항종양활성을 측정해 본 결과는 Table 2와 같다.
제안 방법
- 또한, 한국인에게 호발하는 위암세포(SNUT)과 대장암세포(SNU-C4)에 대한 이소플라본 및 대두 추출물의 항종양활성을 확인하였다. 대두 이소플라본이 가공제품이나 특수영양식품으로 가공될 때 문제가 될 수 있는 여러 조건별 안정성을 검토하기 위하여, 분말 상태의 대두 이소플라본 농축물(20〜40%), 99% 이소플라본표준품, 대두상태의 이소플라본을 대상으로 열, pH, 살균조건에 따른 안정성을 조사하였다. 대두 이소플라본 농축물은 pH 3 이하와 pH 8 이상의 pH에서 크게 감소하였으나 대두 상태의 이소플라본은 pH에 따른 이소플라본의 함량 감소가 없이 거의 일정하게 유지되었다.
- 이소플라본 표준물질을 methanol에 용해시켜 0.1 〜25 ug/ mL 범위의 표준용액을 조제하여 HPLC 분석을 실시하고 peak area로부터 검량선을 작성하였다.
- 측정하였다. 추출물 1 m丄에 2X10T M DPPH 용액 (메탄올에 용해) 2 mL를 가한 후 vortex mixer로 10초간 혼합하고 추출물의 농도별 시 간에 따른 전자공여 작용을 분광광도계를 이용하여 525 nm에서 DPPH의 환원반응이 더이상 일어나지 않는 steady state 상태에 이르는 시간을 측정하여 적정 반응시간으로 설정하였다. 적정 반응시간 설정 후 각 추출물 1 mL에 2xl()T M DPPH 용액 2 m止를 가한 후 vortex mixer로 10초간 혼합하고 적정 반응시간 동안 반응 시 키 면서 525 nm에서 의 흡광도를 측정 하였다.
- 2로 조정 하였으며 반응용액의 부피를 10 mL로 하였다. 이 액을 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 후 각 반응액을 1 mL씩취 하여 2% 초산용액 5 mL, Griss시 약(30% 초산으로 각각 조제한 1% sulfanilic acid와 1% naphtylamine을 1:1 비율로 혼합한 것, 사용직전 조제) 0.4 mL을 첨가하고 잘 혼합한 다음 실온에서 15분간 방치 후 분광광도계를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하고 잔존하는 아질산량을 산출하였다. 대조구는 Griss 시약 대신 증류수를 0.
- 4 mL을 첨가하고 잘 혼합한 다음 실온에서 15분간 방치 후 분광광도계를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하고 잔존하는 아질산량을 산출하였다. 대조구는 Griss 시약 대신 증류수를 0.4 mL 가하여 상기와 같은 방법으로 실시하였으며 아질산염 소거작용은 추출액을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 아질산염 백분율 (%)로 나타내었다. 이때 값이 큰 것일수록 추출액의 아질산염 분해작용이 크다는 것을 의미한다.
- 다음과 같다. 적정 세포수는 약물처리하지 않은 대조군에서 세포접종 당시와 4일 후 MTT 실험종료시 에 모두 세포가 지수, 함수적으로 활발히 증식하면서 MTT처리후의 ODbo 값이 0.6〜0.7에 이를 수 있는 세포수로 정하였다. 적정 수의 세포를 180 uL의 배지에 부유시켜 96 well plate의 12개 칼럼 중 10개의 칼럼에 접종하였다.
- 적정 수의 세포를 180 uL의 배지에 부유시켜 96 well plate의 12개 칼럼 중 10개의 칼럼에 접종하였다. 추출물 시료는 PBS(phos- phate buffered §aline) 에 용해시킨 후 20 pL씩 각 well에 가해 시료의 최종농도는 well당 각각 300, 30, 2 ug/mL씩 되도록 하였다. 한 가지 농도에 대해서는 1 colurnn(8 well)을동일한 조건으로 사용하며 나머지 한 column에는 약물 대신 PBS만을 20 i」L첨가하여 100% 생존군(control survival)으로 하였다.
- 추출물 시료는 PBS(phos- phate buffered §aline) 에 용해시킨 후 20 pL씩 각 well에 가해 시료의 최종농도는 well당 각각 300, 30, 2 ug/mL씩 되도록 하였다. 한 가지 농도에 대해서는 1 colurnn(8 well)을동일한 조건으로 사용하며 나머지 한 column에는 약물 대신 PBS만을 20 i」L첨가하여 100% 생존군(control survival)으로 하였다. 흡광도 측정시 사용할 blank에는 세포 없는 배지만을 180 uL 가하고 PBS 또는 약물을 20 11L 첨가하였다.
- 1 mg의 MTT(3- [4, 5-dimethyl thiazole-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromede, Sigma)를 모든 well에 가해주고 다시 37°C에서 4시간 더 배양하였으며 배양 종료 시 plate를 450xg에서 5분간 원심분리한 후 배지를 30 pL 정도만 남기고 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 150 uL씩 가한 후에 formazan 결정이 녹을 때까지 약 10분간 가볍게 진탕해 주고 microplate reader (scanning mutiwell spectrophotometer) 로 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이로부터 대조군과 비교한 시험 군의 세포 생존율을 구하고 생존율이 50%가 되도록 하는 약물의 농도로부터 50% 억제농도(IC50, inhibitory concentration) 를 구하였다.
- 배지가 제거된 각 well에 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 150 uL씩 가한 후에 formazan 결정이 녹을 때까지 약 10분간 가볍게 진탕해 주고 microplate reader (scanning mutiwell spectrophotometer) 로 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이로부터 대조군과 비교한 시험 군의 세포 생존율을 구하고 생존율이 50%가 되도록 하는 약물의 농도로부터 50% 억제농도(IC50, inhibitory concentration) 를 구하였다.
- 대두의 용매별 추출물을 제조하고 이들의 free radical 소거능, 아질산염 소거능, angiotensin 변환효소(ACE) 저해작용을 통한 생리활성 특성을 비교하였으며 결과는 Table 1과 같다. 추출수율은 100°C에서 열수추출물이 80°C에서 환류 추출한 에탄올과 메탄올 추출물보다 높았으나 이소플라본함량을 고려 한 이소플라본 추출수율은 80% 에탄올 추출물이 가장 높았다.
- 아니라 인체나 동물의 위내에서도 생성된다고 알려지고 있다. 아질산염 소거작용을 용매별 대두추출물을 대상으로 pH에 따라 실험하였으며 결과는 Fig. 2와 같다. 각용 매별 추출물의 아질산염 분해작용은 반응용액의 pH가 낮을수록 높게 나타나 각 시료 모두 pH 1.
- 대두 이 소플라본이 가공제품이 나 특수영 양식 품으로 가공될 때 문제가 될 수 있는 여러 조건별 안정성을 검토하기 위하여, 분말상태의 대두에서 추출한 이소플라본 농축물(20 〜40%), 99% 이소플라본 표준품, 대두분말상태의 이소플라본을 대상으로 열과 pH 등의 살균조건에 따른 안정성을 실험하였다.
- 한편 이 소플라본의 열 안정 성 을 시 차주사열 량계 를 사용하여 조사하였다. 스텐레스 팬에 이소플라본 표준품을 넣고 수분 무첨가구와 3배의 수분 첨가구를 제조하였으며 완전밀봉하고 질소기류하에서 분당 10°C의 속도로 가열한 결과 160°C까지의 가열에도 흡열이나 발열피크 등 상전이가 나타나지 않아 열분해에 안정함을 확인할 수 있었다(데이터 제시않음).
- ACE 저 해작용은 이소플라본이 가장 많이 추출된 메탄올 추출물보다 열수 추출물에서 더 큰 효과를 보였다. 또한, 한국인에게 호발하는 위암세포(SNUT)과 대장암세포(SNU-C4)에 대한 이소플라본 및 대두 추출물의 항종양활성을 확인하였다. 대두 이소플라본이 가공제품이나 특수영양식품으로 가공될 때 문제가 될 수 있는 여러 조건별 안정성을 검토하기 위하여, 분말 상태의 대두 이소플라본 농축물(20〜40%), 99% 이소플라본표준품, 대두상태의 이소플라본을 대상으로 열, pH, 살균조건에 따른 안정성을 조사하였다.
대상 데이터
- 경기도 수원 작물시험장과 경남 밀양의 영남시험장에서 2000년 수확한 황금콩을 분양받아 0°C에 보관하면서 실험에 사용하였다. 이소플라본 정량분석을 위한 표준물질로써 Sigma(St.
- 사용하였다. 이소플라본 정량분석을 위한 표준물질로써 Sigma(St. Louis. MO, USA)사의 genistein, genistin 및 daidzein을 사용하였고 glycitein과 기타 이소플라본 표준물질은 Fujicco사의 제품을 사용하였다. Chymotrypsin, N-benzoyl-L-tyrosine-p-nitroanilide 등의 protease 저 하] 활성 측정용 시약 등은 Sigma사의 것을 사용하였다.
- Chymotrypsin, N-benzoyl-L-tyrosine-p-nitroanilide 등의 protease 저 하] 활성 측정용 시약 등은 Sigma사의 것을 사용하였다. 면역학적 분석을 위한 rabbit anti-BBPI IgG는 본 연구실에서 제조한 것을, phosphate buffered saline(PBS), Tween 20, phosphate-citrate buffer(PCB), anti-rabbit IgGHRP conjugate 등의 시약류는 Sigma(St. Louis, MO, USA) 사의 것을, 기질로서 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine dihydro- chloride(TMB) 은 Pierce(Rockford, IL, US A) 사의 것을 사용하였다.
- JASCO(Japan)사의 HPLC system을 이용하였으며 col- umn은 ODS 계옅의 YMC AM303(4.6x250 mm)을 사용하였다. 이동상은().
- 6x250 mm)을 사용하였다. 이동상은().1% acetic acid를 함유한 acetonitrile과 0.1% acetic acid를 함유한 water를 30:70 비로 혼합한 용매를 사용하였다. 유속은 1.
- 실험에 사용된 세포주들은 한국인 유래 암세포주로 성장 속도가 빠르면서 항암제 감수성이 예민한 SNU-1(위암 세포주)와 성장속도는 빠르지만 일부의 항암제에 내성을 갖는 SNU-C4(대장암세포주)를 서울대학교 암연구센터에서 분양받아 실험에 사용하였다.
이론/모형
-
DPPH에 대한 전자공여 작용
전자공여작용(electron donating ability)은 Williams 등 (19)의 방법에 따라 각 추출물의 DPPH(a, a-diphenyl-J3- picrylhydrazyl) 에 대한 전자공여효과로 나타나는 시료의 혼卜 원력으로 측정하였다. 추출물 1 m丄에 2X10T M DPPH 용액 (메탄올에 용해) 2 mL를 가한 후 vortex mixer로 10초간 혼합하고 추출물의 농도별 시 간에 따른 전자공여 작용을 분광광도계를 이용하여 525 nm에서 DPPH의 환원반응이 더이상 일어나지 않는 steady state 상태에 이르는 시간을 측정하여 적정 반응시간으로 설정하였다.
- Kato 등(20)의 방법에 따라 측정하였다. NaNCh용액 2 mL에 시료를 일정농도로 녹인 용액 1 mL를 가하고 pH를 1.
- 추출물이 암세포주에 나타내는 세포독성을 항암효과의 지표로 삼고 MTT검색법 (21)으로 실시하였으며 실험 방법은 다음과 같다. 적정 세포수는 약물처리하지 않은 대조군에서 세포접종 당시와 4일 후 MTT 실험종료시 에 모두 세포가 지수, 함수적으로 활발히 증식하면서 MTT처리후의 ODbo 값이 0.
성능/효과
- 메탄올 추출 이소플라본의 free radi cal 소거능이 가장 우수하였고, 아질산 소거능은 메탄올, 에탄올과 열수추출물의 순으로 나타났다. ACE 저 해작용은 이소플라본이 가장 많이 추출된 메탄올 추출물보다 열수 추출물에서 더 큰 효과를 보였다. 또한, 한국인에게 호발하는 위암세포(SNUT)과 대장암세포(SNU-C4)에 대한 이소플라본 및 대두 추출물의 항종양활성을 확인하였다.
- 대두 이소플라본이 가공제품이나 특수영양식품으로 가공될 때 문제가 될 수 있는 여러 조건별 안정성을 검토하기 위하여, 분말 상태의 대두 이소플라본 농축물(20〜40%), 99% 이소플라본표준품, 대두상태의 이소플라본을 대상으로 열, pH, 살균조건에 따른 안정성을 조사하였다. 대두 이소플라본 농축물은 pH 3 이하와 pH 8 이상의 pH에서 크게 감소하였으나 대두 상태의 이소플라본은 pH에 따른 이소플라본의 함량 감소가 없이 거의 일정하게 유지되었다. 99% 이소플라본 표준품은 산성 pH에서는 안정하나 알칼리에서는 대두 이소플라본 추출물보다 감소폭이 컸다.
- 대두 이소플라본 농축물은 pH 3 이하와 pH 8 이상의 pH에서 크게 감소하였으나 대두 상태의 이소플라본은 pH에 따른 이소플라본의 함량 감소가 없이 거의 일정하게 유지되었다. 99% 이소플라본 표준품은 산성 pH에서는 안정하나 알칼리에서는 대두 이소플라본 추출물보다 감소폭이 컸다. 한편 이소플라본의 열안정성은 우수하여 이소플라본은 식품의 일반적인 가공 조건에서 안정적인 것으로 나타났다.
- 99% 이소플라본 표준품은 산성 pH에서는 안정하나 알칼리에서는 대두 이소플라본 추출물보다 감소폭이 컸다. 한편 이소플라본의 열안정성은 우수하여 이소플라본은 식품의 일반적인 가공 조건에서 안정적인 것으로 나타났다.
- 추출수율은 100°C에서 열수추출물이 80°C에서 환류 추출한 에탄올과 메탄올 추출물보다 높았으나 이소플라본함량을 고려 한 이소플라본 추출수율은 80% 에탄올 추출물이 가장 높았다.
- 1에서 볼 수 있는 것과 같다. 대두 의용 매별 추출물과 이소플라본 표준품의 radical DPPH와의반응 기작은 거의 유사하였으며, 반응은 매우 느리게 점진적으로 진행되어 300분 이상이 되어야 반응이 종료되었다. 각 시료의 이소플라본 농도에 따른 DPPH 잔존률을 비교해 보면 메탄올 추출물의 ECa)은 이소플라본 표준품의 경우보다 더 낮았다.
- 대두 의용 매별 추출물과 이소플라본 표준품의 radical DPPH와의반응 기작은 거의 유사하였으며, 반응은 매우 느리게 점진적으로 진행되어 300분 이상이 되어야 반응이 종료되었다. 각 시료의 이소플라본 농도에 따른 DPPH 잔존률을 비교해 보면 메탄올 추출물의 ECa)은 이소플라본 표준품의 경우보다 더 낮았다. 이는 Williams 등(19)이 20가지 화합물의 DPPH 에 대한 kinetic behavior# 조사하여 분류한 유형 중 1〜6시간에 걸쳐 steady state에 이르는 “slow kinetic type"0!] 해당하는 것으로 분류된다.
- 2와 같다. 각용 매별 추출물의 아질산염 분해작용은 반응용액의 pH가 낮을수록 높게 나타나 각 시료 모두 pH 1.2에서 가장 높게 나타났으며 pH가 높아질수록 아질산염소거능이 현저하게 떨어졌다. 이는 발암성물질이 산성 조건에서 특히 인체나 동물의 위 내의 pH 조건에서 용이하게 생성되는 것으로 알려져 있는데 생체내 특히 위내에서 니트로사민의 생성억제에 크게 기여하리라 생각된다.
- 용매별 추출물에 따른 아질산염 소거능은 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수추출물의 순으로 나타났다. 메탄올 추출물의 아질산염 소거능은 pH 1.
- 추출물, 열수추출물의 순으로 나타났다. 메탄올 추출물의 아질산염 소거능은 pH 1.2에서는 95%이상의 효과로 우수한 분해능을 나타내었으며 추출물의 농도가 증가할수록 아질산염 소거능이 높았다.
- bradylkinin을 분해함으로서 혈압상승작용을 하는 효소로서 이 효소의 저 해능 결과는 Table 1과 같다. 대 두의 용매 추출물은 추출용매와 상관없이 ACE 저해작용을 나타내었으며 특히 열수 추출물에서 가장 높게 나타났다. 용매 추출물별 이소플라본 함량을 고려해 볼 때 이소플라본이 가장 많이 추출된 메탄올 추출물보다 열수 추출물에서 더 큰 효과를 보였으므로 이는 ACE 저해작용은 이소플라본이외 대두에 존재하는 다른 기능성 물질, 즉 Son(22)에 의해 보고된 것처럼 대두 펩타이드에 의한 효과로 추정된다.
- 대두의 용매별 추출물의 항산화능을 살펴보면 열수추출물의 항산화능이 가장 낮았으며 메탄올 추출물이 가장 우수하였다. 또한 에탄올과 메탄올 대두 추출물의 유효농도(EQaj)는 비타민 C와 BHT보다 낮았으며 실험한 항산화물질 중 genistein의 EQso가 가장 낮았는데 메탄올 대두 추출물의 항산화도 genistein과 거의 유사한 유효농도를 가지는 것으로 나타났다.
- 서울대학교 암연구센타로부터 한국인에게 호발하는 cancer cell line인 위암세포(SNUT)과 대장암세포(SNU-C4)를 분양받아 MTT법으로 항종양활성을 측정해 본 결과는 Table 2와 같다. Glycitein은 위 암과 대장암에 모두 활성을 나타냈으며 메탄올 대두 추출물도 두 종류의 암세포에 모두 높은 활성을 보였다. 반면 daidzein과 genistein은 위 암세포에 glycitein 보다 상대적으로 미약한 활성을 보였고 대장암세포에는 거의 활성을 가지지 못하였다.
- 4는 대두에서 주줄한 이소플라본 농축물을 여러 pH 에서 한 시간 열수 살균했을 때의 함량을 나타낸 것으로 pH 3 이하와 pH 8 이상의 극한 pH에서 함량이 크게 감소하였고 특히 알칼리조건에서 감소폭이 큰 것으로 나타났다. 각 pH 조건의 레토르트 처리구에서는 pH가 알칼리쪽으로 이동함에 따라 지속적으로 감소하다가 pH 9 이후에 급격하게 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 대두에서 추출한 이소플라본농축물은 열수처 리보다 레토르트 가공하는 경우 pH의 영 향도 덜 받아 이소플라본의 보존에 더 좋은 방법으로 나타났다.
- 각 pH 조건의 레토르트 처리구에서는 pH가 알칼리쪽으로 이동함에 따라 지속적으로 감소하다가 pH 9 이후에 급격하게 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 대두에서 추출한 이소플라본농축물은 열수처 리보다 레토르트 가공하는 경우 pH의 영 향도 덜 받아 이소플라본의 보존에 더 좋은 방법으로 나타났다.
- 5와 같다. pH에 따른 이소플라본의 함량 감소가 거의 없이 일정량을 유지하는 것으로 나타났다. 이는 대두에서 추출한 것과는 달리 대두 상태 그대로 이소플라본이 존재하고 있어 대두에 존재하는 다른 성분이 이소플라본의 안정성 에 관여하기 때문인 것으로 판단되었다.
- 분리 정제도를 더 높인 99% 이소플라본 표준품을 레토르트 살균하였을 때는 Fig. 6에서 보는 것과 같이 산성 조건에서는 거의 변화가 없으나 알칼리 조건에서는 함량 감소 폭이 대두에서 추출한 이소플라본보다 두드러졌다. 그러나 일반가공 주스류의 산도는 pH 3 이상이며 pH 3 이하와 pH 8 이상의 극한 pH에서 가공하게 되는 제품은 식품에서는 거의없으므로 이소플라본의 pH 및 살균안정성은 큰 문제가 되지 않는 것으로 판단되었다.
- 조사하였다. 스텐레스 팬에 이소플라본 표준품을 넣고 수분 무첨가구와 3배의 수분 첨가구를 제조하였으며 완전밀봉하고 질소기류하에서 분당 10°C의 속도로 가열한 결과 160°C까지의 가열에도 흡열이나 발열피크 등 상전이가 나타나지 않아 열분해에 안정함을 확인할 수 있었다(데이터 제시않음). 가열이 끝난 팬으로부터 이소플라본을 추출해 내고 HTLC로 피크전이 및 분해피크의 생성, 총 함량의 변화 등을 분석한 결과에서도 160°C까지의 가열에 안정함을 확인할 수 있었다.
- 스텐레스 팬에 이소플라본 표준품을 넣고 수분 무첨가구와 3배의 수분 첨가구를 제조하였으며 완전밀봉하고 질소기류하에서 분당 10°C의 속도로 가열한 결과 160°C까지의 가열에도 흡열이나 발열피크 등 상전이가 나타나지 않아 열분해에 안정함을 확인할 수 있었다(데이터 제시않음). 가열이 끝난 팬으로부터 이소플라본을 추출해 내고 HTLC로 피크전이 및 분해피크의 생성, 총 함량의 변화 등을 분석한 결과에서도 160°C까지의 가열에 안정함을 확인할 수 있었다.
- 실험을 수행하였다. 메탄올 추출 이소플라본의 free radi cal 소거능이 가장 우수하였고, 아질산 소거능은 메탄올, 에탄올과 열수추출물의 순으로 나타났다. ACE 저 해작용은 이소플라본이 가장 많이 추출된 메탄올 추출물보다 열수 추출물에서 더 큰 효과를 보였다.
- 3과 같다. 대두의 용매별 추출물의 항산화능을 살펴보면 열수추출물의 항산화능이 가장 낮았으며 메탄올 추출물이 가장 우수하였다. 또한 에탄올과 메탄올 대두 추출물의 유효농도(EQaj)는 비타민 C와 BHT보다 낮았으며 실험한 항산화물질 중 genistein의 EQso가 가장 낮았는데 메탄올 대두 추출물의 항산화도 genistein과 거의 유사한 유효농도를 가지는 것으로 나타났다.
후속연구
- 특히 이소플라본은 대두의 중요한 생리활성 성분으로 콩의 섭취 및 이용 형태 또한 가능한 한 이들 성분이 보존되도록 개선되어야 할 것이다. 그러나 아직 국내에서는 이소플라본의 생리활성 특성, 품종별 함량 분포, 콩 및 일부 콩 가공식품의 이소플라본 함량 분석 등 기초적 인 연구가 진행되었을 뿐이다(16, 17).
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