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문제 정의
- 비쑥은 한방에서는 거의 쓰지 않는 희귀한 풀이며, 인진쑥(사철쑥) 및 큰비쑥 등과 같은 종류의 쑥에 비해 연구가 거의 이루어지지 않았다. 이에 본 연구는 비쑥의 추출물 및 분획물로부터 항산화 활성과 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 NO의 생성억제 효과 및 iNOS, COX-2와 PGE2 생성 및 활성 억제를 조사하여 기능성을 탐색하고자 하였다.
제안 방법
- DPPH는 안정한 유리기로 cysteine, glutathione과 같은 황함유 아미노산과 ascorbic acid, aromatic amine (ρ-phenylenediamine, ρ-aminophenol) 등에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화 물질의 항산화능 측정에 많이 이용되고 있다.23) 비쑥의 조추출물과 각각의 용매분획물을 기존에 잘 알려져 있는 합성 항산화제인 ascorbic acid, butylated hydroxy anisole (BHA) 및 trolox를 대조군으로 하여 DPPH라디칼 소거법에 의한 항산화활성 실험을 실시하였다. 실험결과 DPPH 활성라디칼 소거활성으로 비쑥 추출물 및 분획물 시료의 항산화 활성을 측정한 결과 조추출물과 ethylacetate 및 buthanol 분획물에서 다른 용매 분획물에 비해 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈으며, 그 중 ethylacetate 분획물에서 매우 높은 라디칼 소거 활성을 보여주었다.
- 대조군으로는 ascorbic acid, butylated hydroxy anisole (BHA) 및 trolox를 사용하였다. DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC50)로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
- Nitric oxide 생성억제 효과 - 활성산소 중 하나이며, 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 nitric oxide (NO) 생성에 대한 비쑥 추출물과 분획물의 효과를 알아보았다. 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다.
- Prostaglandin E2 (PGE2) 생성에 미치는 영향 - Macrophage RAW 264.7 세포에서 염증성인자인 PGE2 억제 효과를 ELISA kit를 이용하여 정량하였다. 그 결과 PGE2 생성억제는 dichloromethan 분획물에서 높은 억제 효과를 나타내었으며, 비쑥의 dichloromethan 분획물이 LPS에 의해 발현되는 PGE2 억제에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다 (Fig.
- RAW 264.7 세포에 LPS (1 μg/ml)를 사용하여 iNOS의 생성을 유도한 후 비쑥 추출물과 분획물을 처리하여 단백질 생성에 대한 억제 정도를 immunoblotting을 통해 알아보았다. 그 결과 단백질 수준에서도 hexane, dichloromethane 및 ethylacetate 분획물이 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제효과를 나타내었다 (Fig.
- 5 mM NBT를 첨가하여 반응 시켰다. Xanthine oxidase 억제 및 superoxide 소거 활성은 각각 생성된 uric acid와 superoxide의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC50)로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
- 1% Tween 20) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS와 COX-2의 발현 양을 측정하기 위해 1차 항체로서 anti-mouse iNOS (Calbiochem)와 anti-goat COX-2 (BD biosciences)를 TTBS 용액에서 희석 (1:1000)하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG와 anti-goat IgG (Amersham Co.
- LDH (lactate dehydrogenase) 활성을 non-radioactive cytotoxicity assay kit (promega, USA)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심분리하여 얻은 배양 배지 50 μl와 reconstituted substrate mix를 50 μl를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 μl의 stop solution을 넣어 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
- 5Cl05 cells/ml)를 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate 에 접종하고, 시험물질과 LPS (1 μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 μl와 Griess시약 [1% (w/v) sulfani-lamide, 0.
- 5Cl05 cells/ml)를 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate 에 접종하고, 시험물질과 LPS (1 μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 μl와 Griess시약 [1% (w/v) sulfani-lamide, 0.
대상 데이터
- 7 세포를 KCLB (Korean Cell Line Bank)로부터 분양 받아 100 units/ml penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3~4일에 한번씩 계대배양을 시행하였다. Lipopolysaccharide (LPS, E. coli serotype 0111:B4)를 Sigma로부터 구입하여 사용하였다.
- 그리고, 용매 1 ml에 분말로 추출된 시료 1 mg을 섞은 후 충분히 녹이고, 준비된 DPPH 450 μl에 시료용액 50 μl를 넣어 섞은 후 실온에서 10분간 방치하였다가 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 ascorbic acid, butylated hydroxy anisole (BHA) 및 trolox를 사용하였다. DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC50)로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
- 세포 및 시약 - Murine macrophage cell line RAW 264.7 세포를 KCLB (Korean Cell Line Bank)로부터 분양 받아 100 units/ml penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3~4일에 한번씩 계대배양을 시행하였다. Lipopolysaccharide (LPS, E.
- 시료의 추출 - 제주도 해안가에 자생하고 있는 비쑥을 5 월에 채집하여 동결건조 한 다음 마쇄기로 갈아 미세말로 하였다. 미세말 시료 (50g)를 80% ethanol (EtOH)로 3회 교반 추출 후 여과하여 감압 농축하여 용매를 증발시켰다.
- 미세말 시료 (50g)를 80% ethanol (EtOH)로 3회 교반 추출 후 여과하여 감압 농축하여 용매를 증발시켰다. 여기에서 얻은 ethanol 추출물 (10g)을 계통적 추출 방법에 의하여 hexane 분획 (0.9006 g), dichloromethane (CH2C12) 분획 (1.3462 g), ethylacetate (EtOAc) 분획 (1.3929 g), butanol (n-BuOH) 분획 (2.4916 g) 및 water 분획 (4.8026 g)을 얻어 실험시료로 사용하였다.
이론/모형
- NO production was determined by ELISA method. Cell cytotoxicity was determined using LDH method. The data represent the mean S.
- DPPH radical 소거활성에 의한 항산화활성 검색 - 항산화활성은 1,1-diphenyl-2-piciylhydrazyl (DPPH)을 이용하여 시료의 라디칼 소거효과 (radical scavenging effect)를 측정하는 Blois법을 활용 하였다.20) DPPH 약 2 mg을 ethanol 15ml에 녹여 DPPH용액을 제조하였다.
- scoparia (50 μg/ml). NO production was determined by ELISA method. Cell cytotoxicity was determined using LDH method.
- scoparia for 24 hr. Supernatants were then collected after 24 hr and PGE2 concentration from supernatants was determined by ELISA method. The data represent the mean S.
- scoparia (50 μg/ml). The iNOS and COX-2 protein level was determined using immunoblotting method.
- Xanthine oxidase 억제 및 Superoxide 소거 활성 검색 - Xanthine/xanthine oxidase에 의한 uric acid 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고 superoxide의 양은 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원방법에 의해 측정하였다.21,22) 반응액은 각 시료의 여러 농도와 0.
성능/효과
- 게다가 xanthine oxidase에 의해 생성된 산소유리기는 세포의 손상을 초래한다.23) 비쑥 추출물 및 분획물 시료의 농도별 xanthine oxidase 활성 억제에 대한 결과는 dichloromethane 분획물이 높은 xanthine oxidase 활성 억제을 나타냈으며 ethylacetate 분획물에서도 비교적 높은 활성억제률을 보여주었다. Xanthine oxidase 활성 억제가 높은 dichloromethane 분획물의 IC50 값은 93.
- 3) 염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 histamine, serotonine, bradykinin, prostaglandins, hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE), leukotriene과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다.4) 염증 반응 동안 수반되는 혈관 확장, 세포막 유동성 증가, 부종 등의 현상은 세포외로 유리된 화학적 매개 인자에 의해 더욱 증진되며 염증 매개 인자의 자극에 의해 세포 간극 활성 산소종의 생성도 급격히 증가된다. 염증반응에 관여하는 세포종으로서 대식세포, 임파구, polymorphomuclear leukocyte (PMN), 단구, 비만세포, 혈소판, 섬유아세포 등이 있으며 염증 매개 인자에는 염증 반응으로 인한 자극을 통하여 유리되는 물질과, 생성되는 물질로 크게 나뉘어 지는데 전자는 비만 세포에서 분비되는 혈관 확장성 아민류로서 히스타민, 세로토닌, 후자는 비만세포와 PMN에서 생성되는 arachidonic acid 대사체, 단구에서의 사이토카인, 대식세포와 호중구에서 생성되는 활성 산소종 등이 있다.
- 염증반응에 관여하는 세포종으로서 대식세포, 임파구, polymorphomuclear leukocyte (PMN), 단구, 비만세포, 혈소판, 섬유아세포 등이 있으며 염증 매개 인자에는 염증 반응으로 인한 자극을 통하여 유리되는 물질과, 생성되는 물질로 크게 나뉘어 지는데 전자는 비만 세포에서 분비되는 혈관 확장성 아민류로서 히스타민, 세로토닌, 후자는 비만세포와 PMN에서 생성되는 arachidonic acid 대사체, 단구에서의 사이토카인, 대식세포와 호중구에서 생성되는 활성 산소종 등이 있다.5) 이러한 활성 산소종들은 생체내에서 많은 세포 구성 요소와 반응하여 광과민성 피부질환, 급성 용혈성 빈혈, 류마티성 관절염, 다발성 경화증, 파킨슨 질환, 노인성 치매 그리고 blood's syndrome을 비롯하여 변이, 노화, 발암 등과 같은 심각한 손상을 일으킨다.6)
- 실험결과 DPPH 활성라디칼 소거활성으로 비쑥 추출물 및 분획물 시료의 항산화 활성을 측정한 결과 조추출물과 ethylacetate 및 buthanol 분획물에서 다른 용매 분획물에 비해 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈으며, 그 중 ethylacetate 분획물에서 매우 높은 라디칼 소거 활성을 보여주었다. DPPH의 활성라디칼 소거활성이 매우 높게 나타난 ethylacetate 분획물의 IC50 값은 9.27 μg/ml로 나타났다 (Table I).
- 파괴될 때 혈액 중으로 흘러나와 혈중 LDH가 상승한다. RAW 264.7 세포 (1.5Xl05 cells/ml)에 시험 약물과 LPS (1 μg/ml)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후, LDH assay 방법을 이용하여 세포 독성을 확인한 결과, hexane 분획물에서 독성이 나타났으며 다른 분획물에서는 거의 독성이 나타나지 않았다 (Fig. 1).
- 17,27) 따라서 COX-2에 의한 prostagladin의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨진다. RAW 264.7 세포에 LPS (1 μg/ml)로 자극을 주고 비쑥 추출물과 분획물을 처리하여 확인한 결과, hexane과 dichloromethane 분획물에서 강한 억제 효과를 보였다 (Fig. 2).
- RAW 264.7 세포에 LPS로 자극을 주고 비쑥 추출물을 처리 하여 확인해 본 결과, hexane, dichloromethane 및 ethylacetate 분획물에서 NO와 iNOS 생성 억제 효과가 나타났으며, hexane과 dichloromethane 분획물에서 COX-2와 PGE2 생성 억제 효과가 나타났다. 하지만 hexane 분획물에서는 세포독성이 나타난 것으로 보아 세포독성에 의해 저해 활성이 나타난 것으로 추정된다.
- 24) 따라서 산소 유리기의 자유기를 소거할 수 있는 물질 또한 산화적 손상의 예방에 유용할 것으로 사료된다. Superoxide radical 소거활성에 대한 결과는 ethylacetate과 buthanol 분획물에서 높은 superoxide radical 소거활성을 나타냈으며 hexane 분획물에서도 비교적 높은 superoxide radical 소거활성을 보여주었다. Superoxide radical 소거활성이 높게 나타난 ethylacetate 분획물의 IC50 값은 16.
- 23) 비쑥 추출물 및 분획물 시료의 농도별 xanthine oxidase 활성 억제에 대한 결과는 dichloromethane 분획물이 높은 xanthine oxidase 활성 억제을 나타냈으며 ethylacetate 분획물에서도 비교적 높은 활성억제률을 보여주었다. Xanthine oxidase 활성 억제가 높은 dichloromethane 분획물의 IC50 값은 93.01 μg/mZ로 나타났다 (Table I).
- 7 세포에서 염증성인자인 PGE2 억제 효과를 ELISA kit를 이용하여 정량하였다. 그 결과 PGE2 생성억제는 dichloromethan 분획물에서 높은 억제 효과를 나타내었으며, 비쑥의 dichloromethan 분획물이 LPS에 의해 발현되는 PGE2 억제에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 이러한 결과는 COX-2의 생성 억제가 PGE2 생성 억제를 통한 것으로 여겨진다.
- 7 세포에 LPS (1 μg/ml)를 사용하여 iNOS의 생성을 유도한 후 비쑥 추출물과 분획물을 처리하여 단백질 생성에 대한 억제 정도를 immunoblotting을 통해 알아보았다. 그 결과 단백질 수준에서도 hexane, dichloromethane 및 ethylacetate 분획물이 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제효과를 나타내었다 (Fig. 2). 이러한 결과는 NO의 생성 억제가 iNOS 발현 억제를 통한 것으로 여겨진다.
- 비쑥 추출물을 가지고 DPPH radical 소거활성에 의한 항산화활성 검색결과 EtOH extract과 ethylacetate, buthanol 분획물에서 높은 radical 소거 활성을 나타냈으며, xanthine oxidase 억제효과는 dichloromethane과 ethylacetate 분획물에서, superoxide 소거 활성은 hexane, ethylacetate 및 buthanol분획물에서 각각 나타났다.
- 23) 비쑥의 조추출물과 각각의 용매분획물을 기존에 잘 알려져 있는 합성 항산화제인 ascorbic acid, butylated hydroxy anisole (BHA) 및 trolox를 대조군으로 하여 DPPH라디칼 소거법에 의한 항산화활성 실험을 실시하였다. 실험결과 DPPH 활성라디칼 소거활성으로 비쑥 추출물 및 분획물 시료의 항산화 활성을 측정한 결과 조추출물과 ethylacetate 및 buthanol 분획물에서 다른 용매 분획물에 비해 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈으며, 그 중 ethylacetate 분획물에서 매우 높은 라디칼 소거 활성을 보여주었다. DPPH의 활성라디칼 소거활성이 매우 높게 나타난 ethylacetate 분획물의 IC50 값은 9.
- 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 실험결과hexane, dichloromethane 및 ethylacetate 분획물에서 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 강력한 NO 생성 억제효과를 관찰할 수 있었다 (Fig. 1).
후속연구
- Xanthine oxidase는 hypoxanthine을 산화시켜 최종적으로 uric acid와산소를 생성하며 산소유리기와 수소과산화기가 이 산소로부터 발생하게 된다. Uric acid의 축적은 고요산혈증과 통풍을 유발시키며 uric acid 형성의 억제제가 이들 질환을 위한 치료 물질로서 유용할 것이다. 게다가 xanthine oxidase에 의해 생성된 산소유리기는 세포의 손상을 초래한다.
- 본 실험결과를 요약하면, 비쑥 추출물과 분획물에서 높은 항산화 효과 및 NO, iNOS, COX-2 및 PGE2의 생성억제 효과가 나타났으며, 이러한 결과는 비쑥에서 유효성분 추출을 통한 항염증 물질의 연구 또는 예방하거나 치료할 수 있는 염증 억제 성분의 분리 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 것이라 사료된다. 또한 비쑥 추출물로부터 염증 억제 성분을 도출하고자 활성분획인dichloromethane과 ethanol 분획물에 대하여 분리를 진행중에 있다.
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