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문제 정의
- 따라서 본 연구는 냉온처리기술 또는 환경친화적 기술로 주목받고 있는 방사선조사기 술(RT: Radiation Technology)을 이용하여 환경오염을 최소화하고, 추출수율의 증대 및 기능성을 개선하고자 하였다.
제안 방법
- 01 g을 평 량하고 6 N-HC1 4 mL를 가한 후, 110℃상에서 12~24시 간동안 가수분해시켜 Jamall의 빙-법(11)으로 hydroxyproline 함량을 측정하였다. Hydroxyproline(mg/mL)x 100X7.5(계수)식 으로 산출된 콜라겐 함량은 탈지 된 방사선조사 돈피의 단백질 함량의 백분율로 하여 콜라겐 함량을 산출하였다.
- SDS-PAGE에서 보여준 콜라겐의 저분자화를 확인하기 위하여 수용성 단백질의 용해도를 측정하였다(Fig. 3). 수용성 단백질의 용해도는 대조구(0 kGy)에서 2.
- 6). 또한 300 kGy로 방사선을 조사한 돈피 가수분해물의 elution volumee 19.82, 23.56, 25.79, 30 mL로 측정 되었다. 검 량선에 의거 하여 분자량을 측정한 결과 분자량 9, 000, 2100, 860, 170 Da의 분획 물을 확인하였다(Fig.
- 방사선조사 선량별 용해도와 효소 반응시간별 용해도 변화를 측정하기 위해 탈지된 방사선조사 시료 0.2 g과 전체중량의 1%가 되도록 papain을 첨가한 시료에 0.1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl(pH 7.0)용액 7.8 mL를 첨가하여 25℃에서 1 ~4시간 교반한 후 4℃에서 20, 000xg의 속도로 30분간 원심분리하였다. 상등액에 포함되어 있는 수용성 단백질 함량을 Biuret법으로 측정 하고 총 단백질 함량에 대한 수용성 단백질의 백분율로 표시하여 단백질의 용해도로 나타내었다.
- 이용하여 측정하였다. 방사선조사 시료 10 mg을 0.1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl(pH 7.0)용액 10 mL에 용해 시킨 것과 전체 중량의 1%가 되도록 papain을 첨가한 시료를 0.1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl(pH 7.0)용액 10 mL에 용해 하여 25℃ 항온조에서 1~4시간 반응시켜 측정하였다. 탁도는 점도 측정법과 동일하게 시료를 조제하여 spectrophoto-meter(JASCO UVIDEC-610, Japan)를 이용하여 340 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 방사선조사를 이용하여 돈피 유래 올리고펩타이드를 제조하고자 하였다. 생박돈피를 chopper를 이용하여 조분쇄한후 -20℃ 아세톤으로 탈지 하였고, 7 -ray irradiator-f- 이용하여 0, 20, 40, 60, 100, 150, 200, 250, 300 kGy의 총 흡수선 량을 얻도록 탈지돈피 에 방사선조사를 하였다.
- 방사선조사와 효소처리 를 병 행한 시료를 AKTAexplorer chromatography(AMERSHAM BIOSCIENCES, UK) 에 장착한 superdex 200 10/300 GL로 분획 하여 분자량을 측정 하였다. 효소 가수분해 한 300 kGy 시료를 0.
- 하였다. 생박돈피를 chopper를 이용하여 조분쇄한후 -20℃ 아세톤으로 탈지 하였고, 7 -ray irradiator-f- 이용하여 0, 20, 40, 60, 100, 150, 200, 250, 300 kGy의 총 흡수선 량을 얻도록 탈지돈피 에 방사선조사를 하였다. 탈지돈피 의 pH 는 150 kGy이상에서 소폭 증가하였고, SDS-PAGE에서 방사선 조사선량이 증가할수록 분자량 24 kDa이하의 저분자 물질이 점차 증가하였고, 효소처리를 병행했을 때 a- 및 나선구조의 100 kDa 및 200 kDa의 콜라겐 밴드가 소실되는 반면 에 24 kDa의 밴드가 형 성 되고 있으며, 방사선 조사 선량이 증가할수록 10% SDS-polyacrylamide gel 하단에 콜라겐 분해물질로 예상되는 저분자 물질이 축적되는 현상을 보였다.
- 280 nm에서 용출한 분획물을 fraction collector로 2 mL씩 분취하였다. 측정 을 위한 marker로 Blue dextran(2000 kDa) Albumin (67 kDa), Ovalbumin(43 kDa), Ribonuclease A(13.7 kDa)를 사용하여 분자량 검량선을 작성하고 시료의 평균분자량을 측정하였다.
- 0)용액 10 mL에 용해 하여 25℃ 항온조에서 1~4시간 반응시켜 측정하였다. 탁도는 점도 측정법과 동일하게 시료를 조제하여 spectrophoto-meter(JASCO UVIDEC-610, Japan)를 이용하여 340 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 탈지돈피를 그린피아기술(주)의 7-ray irradiator(JS-8900 automatic pallet irradiator, MDS Nordion Co, Canada) 를 이용하여 방사선조사를 실시 하였으며 , 1 kGy/h의 조사 선량으로 0, 20, 40, 60, 100, 150, 200, 250, 300 kGy의 총 흡수 선량을 얻도록 조사하였다. 흡수선량은 PMMA acryl dosim-eter를 이용하여 확인하였다.
- 8 mL에 첨가하여 100℃에서 2분간 가열한 후 실온에서 24시간 교반하여 가용화시 켰다, 20, 000 xg의 속도로 30분간 원심분리 후 상등액을 sample buffer와 1:10 비율로 혼합하여 10%의 polyacrylamide gel을 이용하여 Laemmli의 방법 (12)에 따라 SDS-PAGE1- 수행하였다. 한편 콜라겐 펩타이드의 조성 변화를 비교하기 위해 방사선을 조사한 탈지 시료 0.2 g에 전체 중량의 1%가 되도록 papain을 첨가한 후 0.1 M NaCl, 20 mM Tris-HCKpH 7, 0) buffer 7.8 mL에 용해한 후 25℃에서 1시간에서 4시간 반응시킨 후 원심분리한 다음 동일한 조건에서 SDS-PAGE를 수행하였다.
- 이결과는 비조사구와 비교해 100 kGy에서 약 60%의 단백질이 분해되어 조사선량의 증가와 더불어 pep-tide결합이 절단됨으로 단백질의 저분자화가 일어난다는 Yook 등(13)의 결과와 거의 일치하였다. 한편, 콜라겐 펩타이 드를 보다 효율적으로 제조하기 위해 방사선을 조사한 시료에 전체 중량의 1% papain을 첨 가하였을 때의 콜라겐 조성 변화를 검 토하였다. Fig.
- 얻도록 조사하였다. 흡수선량은 PMMA acryl dosim-eter를 이용하여 확인하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 돈피 는 가락동 농수산물 시 장에서 구입하여 피하지방을 제거한 등 부위를 사용하였다. 방사선 조사를 실시하기 전 원피를 2.
이론/모형
- 방사선 조사 선량 및 효소처리를 병 행한 돈피 단백질의 변화를 측정하기 위하여 SDS-PAGE1- 이용하였다. Fig.
- 8 mL를 첨가하여 25℃에서 1 ~4시간 교반한 후 4℃에서 20, 000xg의 속도로 30분간 원심분리하였다. 상등액에 포함되어 있는 수용성 단백질 함량을 Biuret법으로 측정 하고 총 단백질 함량에 대한 수용성 단백질의 백분율로 표시하여 단백질의 용해도로 나타내었다.
- 9 g에 증류수 100 mL를첨 가하여 20분간 교반한 다음, pH meter를 이용하여 측정 하였다. 콜라겐 함량은 방사선 조사한 탈지 시료 0.01 g을 평 량하고 6 N-HC1 4 mL를 가한 후, 110℃상에서 12~24시 간동안 가수분해시켜 Jamall의 빙-법(11)으로 hydroxyproline 함량을 측정하였다. Hydroxyproline(mg/mL)x 100X7.
- 탈지 된 방사선조사 시료 0.2 g을 정확히 취 하여 8 M urea, 2% 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 20 mM Tris-HCKpH 7.0) 용액 7.8 mL에 첨가하여 100℃에서 2분간 가열한 후 실온에서 24시간 교반하여 가용화시 켰다, 20, 000 xg의 속도로 30분간 원심분리 후 상등액을 sample buffer와 1:10 비율로 혼합하여 10%의 polyacrylamide gel을 이용하여 Laemmli의 방법 (12)에 따라 SDS-PAGE1- 수행하였다. 한편 콜라겐 펩타이드의 조성 변화를 비교하기 위해 방사선을 조사한 탈지 시료 0.
성능/효과
- 방사선조사선량에 따른 수용성 단백질의 용해도, 점도 및 탁도를 측정한 결과 방사선조사선량이 증가할수록 용해도가 증가하고 점도 및 탁도가 감소하는 현상을 보였고, 방사선을 조사한 돈피 에 papain 1%를 첨가하여 수용성 단백질을 추출한 경우 비 효소처리구에 비하여 점도가 낮아지는 현상을 보여 돈피 단백질이 papain에 일정 수준 가수분해되고 있음을 알 수 있었다. 300 kGy로 방사선을 조사한 돈피가수분해 물을 gel permeation chromatography한 결과 분자량 9, 000, 2100, 860, 170 Da의 분획물을 확인하였다. 이상의 결과는 환경오염 문제를 최소화하고 제조공정을 단순화하여 경제성 있는 콜라겐 유래 기능성 올리고펩타이드를 제조함에 있어 방사선조사기술(RT: Radiation Technology)0] 고분자물질의 저 분자화에 직접 이용될 수 있는 기 술로 실용화되 어 환경오염을 최소화할 수 있는 대체기술로 가능할 것으로 생각된다.
- 측정하기 위하여 SDS-PAGE1- 이용하였다. Fig. 1은 방사선 조사 선량에 따른 돈피 단백질의 SDS-PAGE로써 방사선 조사를 하지 않은 대조구에서는 분자량 100~300 kDa 크기 의 a -chains, P-components 또는 y-components의 콜라겐 사슬이 대부분인 것으로 나타났으나, 40 kGy 이상의 조사 선량에서는 100 kDa 또는 200 kDa 부근의 콜라겐 분자가 점차 소실되는 모양을 보였으며 조사선량이 높아질 수록분자량 24 kDa 이 하의 저 분자 물질이 점 차적으로 증가하는 현상을 보였다. 이러한 결과는 고선량의 방사선조사가 콜라젠과 같은 고분자 단백질의 저 분자화를 촉진하는 것을 제시하고 있다.
- 한편, 콜라겐 펩타이 드를 보다 효율적으로 제조하기 위해 방사선을 조사한 시료에 전체 중량의 1% papain을 첨 가하였을 때의 콜라겐 조성 변화를 검 토하였다. Fig. 2에 나타낸 바와 같이 방사선 조사한 돈피 단백질을 효소처리를 병행했을 때 a-및 6- 나선구조의 100 kDa 및 200 kDa의 콜라겐 밴드가 소실 되는 반면에 24kDa의 밴드가 형성되고 있으며, 방사선조사선량이 증가할수록 10% SDS-polyacrylamide gel 하단에 콜라겐 분해물질로 예상되는 저분자 물질이 축적 되는 현상을 나타냈다. 방사선조사가 난백단백질의 peptide fragment를 생성한다는 Kume(14)의 보고와 방사선에 의한 단백질 분해반응으로 탈아미 노, 탈탄산, SH기 의 산화, S-S결합의 분해, 아미노산 잔기의 수식, peptide결합의 분해 등(15)의 결과를 고려 해볼 때 방사선조사가 단시간에 콜라겐이 papain에 쉽게 가수분해될 수 있는 구조로 변형 시키고 있음을 확인할 수 있었으며, 방사선조사가 콜라겐 펩타이드 제조에 효과가 있다는 것으로 생각되었다.
- 4에 나타냈다. Ostwald 점도계를 이용할 경우 수용성 단백질의 점도측정은 60 kGy 이상에서 가능하였고, 조사선량이 증가할수록 수용성 단백질의 점도가 낮아지는 현상을 보였다. Choi 등(16)이 보고한 방사선조사가 키토산 다당체의 1-4 glycosidic bond를 분열시켜 저분자화시켜 점도가 감소한다고 보고하고 있다.
- 79, 30 mL로 측정 되었다. 검 량선에 의거 하여 분자량을 측정한 결과 분자량 9, 000, 2100, 860, 170 Da의 분획 물을 확인하였다(Fig. 7).
- 방사선조사선량 60 kGy까지는 돈피의 pH가 감소하는 경향을 보였고, 이후 150 kGy 이상에서는 증가하는 경향을 보여 방사선 조사에 의한 성분조성 변화가 예측되었다. 반면, 콜라겐 함량은 방사선 조사 선량에 따라 89~93%를 보여주어 돈피 중에 함유된 단백질의 대부분이 콜라겐 성분인 것으로 나타났다.
- 이러한 결과는 SDS-PAGE에서 보여준 저분자화를 뒷받침하고 있다. 방사선을 조사한 돈피 에 papain 1%를 첨가하였을 때의 수용성 성분의 용해도는 Fig. 3에 나타난 바와 같이 시간별로 papain을 처리한 대조구(0 kGy)는 55%였으나 300 kGy로 방사선만 조사한 시료에서 65.3%로 나타나 방사선조사만으로도 효소 처리를 대체할 수 있을 것으로 생각되어진다. 한편 방사선 조사 선량이 높아질수록 용해도가 증가하여 300 kGy에서는 90% 이상의 용해도를 보여 산, 알칼리 처리를 이용한콜라겐 제조를 대체할 수 있을 것으로 생각된다.
- 방사선조사선량 60 kGy까지는 돈피의 pH가 감소하는 경향을 보였고, 이후 150 kGy 이상에서는 증가하는 경향을 보여 방사선 조사에 의한 성분조성 변화가 예측되었다. 반면, 콜라겐 함량은 방사선 조사 선량에 따라 89~93%를 보여주어 돈피 중에 함유된 단백질의 대부분이 콜라겐 성분인 것으로 나타났다.
- 탈지돈피 의 pH 는 150 kGy이상에서 소폭 증가하였고, SDS-PAGE에서 방사선 조사선량이 증가할수록 분자량 24 kDa이하의 저분자 물질이 점차 증가하였고, 효소처리를 병행했을 때 a- 및 나선구조의 100 kDa 및 200 kDa의 콜라겐 밴드가 소실되는 반면 에 24 kDa의 밴드가 형 성 되고 있으며, 방사선 조사 선량이 증가할수록 10% SDS-polyacrylamide gel 하단에 콜라겐 분해물질로 예상되는 저분자 물질이 축적되는 현상을 보였다. 방사선조사선량에 따른 수용성 단백질의 용해도, 점도 및 탁도를 측정한 결과 방사선조사선량이 증가할수록 용해도가 증가하고 점도 및 탁도가 감소하는 현상을 보였고, 방사선을 조사한 돈피 에 papain 1%를 첨가하여 수용성 단백질을 추출한 경우 비 효소처리구에 비하여 점도가 낮아지는 현상을 보여 돈피 단백질이 papain에 일정 수준 가수분해되고 있음을 알 수 있었다. 300 kGy로 방사선을 조사한 돈피가수분해 물을 gel permeation chromatography한 결과 분자량 9, 000, 2100, 860, 170 Da의 분획물을 확인하였다.
- 한편 방사선을 조사한 돈피에 papain 1%를 첨가하여 수용성 단백질을 추출한 경우 비 효소처 리 구에 비하여 점도가 낮아지는 현상을 보여 돈피 단백질이 papain에 일정수준 가수분해되고 있음을 알 수 있었다. 방사선조사선량이 증가할수록 점도가 급격히 감소하는 현상을 보였으며, 150 kGy 이상에서는 일정수준의 점도를 유지하고 있었다. 이러한 현상은 고선량의 방사선조사가 콜라겐의 구조를 절단시켜 papain의 소화력에 영향을 주고, 200 kGy 이상의 고선량에서는 콜라겐의 구조를 완전히 변형시켜 저분자화시킬 수 있음을 추론할 수 있었다.
- 이상의 결과에서 고선량의 방사선조사에 의하여 돈피 단백질 특히, 콜라겐의 구조변화가 일어나 저분자화가 이루어지고 있음을 확인할 수 있었고, , molecular weight calibration standard로 gel permeation chromatography한 결과 albumin, ovalbumin, ribonuclease A의 elution volumee 각각 14.91, 15.58, 18.8 mL] 었다(Fig. 6). 또한 300 kGy로 방사선을 조사한 돈피 가수분해물의 elution volumee 19.
- 생박돈피를 chopper를 이용하여 조분쇄한후 -20℃ 아세톤으로 탈지 하였고, 7 -ray irradiator-f- 이용하여 0, 20, 40, 60, 100, 150, 200, 250, 300 kGy의 총 흡수선 량을 얻도록 탈지돈피 에 방사선조사를 하였다. 탈지돈피 의 pH 는 150 kGy이상에서 소폭 증가하였고, SDS-PAGE에서 방사선 조사선량이 증가할수록 분자량 24 kDa이하의 저분자 물질이 점차 증가하였고, 효소처리를 병행했을 때 a- 및 나선구조의 100 kDa 및 200 kDa의 콜라겐 밴드가 소실되는 반면 에 24 kDa의 밴드가 형 성 되고 있으며, 방사선 조사 선량이 증가할수록 10% SDS-polyacrylamide gel 하단에 콜라겐 분해물질로 예상되는 저분자 물질이 축적되는 현상을 보였다. 방사선조사선량에 따른 수용성 단백질의 용해도, 점도 및 탁도를 측정한 결과 방사선조사선량이 증가할수록 용해도가 증가하고 점도 및 탁도가 감소하는 현상을 보였고, 방사선을 조사한 돈피 에 papain 1%를 첨가하여 수용성 단백질을 추출한 경우 비 효소처리구에 비하여 점도가 낮아지는 현상을 보여 돈피 단백질이 papain에 일정 수준 가수분해되고 있음을 알 수 있었다.
- Choi 등(16)이 보고한 방사선조사가 키토산 다당체의 1-4 glycosidic bond를 분열시켜 저분자화시켜 점도가 감소한다고 보고하고 있다. 한편 방사선을 조사한 돈피에 papain 1%를 첨가하여 수용성 단백질을 추출한 경우 비 효소처 리 구에 비하여 점도가 낮아지는 현상을 보여 돈피 단백질이 papain에 일정수준 가수분해되고 있음을 알 수 있었다. 방사선조사선량이 증가할수록 점도가 급격히 감소하는 현상을 보였으며, 150 kGy 이상에서는 일정수준의 점도를 유지하고 있었다.
후속연구
- 한편 방사선 조사 선량이 높아질수록 용해도가 증가하여 300 kGy에서는 90% 이상의 용해도를 보여 산, 알칼리 처리를 이용한콜라겐 제조를 대체할 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 전반적으로 100 kGy 이내에서는 용해도 증가율이 높은 것으로 나타났고, 100 kGy 이상에는 용해도 증가율이 낮은 것으로 나타나 향후 방사선조사를 이용한 콜라겐 펩 타이 드 제조 시 경제성을 고려한 방사선조사선량의 선정이 필요한 것으로 나타났다.
- 300 kGy로 방사선을 조사한 돈피가수분해 물을 gel permeation chromatography한 결과 분자량 9, 000, 2100, 860, 170 Da의 분획물을 확인하였다. 이상의 결과는 환경오염 문제를 최소화하고 제조공정을 단순화하여 경제성 있는 콜라겐 유래 기능성 올리고펩타이드를 제조함에 있어 방사선조사기술(RT: Radiation Technology)0] 고분자물질의 저 분자화에 직접 이용될 수 있는 기 술로 실용화되 어 환경오염을 최소화할 수 있는 대체기술로 가능할 것으로 생각된다.
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