[국내논문]Spirulina platensis의 배양 및 추출조건에 따른 항암활성 비교 Comparison of Anticacer Activities from the Culture and Extraction Conditions of the Spirulina platensis원문보기
담수 혹은 해수에서 배양한 S. platensis의 추출조건에 따른 수율을 비교하기 위해 60$^{\circ}C$와 100$^{\circ}C$에서 물과 에탄올을 이용하여 추출하여 추출 수율을 비교한 결과 해수 S. platensis가 약 3% 정도 높은 추출 수율을 나타내었다. 그리고 각 추출물의 정상세포에 대한 세포 독성을 살펴보기 위하여 인간 정상 신장 세포(HEK293)를 이용하였으며, 모든 시료에서 1.0 mg/ml의 농도에서 26%이하의 비교적 낮은세포독성을 나타내었고, 그 중 해수 S. piatensis가 담수 S. piatensis보다 약 5% 정도 낮은 세포독성을 나타내었다. 그리고 암세포에 대한 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과 4가지 암세포 주인 폐암세포(A459)와 위암세포(AGS), 유방암세포(MCF-7)와 간암세포(Hep3B)에 대해 모든 추출물에 대해 1.0 mg/ml의 농도에서 70%이상의 높은 암세포 생육억제 효과를 나타내었고, 그 중 해수 S. platensis의 60$^{\circ}C$물 추출물에서 80%이상으로 가장 높은 암세포 생육 억제 효과를 나타내었다. 선택적 사멸도는 모든 암세포에서 1.5 이상으로 나타나 암세포에 대해 선택적으로 사멸시키는 것으로 나타났다. 담수 혹은 해수를 사용하여 배양한 경우 해수 S. platensis가 추출 수율뿐만 아니라 정상세포에 대한 세포독성 및 암세포 생육 억제 활성에서 높은 효과를 나타내었다. 인간 전골수세포인 HL-60세포를 이용한 세포분화도를 측정한 결과 60$^{\circ}C$에서 물을 이용하여 추출한 해수 S. platensis에서 담수 S. platensis보다 5일째 약 20% 정도의 높은 세포 분화 활성을 나타내었다.
담수 혹은 해수에서 배양한 S. platensis의 추출조건에 따른 수율을 비교하기 위해 60$^{\circ}C$와 100$^{\circ}C$에서 물과 에탄올을 이용하여 추출하여 추출 수율을 비교한 결과 해수 S. platensis가 약 3% 정도 높은 추출 수율을 나타내었다. 그리고 각 추출물의 정상세포에 대한 세포 독성을 살펴보기 위하여 인간 정상 신장 세포(HEK293)를 이용하였으며, 모든 시료에서 1.0 mg/ml의 농도에서 26%이하의 비교적 낮은세포독성을 나타내었고, 그 중 해수 S. piatensis가 담수 S. piatensis보다 약 5% 정도 낮은 세포독성을 나타내었다. 그리고 암세포에 대한 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과 4가지 암세포 주인 폐암세포(A459)와 위암세포(AGS), 유방암세포(MCF-7)와 간암세포(Hep3B)에 대해 모든 추출물에 대해 1.0 mg/ml의 농도에서 70%이상의 높은 암세포 생육억제 효과를 나타내었고, 그 중 해수 S. platensis의 60$^{\circ}C$물 추출물에서 80%이상으로 가장 높은 암세포 생육 억제 효과를 나타내었다. 선택적 사멸도는 모든 암세포에서 1.5 이상으로 나타나 암세포에 대해 선택적으로 사멸시키는 것으로 나타났다. 담수 혹은 해수를 사용하여 배양한 경우 해수 S. platensis가 추출 수율뿐만 아니라 정상세포에 대한 세포독성 및 암세포 생육 억제 활성에서 높은 효과를 나타내었다. 인간 전골수세포인 HL-60세포를 이용한 세포분화도를 측정한 결과 60$^{\circ}C$에서 물을 이용하여 추출한 해수 S. platensis에서 담수 S. platensis보다 5일째 약 20% 정도의 높은 세포 분화 활성을 나타내었다.
A extract from Spirulina platensis of seawater and freshwater was obtained by using the water and ethanol. Extraction yields of seawater S. platensis were observed about 3% higher than freshwater S. platensis. Cytotoxicity (HEK293) and inhibition ratio of cancer cell line (A549, AGS, MCF7, Hep3B) in...
A extract from Spirulina platensis of seawater and freshwater was obtained by using the water and ethanol. Extraction yields of seawater S. platensis were observed about 3% higher than freshwater S. platensis. Cytotoxicity (HEK293) and inhibition ratio of cancer cell line (A549, AGS, MCF7, Hep3B) in adding of the extracts from the S. platensis of seawater and freshwater were measured by SRB assay. Cytotoxicity of all of the extracts in adding 1.0 mg/ml was below 26%. Ctotoxicity of the extracts from the seawater S. platensis were about 6% less than freshwater S. platensis. Inhibition ratio of cancer cell growth was inhibited by adding 1.0 mg/ml of the extracts that was obtained about 80%. Inhibition effect of cancer cell growth in adding seawater S. platensis was observed higher than freshwater S. platensis. Differentiation ratio of HL-60 cells in adding the extracts of seawater S. platensis was observed highly that was 160.9%.
A extract from Spirulina platensis of seawater and freshwater was obtained by using the water and ethanol. Extraction yields of seawater S. platensis were observed about 3% higher than freshwater S. platensis. Cytotoxicity (HEK293) and inhibition ratio of cancer cell line (A549, AGS, MCF7, Hep3B) in adding of the extracts from the S. platensis of seawater and freshwater were measured by SRB assay. Cytotoxicity of all of the extracts in adding 1.0 mg/ml was below 26%. Ctotoxicity of the extracts from the seawater S. platensis were about 6% less than freshwater S. platensis. Inhibition ratio of cancer cell growth was inhibited by adding 1.0 mg/ml of the extracts that was obtained about 80%. Inhibition effect of cancer cell growth in adding seawater S. platensis was observed higher than freshwater S. platensis. Differentiation ratio of HL-60 cells in adding the extracts of seawater S. platensis was observed highly that was 160.9%.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 S. plae海is의 추출물을 이용하여 항암효과를 밝히고 macrophage나 granulocyte로 분화되어 사멸[3]하는 인간 전골수세포인 HL60을 이용한 세포 분화 도를 측정하여 항암활성이 우수한 S. platemis의 배양조건을 확립하고 추출할 때의 알맞은 용매를 선정하여 이를 이용한 기능성 식품 분야에 바탕 자료로서 가치를 지니게 하기 위해 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
추출 방법으로는 물을 이용한 경우 추출온도는 60℃와 100℃, 에탄올을 이용한 경우 추출온도는 6VC에서 수직 환류 냉각기가 부착된 주줄 flask에 시료 중량에 대하여 각각 10배의 용매를 이용하여 12시간 동안 2회 반복 추출하였다. 얻어진 각각의 추출물들은 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결건조한 뒤에 각각의 수율을 계산하였다.
추출하였다. 얻어진 각각의 추출물들은 감압 여과장치로 여과하여 농축 후 동결건조한 뒤에 각각의 수율을 계산하였다.
5% CO。한 후, 각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0g/l로 100 μ1씩 첨가하여 48시간 배양하였다. 배양이 완료된 후에 상등액을 제거하고 4。(2의 10%(w/v) TCA(trichloroacetic acid) 100 μ1를 가하여 4℃에서 1시 간 동안 방치한 후 증류수로 4~5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1 %(v/v) acetic acid 에 녹인 0.
Selectivity 측정은 SRB assay를 이용하여 정상세포 (HEK293)에 대한 각 sample 농도에서 세포독성을 측정하고, SRB assay를 이용하여 각 암세포주의 생육 억제 활성을 측정한 후 각 농도에서의 세포 독성에 대한 암세포 생육 억제 활성의 비로 selectivity를 계산한다.
암세포 생육 저해 효과는 인감 폐암세포(A549)와 위암세포(AGS), 유방암 세포(MCF7)와 간암세포(Hep3B)를 이용하여 SRB 방법을 이용하여 암세포 억제 활성을 측정하였다. 그리고 각 농도에서 정상세포에 대한 암세포의 생육 억제 활성의 비를 나타내는 선택적 사멸도(selectivity)를 구하였다.
측정하였다. 그리고 각 농도에서 정상세포에 대한 암세포의 생육 억제 활성의 비를 나타내는 선택적 사멸도(selectivity)를 구하였다.
대상 데이터
platensis 분말로서 담수배양 S. platensise 담수를 이용하여 염도는 35%, pH는 9~11을 맞추어 옥외 광합성 배양법으로 배양한 제품으로 미국의 Earthrise사의 Spirulina Natirual 제품을 사용하였으며 , 흐!! 수배양 S. platemis는 하와이 해수를 이용하여 옥외 광합성 배양법에 의해 배양한 제품으로 미국 Nutrex사의 하와이산 S. platens is를 제조한 Pacifica Spirulina를 사용하였다.
bovine serum을 이용하였다. Hepes buffer, gentamycin sulfate, trysin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였고, 세포염색을 위해서 필요한 sulforthodamine B(SRB)는 Sigma 사로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 세포 분화도를 측정하기 위한 시약인 Triton x-100, 4-nitrophenyl phosphate는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
Hepes buffer, gentamycin sulfate, trysin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였고, 세포염색을 위해서 필요한 sulforthodamine B(SRB)는 Sigma 사로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 세포 분화도를 측정하기 위한 시약인 Triton x-100, 4-nitrophenyl phosphate는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
실험에 이용된 세포주는 암세포로 인간 폐암세포인 A549 (Lung carcinoma, human, ATTC, U.S.A.), 인간 위암세포인 AGS(Stomach adenocarcinoma, human, ATTC, U.S.A.), 인간 간암세포인 Hep3B(Hepatocillular carcinima, human, ATCC, U.S.A.), 인간 유방암세포인 MCF7(Breast adenocarcinoma, human, ATCC, US A) 를 사용하였고, 시료 자체의 세포 독성을 알아보기 위한 정상세포로는 인간 신장 세포인 HEK293(Kidney nomal, human, ATTC, U.S.A.) 를 사용하였다. 그리고 세포 분화도를 측정하기 위해서 인간 전과립 세포(human promyelocytes; HL60)를 사용하였다.
) 를 사용하였다. 그리고 세포 분화도를 측정하기 위해서 인간 전과립 세포(human promyelocytes; HL60)를 사용하였다. 실험에 사용된 암세포 RPMI 1640배지(A549, AGS)와 DMEM F12배지(Hep3B, MCF7)를 정상세포는 DMEM배지에 10% heating-inactivated FBS를 첨가시켜배양하였다.
그리고 세포 분화도를 측정하기 위해서 인간 전과립 세포(human promyelocytes; HL60)를 사용하였다. 실험에 사용된 암세포 RPMI 1640배지(A549, AGS)와 DMEM F12배지(Hep3B, MCF7)를 정상세포는 DMEM배지에 10% heating-inactivated FBS를 첨가시켜배양하였다.
세포 분화 측정에 사용된 세포주는 HL60(ATCC)이며 이를 RPMI 1640배지에 10% heat-inactivated FBS(fetal bovin serum)壮로 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 세포 분화의 정량적 인 수치를 측정하기 위해 세포의 농도가 4~5xl04 cells/ml로 포함된 배지를 24 well plate에 900 μ1 씩 첨가하여 24시간 동안 배양하였다.
세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 DMEM F12는 Gibco(USA)로부터 구입하였고, 혈청은 Hyclone(USA)사의 fetal bovine serum을 이용하였다. Hepes buffer, gentamycin sulfate, trysin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였고, 세포염색을 위해서 필요한 sulforthodamine B(SRB)는 Sigma 사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
성능/효과
platensise\ 60℃ 물 추출물에서 80% 이상으로 가장 높은 암세포 생육 억제 효과를 나타내었다. 선택적 사멸도는 모든 암세포에서 1.5 이상으로 나타나 암세포에 대해 선택적으로 사멸시키는 것으로 나타났다. 담수 혹은 해수를 사용하여 배양한 경우 해수 S.
/泌佐"姑에서는 물 100 也에서 19.8%, 60。(2에서는 18.16%徉 담수 배양 S platensis 의 각각 14.17%, 17.69%보다 높은 추출 수율을 나타내었다. 에탄올 주줄물의 경우도 해수 배양 S.
담수 및 해수에서 배양된 S. platensis 추출물의 세포독성 비교를 sulforhodamine B assay인 SRB 방법을 사용하여 측정한 결과 모든 추출물에서 세포독성은 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었고, 최고 투여농도인 1.0mg/ml에서 담수의 60℃ 에탄올 추출물이 25.8%로 가장 높은 독성을 보였다. 가장 낮은 세포 독성 효과를 나타낸 것은 해수 배양 S.
9%의 효과를 나타내었다. 대체적으로 담수 배양 S. platensis보다 해수 배양 S. platensisA 모든 추출물에서 비교적 낮은 세포 독성을 나타내었고, 담수와 해수 배양 S. platensis 모두 최고 농도인 1.0mg/ml의 농도에서 26% 이하의 세포 독성을 나타내어 비교적 정상세포에 대한 세포 독성 이 적은 것으로 나타났다 (Fig. 1). 이 결과를 바탕으로 담수 및 해수배양 S.
1). 이 결과를 바탕으로 담수 및 해수배양 S. platensis 는 인체에 큰 독성을 나타내지 않는 것으로 사료되어 진다.
먼저 인간 폐암세포(A549)에 대한 생육 억제 활성 및 선택적 사멸도를 측정한 결과 억제활성의 경우 대부분의 시료에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었으며, 대체적으로 해수 S. platensise7'] 담수 S. platensis보다 더 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 그 중 가장 좋은 암세포 억제 효과를 나타낸 것은 해수 배양 S.
7%의 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 그리고 담수와 해수 배양 S. platensis 추출물 모두 농도 1.0 mg/ml일 때 70% 이상의 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 선택적 사멸도 또한 모든 농도에서 1.
0 mg/ml일 때 70% 이상의 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 선택적 사멸도 또한 모든 농도에서 1.5~4의 높은 선택적 사멸도를 나타내었다(Fig. 2). 선택적 사멸도는 정상세포의 세포독성에 대한 암세포 생육 억제 활성의 비로 나타낸 것으로 보통 1.
인간 위암세포(AGS)에 대한 암세포 생육억제 활성 및 선택적 사멸도를 측정한 결과 대부분의 추출물에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었고, 농도가 1.0 mg/ml일 때가장 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 이 세포주에 대해서도 해수 S.
0 mg/ml일 때가장 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 이 세포주에 대해서도 해수 S. platensis가 담수 S. platens is보片 높은 암세포 생육 억제 활성을 나타내었으며, 60℃ 물 추출물의 해수 S. /泌佐〃豆s에서 1.0 mg/ml의 농도에서 80.4%로 가장 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 선택적 사멸도 또한 1.
4%로 가장 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 선택적 사멸도 또한 1.5에서 4사이로 비교적 높은 선택적 사멸도를 나타내었다(Fig. 3)
인간 유방암 세포인 MCF-7을 이용하여 생육억제 활성 및 선택적 사멸도를 측정한 결과 모든 시료에 대해 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었고, 담수와 해수 S. platensis 모두 1.0 mg/ml의 농도에서 70% 이상의 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 여기서도 알 수 있듯이 해수 S.
0 mg/ml의 농도에서 70% 이상의 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 여기서도 알 수 있듯이 해수 S. platensis와 담수 S. platens is를 비교했을 때 해수에서 얻은 S. platemsis가 더 높은 암세포 억제 활성을 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 그 중 가장 높은 억제 활성을 나타낸 것은 해수 S.
4%의 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 선택적 사멸도 또한 모든 농도에서 1.5 이상으로 높은 선택적 사멸 도를 나타내었다(Table 2).
8%로 비교적 높은 암세포 억제 활성을 나타내었다. 모든 추출물에 대해 1.0 mg/ml의 농도에서 70% 이상의 높은 억제 활성을 나타내었다. 그리고 선택적 사멸도 또한 모든 농도에서 1.
0 mg/ml의 농도에서 70% 이상의 높은 억제 활성을 나타내었다. 그리고 선택적 사멸도 또한 모든 농도에서 1.5~4의 선택적 사멸도를 나타내어 대체적으로 암세포에 대한 선택적 사멸도가 좋은 것으로 나타났다(Table 2).
이 결과 담수와 해수에서 배양한 S. platensis가 이 4가지 암세포 주에 대해 생육 억제 활성이 높은 것을 확인할 수 있었고, 그 중 해수에서 배양한 S. plateiisis가 담수에서 배양한 S. platens is보다 높은 항암 효과를 나타내었다. 이는 S.
0 mg/ml의 농도로 투여한 후, 5일 동안 세포의 분화도를 관찰한 결과이다. 모든 시료에서 시간 의존적으로 분화도가 증가하는 경향을 나타내었고, 담수와 해수 S platensis의 추출물을 비교한 결과 해수 S. 以旋”前5에서 더 높은 세포 분화 활성을 나타내었다. 그 중 해수 S.
以旋”前5에서 더 높은 세포 분화 활성을 나타내었다. 그 중 해수 S. platensis의 60℃, 물 추출물에서 5일째 160.9%로 가장 높게 나타났고, 이와 비교해 담수 S. platensis는 148.6%를 나타내 해수 S. platen sis와 추출물에서 더 높은 세포 분화도를 나타내었다. Fig.
Fig. 5는 세포의 분화되는 모습을 찍은 사진으로 60。(:에서 물을 이용하여 추출한 추출물을 첨가하여 3일째 되는 날 찍은 사진으로 해수를 이용하여 배양한 S. 以泥〃两어서 분화되는 모습이 가장 많은 것을 확인할 수 있었다. 이는 앞선 실험에서 해수 S.
약 3% 정도 높은 주출 수율을 나타내었다. 그리고 각 추출물의 정상세포에 대한 세포 독성을 살펴보기 위하여 인간 정상 신장 세포(HEK293)를 이용하였으며, 모든 시료에서 1.0 mg/ml의 농도에서 26%이하의 비교적 낮은 세포독성을 나타내었고, 그 중 해수 S platensisA 담수 S. 以m功sis보다 약 5% 정도 낮은 세포독성을 나타내었다. 그리고 암세포에 대한 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과 4가지 암세포 주인 폐암세포(A459>와 위암세포(AGS), 유방암세포(MCF-7)와 간암세포(Hep3B)에 대해 모든 추출물에 대해 1.
以m功sis보다 약 5% 정도 낮은 세포독성을 나타내었다. 그리고 암세포에 대한 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과 4가지 암세포 주인 폐암세포(A459>와 위암세포(AGS), 유방암세포(MCF-7)와 간암세포(Hep3B)에 대해 모든 추출물에 대해 1.0 mg/ml의 농도에서 70% 이상의 높은 암세포 생육 억제 효과를 나타내었고, 그 중 해수 S. platensise\ 60℃ 물 추출물에서 80% 이상으로 가장 높은 암세포 생육 억제 효과를 나타내었다. 선택적 사멸도는 모든 암세포에서 1.
platens is가 주출 수율뿐만 아니라 정 상세 포에 대한 세 포 독성 및 암세포 생육 억제 활성에서 높은 효과를 나타내었다. 인간 전골수세포인 HL-6Q세포를 이용한 세포 분화 도를 측정한:결과 6(TC에서 물을 이용하여 추출한 해수 S 以7仞刼s에서 담수 S. platemis보다 5일째 약 20% 정도의 높은 세포 분화 활성을 나타내었다.
후속연구
/沥仞戒?에는 항암 활성에 효과가 있는 수용성 성분이 더 많이 함유되어 있는 것으로 사료된다. 앞으로 해수에서 배양한 S. platensisS] 유용 성분의 분석 및 구조분석이 요구된다.
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