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문제 정의
- 또한 김12)은 고삼이 당뇨에 미치는 연구에서, 고삼이 혈당강하 insulin 함량의 증가에 미치는 영향이 있어, 당뇨병의 치료에 효과가 있다고 보고하였으며, 또한 김13)은 lavandulyl flavanones 성분인 (2S)-2'-methoxykurarinone, sophoraflavanone G, leachianone A 및 (-)-kurarinone 등이 항말라리아 활성을 가진다는 보고하였으며, 송 등14)은 고삼으로부터의 추출물이나 추출성분이 여러 효소나 세균 등에 작용하여 생리학적인 작용에 영향을 준다고 보고하는 등, 고삼은 매우 다양한 약리효과를 가짐으로서, 고삼 추출물을 통한 많은 질병치료제의 개발이 시도되고 있는 실정이다. 이에 본 연구는 고삼을 메탄올로 추출하여 flavanone을 분리한 후, IR 및 1D/2D-NMR 등의 분광학적인 방법으로 분자구조를 동정하여, leachianone A(LA, 1)와 sophoraflavanone G(SFG, 2)로 규명하였으며, 이들 flavanone에 대한 항균효과를 얻었기에 보고합니다.
제안 방법
- Recycling prep-HPLC(Model 908)는 SUNIL JAI(JALGEL~GS310)의 methacryEc acid polymei가 충진된 column(40x500mm)을 사용하였으며, IR-Spectrophotometei는 Bomem사의 model MB 104 FT/IR 을 사용하였다. NMR Spectrophotometer(KBSI)^ JEOL-ECP 600을 사용하였으며 , Acetone-d6를 용매로 사용하였고, 내부 표준물질로 사용한 tetramethylsilane(TMS)를 기준으로 8(ppm) 으로 나타내었으며, E(600MHz)와 13C-NMR(125MHz), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), COSY(Correlated Spectroscopy), HMQC(Heteronuclear Multiple Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Connectivity)의 자료를 분석하였다. Ampicillin(종근당)와 용매는 HPLC용 grade를 사용하였다.
- Recycling prep-HPLC model LC-908을 이용하여, 고삼의 메탄올 추출물의 소분획을 자외선 검출기를 사용하여 , 크로마토그람에서 이동상으로 아세톤을 사용하여, leachianome A(l)보다극성이 큰 sophoraflavonone G(2)가 retention tim운(52.7분)에서 분리되었으며, leachianone A(1)의 retention time은 57.4분으로 분리능이 측정되었다. 화합물 1의 IR spectmm은 보면, 3341 cm-1에서 0H기, 1701 cm-1에서 α,β-unsaturated ketone기를 1651, 1560, 1508 cm-1에서 aromatic C=C의 흡수대가 각각 관측되어, flavonoid 화합물임을 추정하였다.
- )를 사용하였으며, 항진균력의 대조물질으로는 ketoconazole을 사용하였다. 각 배양이 끝나면 집락형성 여부를 관찰하여, 성장이 인정되지 않는 가장 낮은 농도를 최소억제농도(Minimal inhibitory concentration, MIC)17)로 판정하였다.
- 이 추출물을 C18 column chromatography를 실시하여 , H2O, H2O : CH3CN(9 :1 -1:9), CH3CN, CH3CN:CH3C1(3:1), CH3C1, EtOH로 분획을 나누었다. 그 중 CH3CN:CH3C1(3:1) 분획물(289mg)을 silica gel column chromatography(전개용매; EtOAc : nhexane=2 :10, 10 :20, 20:50, 50:90, 0:100→EtOH/CH3CN)를 실시하여 얻은, EtOAc : n-hexane(:20 :50)의 분획물(79 mg)을 Prep-HPL로 1(6 mg)과 2(7 mg)를 단리하였다.
- 감압농축 MeOH extract 4g을 얻었다. 이 추출물을 C18 column chromatography를 실시하여 , H2O, H2O : CH3CN(9 :1 -1:9), CH3CN, CH3CN:CH3C1(3:1), CH3C1, EtOH로 분획을 나누었다. 그 중 CH3CN:CH3C1(3:1) 분획물(289mg)을 silica gel column chromatography(전개용매; EtOAc : nhexane=2 :10, 10 :20, 20:50, 50:90, 0:100→EtOH/CH3CN)를 실시하여 얻은, EtOAc : n-hexane(:20 :50)의 분획물(79 mg)을 Prep-HPL로 1(6 mg)과 2(7 mg)를 단리하였다.
대상 데이터
- Memk), silica gel이(kieselgel 60, 230— 400 mesh), sand(Aldrich)를 사용하였다. Recycling prep-HPLC(Model 908)는 SUNIL JAI(JALGEL~GS310)의 methacryEc acid polymei가 충진된 column(40x500mm)을 사용하였으며, IR-Spectrophotometei는 Bomem사의 model MB 104 FT/IR 을 사용하였다. NMR Spectrophotometer(KBSI)^ JEOL-ECP 600을 사용하였으며 , Acetone-d6를 용매로 사용하였고, 내부 표준물질로 사용한 tetramethylsilane(TMS)를 기준으로 8(ppm) 으로 나타내었으며, E(600MHz)와 13C-NMR(125MHz), DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), COSY(Correlated Spectroscopy), HMQC(Heteronuclear Multiple Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Connectivity)의 자료를 분석하였다.
- 그리고 Glass column(47 mm×800 nm)을 사용하였고, Thin layer chromatography(TLC)는 silica gel plate(0.25 mm, polygram sil N-HR/UV254, E. Memk), silica gel이(kieselgel 60, 230— 400 mesh), sand(Aldrich)를 사용하였다. Recycling prep-HPLC(Model 908)는 SUNIL JAI(JALGEL~GS310)의 methacryEc acid polymei가 충진된 column(40x500mm)을 사용하였으며, IR-Spectrophotometei는 Bomem사의 model MB 104 FT/IR 을 사용하였다.
- 본 연구에 시용한 고삼 뿌리는 원광대학교 한의과 대학 한방병원에서 구입하여 , 외부형태를 비교 조사하여 확인 후 사용하였다. 실험에 사용된 식물체는 원광대학교 한의학전문대학원 한약자원개발학과에 보관되어 있다.
- 항균 및 항진균 시험용으로 사용된 균주는 국립보건원으로부터 분양 받아 사용하였으며, Gram 양성세균으로는 Streptococcus mutans JC-2 12228, Streptococcus epidermidis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538g Bacillus subtilis ATCC 6533, Micorcoccus luteus ATCC 9341, gram 음성세균으로는 Pseudomonas putida ATCC 8729, Escherichia coli ATCC 10536, Salmonella typhimurium KCTC 1925, Pseudomonas aeruginosa ATCC 1636, Klebisiella pnemoniae ATCC 10031, 진균으로는 Aspergillus niger ATCC 9029, Candida albicans ATCC 10231을 사용하였다.
- 0㎖l를 섞어 배지가 굳은 다음 배양시킨 균을 백금이로 5 mm 정도 도말하여, 세균은 37℃ 배양기에서 24시간, 진균은 221 배양기에서 5~7일간 배양하였다. 항균력의 대조물질으로는 amocla(건일, amoxicillic sod., cal.,ulanic acid pot.)를 사용하였으며, 항진균력의 대조물질으로는 ketoconazole을 사용하였다. 각 배양이 끝나면 집락형성 여부를 관찰하여, 성장이 인정되지 않는 가장 낮은 농도를 최소억제농도(Minimal inhibitory concentration, MIC)17)로 판정하였다.
데이터처리
- 실험결과의 통계처리는 Student's t-test에 준하였고, P-value가 0.05 이하일 경우 유의한 것으로 판명하였다.
이론/모형
- Flavanone에 대한 항균 및 항진균력은 고체배지 희석법15,16)을 이용하여 측정하였다. 각 flavanone을 10% DMSO 생리식염수에 용해시킨 후, flavanone의 농도를 최고농도 2,000 ㎍/㎖ 까지 2배 계단 희석하였다.
성능/효과
- p data-page="1">고삼이라는 명칭은 신농초본경의 중품에 최초로 수록되었으며, 그 귀경은 심, 간, 소양, 대양, 위경 등이라 하였고, 미는 고, 성은 한, 무청(無靑)하다고 하였으며, 한의학 임상에서 거풍살충 織風殺蟲), 이수(利水), 해독(解毒)등의 효능으로, 황달匱疸), 설사, 대하(帶下), 음양陰痒), 피부소양(가려움증), 농포창(膿疱窟), 진(疹), 선(마른버짐), 마풍(홍역), 소변불리(小便不利) 등의 병증에 음용한다.1) 고삼의 주요성분으로는 quinolizidine, alkaloid, flavonoid, saponin 등이 함유되어 있으며,2,3) 약리작용(藥理作用)은 抗trichomonas 및 抗아메바, 원충작용(原蟲作用), 항균작용 (抗菌作用), 건위작용(健胃作用), 혈압강하작용(血壓降下作用), 항종류작용(抗腫瘤作用), 항심율실상작용(抗心律失常作用), 해열작용(解熱作用), 항담작용(鹹淡作用), 승백혈구작용(升白血球作用), 항심기결혈작용(抗心肌缺血作用) 등이 있음에 확인되었으며,4-6) 최근 고삼이 람브리아(남씨가제) 편모충 Giardia, lambic에 대한 효과,6) Stress성 궤양발생 예방효과,7) 동물실험결과 항종유작용으로, mouse의 육유 S-180,8-10) 자궁경암14(U-14),9,11) 및 Fhrlich 암주, 육유 S-37, 복수형 육유 $-180와 EC Saroma 180복수암7)에 대한 일정한 억제작용 등이 있음이 확인되었다. 또한 김12)은 고삼이 당뇨에 미치는 연구에서, 고삼이 혈당강하 insulin 함량의 증가에 미치는 영향이 있어, 당뇨병의 치료에 효과가 있다고 보고하였으며, 또한 김13)은 lavandulyl flavanones 성분인 (2S)-2'-methoxykurarinone, sophoraflavanone G, leachianone A 및 (-)-kurarinone 등이 항말라리아 활성을 가진다는 보고하였으며, 송 등14)은 고삼으로부터의 추출물이나 추출성분이 여러 효소나 세균 등에 작용하여 생리학적인 작용에 영향을 준다고 보고하는 등, 고삼은 매우 다양한 약리효과를 가짐으로서, 고삼 추출물을 통한 많은 질병치료제의 개발이 시도되고 있는 실정이다.
- 고삼 메탄올 추출물의 진균에 대한 항진균 활성을 측정한 결과, 최소 억제농도는 200 ㎍/㎖ 이상으로 측정되었으며, 메탄올 추출물로부터 분리한 flavonone을 HPLC, IR, 1D/2D-NMR 등의 분광학적 방법으로 leachianone A(LA, 1)와 sophoraflavanone G (SFG, 2)로 동정하여, 항균 및 항진균력을 측정하였으나, 최소 억제농도가 200 ㎍/㎖ 이상으로 항균효과가 미미하였다.
- 고삼의 메탄올 추출물을 컬럼 크로마토그래피법과 recycling prep-HPLC로 분리하여 얻은 순수한 생리활성물질, flavanone 화합물에 대한 최소 억제농도를 항균 및 항진균 대조시약으로항균 및 항진균 활성을 비교한 결과 leachianone(l)와 sophoraflavanone G(2)는 그람 양성균, 그람 음성균과 진균에 대하여 최소 억제농도가 200 gg/m/ 이상으로 항균 및 항진균 활성이 미미한 것으로 측정되었다(Table Ⅲ).
- 이상의 사실과 문헌18,19)을 비교하여, 이 화합물은 5, 7, 4'-trihydroxy-8-lavandulyl-2, -methoxy-flavanone 즉 leachianone A(1)로 동정하였다(Table Ⅰ). 화합물 2의 IR spectrum, 1H-NMR spectrum도 화합물 1의 그것과 매우 유사한 것으로 보아, 동일계열의 화합물임을 알 수 있으며, 1H-NMR Spectrum을 보면에서 3.83 ppm에서 나타나지 않았다. 이 화합물은 5, 7, 2', 4'-tetrahydroxyflavanone 즉 sophoraflavanone G(2)로 동정하였다(Table Ⅱ).
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