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문제 정의
- 조사하였다. 나아가 기능성 소재로 개발이 가능한 EPS를 분리균주로부터 분리, 정제하여 그 특성을 규명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 EPS가 극한 생존환경에서 자기 방어 물질로서 작용흐]는 것에 착안하여 EPS생성 유산균이 낮은 pH의 위산에서와 소장에 분비된 담즙에서 생존하여 probiotics로 기능할 수 있을 것을 기대하여, 김치로부터 분리된 유산균 중 3종의 EPS생성 유산균주를 선별하고 내산성, 인공위액 및 인공담즙 저항성 시험을 통하여 분리균주의 장내 생존 가능성을 조사하였다. 나아가 기능성 소재로 개발이 가능한 EPS를 분리균주로부터 분리, 정제하여 그 특성을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 회수된 균체에 조제된 인공담즙액을 제거한 상징액과 동량 첨가하여 이를 현탁시킨 후 3(TC에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 생균수(colony forming unit(CFU)/ml) 를 측정하여 인공담즙에 대한 저항성을 비교하였다. 대조군은 분리균주가 EPS를 생성하지 않은 상태로서 MRS 배지에서 배양한 후(3(TC, 24 h) 실험구와 동일하게 처리하였다.
- 05 M sodium phosphate 용액과 인공위액을 각각 상징액과 동량으로 첨가하여 30℃ 에서 2시간 배양하였다. 2시간 배양 후 생균수를 측정하여내 산성과 인공위액에 대한 저항성을 비교하였다. 대조 군은 분리 균주가 EPS를 생성하지 않은 상태로서 MRS 배지에서 배양한 후(30。(二 24 h) 실험구와 동일하게 처리하였다.
- 3종의 분리균주는 유일한 탄소원으로 sucrose를 이용하여 EPS를 생성하였다. Leu.
- EPS의 구성 당은 EPS 가수분해물을 제조 후 TLC 및 HPLC로 분석하였다[21]. EPS의 가수분해는 2 N 황산으로 100。。에서 3-6시간 동안 실시하였다.
- 0)에 도말하여 30℃에서 4&시간 평판배양 하였다. Mucoid colony를 나타내는 점질균을 선정하고, 다시 sucrose 액체배지에서 점성물질을 분비하는 것을 확인하여 EPS 생성균주로 선정하였다.
- citreum C3, Leu. mesenteroides CI1 을 sucrose 액체배지에 30℃, 48시간 배양된 배양액에 2배량의 에탄올을 가하여 침전시킴으로서 각각 21.49 g/1, 16.46 g/l, 22.98 g/1의 crude EPS를 회수하였다. 회수된 crude EPS를 다시 정제하였을.
- mesenteroides Cl 1 로부터의 EPS순으로 나타났다. 그러나 이와 같은 결과는 각 분리 균주로부터의 EPS 생성량에 따른 차이가 점도에 영향을 미쳤을 수 있으므로 각각의 분리균주로부터의 crude EPS와 정제 EPS를 4%(w/v)의 동일농도로 조정한 후 점도를 측정하였다(Table 4). 그 결과 Leu.
- 김치로부터 3종의 EPS 생성 유산균을 분리하였다. 분리 균주는 Leuconostoc kimchii, Leuconostoc citreum, Leuconostoc mesenteroides로 동정 되 었 으며, 각각 Leuconostoc kimchii GJ2, Leuconostoc citreum C3, Leuconostoc mesenteroides Cll로 명명하였다.
- 김치로부터 분리되어 유산균으로 확인된 김치 유산균주를 sucrose 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% dipotassium phosphate, 0.5% diammonium citrate, 5% sucrose, pH 7.0)에 도말하여 30℃에서 4&시간 평판배양 하였다. Mucoid colony를 나타내는 점질균을 선정하고, 다시 sucrose 액체배지에서 점성물질을 분비하는 것을 확인하여 EPS 생성균주로 선정하였다.
- 3%로 첨가하여 사용하였다[25]. 담즙에 대한 저항성은 sucrose 액체배지에서 30℃, 48시간 배양된 균주를 인공위액에서 2시간 처리한 후 인공담즙에 대한 저항성을 시험하였다. 인공위액 처리를 거친 유산균 배양액은 원심분리 (9, 950xg, 5 min)하여 상징액을 제거하고 균체를 회수하였다.
- 0)에 20 mg/ml가 되도록 준비하여, 항균물질에 준비된 각종 효소를 최종 4 mg/ml 농도로 37℃에서 12시간 반응 시켜 활성의 변화를 측정하였다. 대조구로는 모든 동일한 조건에서 효소액만 빼고 처리한 것으로 사용하였다.
- 24시간 배양 후 생균수(colony forming unit(CFU)/ml) 를 측정하여 인공담즙에 대한 저항성을 비교하였다. 대조군은 분리균주가 EPS를 생성하지 않은 상태로서 MRS 배지에서 배양한 후(3(TC, 24 h) 실험구와 동일하게 처리하였다.
- 1에서와 같이 서로 다른 성상의 EPS를 생성하였다. 따라서 분리균주의 sucrose 배양 상징액과 에탄올 침전하여 회수한 crude EPS, 정제 EPS에 대해 점도를 측정하였다. 점도측정 결과는 Table 4에 나타난 바와 같이 분리균주 Leu.
- 4에 나타난 바와 같이 분리 균주에서 생성된 EPS의 경우 3종 모두 표준 당으로 사용한 glucose와 같은 전개율로 1개의 spot을 나타내어 1차적으로 glucose로만 이루어진 homo형의 EPS로 추정할 수 있었다. 보다 정확한 분석을 위해 산 가수분해물을 HPLC로 분석하였다(Fig. 5). TLC분석 결과와 마찬가지로 가수분해 된 3종의 EPS 모두 표준 당으로 사용한 glucose와 같은 retention time(5.
- 분리균주에 의해 생성된 EPS의 구성 당을 확인하기 위하여 산 가수분해한 EPS를 TLC와 HPLC를 사용흐}여 분석하였다. T* LC 결과는 Fig.
- 분리균주의 산 저항성은 단순 산성 pH에 대한 내성과 체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 인공위액 내성시험을 실시하여 확인하였다. 산성 pH에 대한 내성은 pH 3.
- 분리된 EPS 생성 균주는 그람염색 (BD Co., U.S.A.)을 비롯한 형 태 학적 특성, 50CHL API kit(Biomerieux Co., France)을 이용한 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.
- 시료는 100 pil 주입하여 RI검출기로 검출하였다. 분자량은 스라이스를 70개로 나누■어 그 중량 평균으로 계산하였다.
- C3에서의 EPS는 불투명하고 끈적임이 크며 배지 상에 볼록하게 솟아올랐으며, cil에서의 EPS는 불투명하고 묽게 퍼졌다. 선발된 3종의 균주는 모두 그람양성의 구균으로 현미경하에서의 형태학적 관찰과 생화학적 특성을 조사하였다. 16S rDNA염기서열 분석 결과 분리된 3종의 균주는 Leuconostoc kimchii AF179386,Leuconostoc citreum AF111949, Leuconostoc mesenteroides AB023246과 99%, 99%, 99% 상동성을 각각 나타내어 Leuconostoc kimchiie Leuconostoc citreume Leuconostoc mes函em泌s로 동정되었다.
- 이동상은 물을 사용하여 1 ml/min 유속으로 3UC에서 수행하였다. 시료는 100 pil 주입하여 RI검출기로 검출하였다. 분자량은 스라이스를 70개로 나누■어 그 중량 평균으로 계산하였다.
- 5ml/min 유속으로 35。(3에서 분석하였다. 시료는 autosampler(Spark Co., Netherlands)를 이용하여 20 μ1 주입 하고 Rl(Refractive Index, Younglin instrument Co., Korea)검출기로 검출하였다.
- 인공담즙의 조제는 MRS 액체배지에 0.45 nm filter(Milipore Co., U.S.A.)로 여과된 oxgall(Sigma Co., U.S.A.) 용액을 0.3%로 첨가하여 사용하였다[25]. 담즙에 대한 저항성은 sucrose 액체배지에서 30℃, 48시간 배양된 균주를 인공위액에서 2시간 처리한 후 인공담즙에 대한 저항성을 시험하였다.
- 담즙에 대한 저항성은 sucrose 액체배지에서 30℃, 48시간 배양된 균주를 인공위액에서 2시간 처리한 후 인공담즙에 대한 저항성을 시험하였다. 인공위액 처리를 거친 유산균 배양액은 원심분리 (9, 950xg, 5 min)하여 상징액을 제거하고 균체를 회수하였다. 회수된 균체에 조제된 인공담즙액을 제거한 상징액과 동량 첨가하여 이를 현탁시킨 후 3(TC에서 24시간 배양하였다.
- 05 M sodium phosphate 용액을 사용하여 측정하였다[22]. 인공위액의 조제는 Kobayashi 등 [18]의 방법을 변형한 것으로 1 N HC1 을 사용하여 pH 3.0 으로 조정한 MRS 액체배지에 pepsin(Sigma Co., U.S.A.) 1, 000 unit/mK 첨가하여 사용하였다. EPS 생성을 위해 분리 균주를 sucrose 액체 배지에 1 %(v/v) 접종하여 30℃에서 48시간 배양하였다.
- method] 15]로 실시하였다. 항균물질의 각종 효소에 대한 영향은 trypsin(Sigma Co., U.S.A.), lipase(Sigma Co., U.S.A.), protease(Sigma Co., U.S.A.)를 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5), pepsin(Sigma Co.)은 50 mM citrate 완충액 (pH 2.0), proteinase K(Sigma Co., U.S.A.)는 10 mM Tris-HCl-50 mM NaCl-5 mM EDTA(pH 7.5), a-amylase (Sigma Co., U.S.A.)는 0.1 M sodium phosphate 완중액 (pH 7.0)에 20 mg/ml가 되도록 준비하여, 항균물질에 준비된 각종 효소를 최종 4 mg/ml 농도로 37℃에서 12시간 반응 시켜 활성의 변화를 측정하였다. 대조구로는 모든 동일한 조건에서 효소액만 빼고 처리한 것으로 사용하였다.
대상 데이터
- 김치로부터 분리한 유산균 중 sucrose 고체배지에서 점질성 집락을 나타내는 9종의 균을 분리하여 그 중 sucrose 고체 배지 상에서 형태가 다른 3종의 균을 선발하였다. Fig.
이론/모형
- 유해균주에 대한 항균 활성의 확인은 균체를 직접 가하는 direct method] 15]로 실시하였다. 항균물질의 각종 효소에 대한 영향은 trypsin(Sigma Co.
성능/효과
- 분리 균주는 Leuconostoc kimchii, Leuconostoc citreum, Leuconostoc mesenteroides로 동정 되 었 으며, 각각 Leuconostoc kimchii GJ2, Leuconostoc citreum C3, Leuconostoc mesenteroides Cll로 명명하였다. EPS생성 김치유산균의 장내 정착성 여부 확인 결과 pH 3.0의 0.05 M sodium phosphate buffer 와 인공위액에서 2시간 처리한 후에도 3균주 모두 초기균수 (108 CFU/ml)를 유지하였으며 인공담즙에서 24시간 처리한 후에도 3균주 모두 초기균수(" CFU/ml)를 유지하며 3종의 EPS생 성 김치 유산균 Leu. kimchii GJ2, Leu.
- 6 g/1)보다 훨씬 많은 oxgall이 함유된 배지에서 성장할 수 있는 내성을 가져야 한다[20]. 섭취된 유산균은 실제로 위를 통과하여 장으로 이동되는 것임을 고려하여, 분리균주를 인공위액에서 2시간 처리한 후 0.3% oxgall 함유 인공담즙을 처리하였을 때 3균주 모두 24 시간 동안 초기균수(" CFU/ml)를 유지하며 높은 담 즙액 저항성을 나타내었다(Fig. 3). 정 등⑹이 보고한 동치미에서 분리한 Lactobacillus sp.
- 선발된 3종의 균주는 모두 그람양성의 구균으로 현미경하에서의 형태학적 관찰과 생화학적 특성을 조사하였다. 16S rDNA염기서열 분석 결과 분리된 3종의 균주는 Leuconostoc kimchii AF179386,Leuconostoc citreum AF111949, Leuconostoc mesenteroides AB023246과 99%, 99%, 99% 상동성을 각각 나타내어 Leuconostoc kimchiie Leuconostoc citreume Leuconostoc mes函em泌s로 동정되었다. 분리된 3종의 균주는 각각 Leuconostoc kimchii GJ2, Leuconostoc citreum C3, Leuconostoc mesenteroides Cll로 명명하였다.
- T* LC 결과는 Fig. 4에 나타난 바와 같이 분리 균주에서 생성된 EPS의 경우 3종 모두 표준 당으로 사용한 glucose와 같은 전개율로 1개의 spot을 나타내어 1차적으로 glucose로만 이루어진 homo형의 EPS로 추정할 수 있었다. 보다 정확한 분석을 위해 산 가수분해물을 HPLC로 분석하였다(Fig.
- 77 g/l로 기존의 EPS 생성 유산균에서의 생산량^ 비해 10 배 이상의 높은 생산량을 나타내었다. TLC 및 HPLC를 이용한 EPS 구성 당 확인 결과 3균주 모두 glucose로만 구성된 homopolysaccharides로 확인되었다. EPS 생성량이 가장 좋은 Leu.
- 3종의 분리균주 중 EPS생성량이 가장 높은 Leu. kimchii GJ2에 대해서 GPC를 이용한 분자량 측정결과 polysaccharide calibration curves에 의해 산출된 평균 분자량은 360, 606 Da으로 확인되었다.
- 특히 Leu. kimchii GJ2의 경우 E. coli, Pseudomonas, Listeria, Micrococcus, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus 속등의 유해 균주에서 항균활성을 나타내었으며, 생산 항균물질은 단백질성 물질로 확인되었다. 김치유산균 Leu.
- EPS 생성량이 가장 좋은 Leu. kimchii GJ2의 평균 분자량은 360, 606 Da이었으며, 나머지 두 균주에 대해서는 생성 EPS 형태와 점도의 차이로 미루어보아 생성 EPS의 분자구조와 분자량이 서로 다른 것으로 판단하였다.
- citreum C3, Leu. mesenteroides Clle각각 14.61 g/1, 7.73 g/1, 4.77 g/1의 정제된 EPS 수득 양을 나타내어 단순 에탄올 침전으로 회수한 crude EPS보다 약 1.5-5배 정도 감소량을 보였다(Table 3). 이러한 결과는 S.
- citreum C3, 그리고 Leu. mesenteroides Cll로부터 생성된 EPS는 오직 glucose로만 구성되어 중합체를 형성하는 homo형의 polysaccharides인 것으로 결정되었다. 3종의 분리균주 중 EPS생성량이 가장 높은 Leu.
- citreum C3, Leu. mesenteroides Cll로부터의 EPS 생성량은 sucrose(5%) 배지에서 각각 21.49 g/1, 16.46 g/1, 22.98 g/1 였으며, 정제 시에도 각각 14.61 g/1, 7.73 g/1, 4.77 g/l로 기존의 EPS 생성 유산균에서의 생산량^ 비해 10 배 이상의 높은 생산량을 나타내었다. TLC 및 HPLC를 이용한 EPS 구성 당 확인 결과 3균주 모두 glucose로만 구성된 homopolysaccharides로 확인되었다.
- citreum C3, Leu. mesenteroides Cll이 장내 정착하면서 probiotics 로서 작용할 수 있을 것임을 확인하였다. 반면, 대조군으로서 분리균주가 EPS를 생성하지 않았을 때의 경우에는 내산성, 인공위액, 인공담즙에서 처리 후 생균수가 IO1'2 CFU/ml 감소현상을 보여 균체의 EPS생성 여부가 probiotics로서 기능할 수 있는데 결정적 요인임을 보여주었다.
- mesenteroides Cll의 산 저항성을 검토한 결과 Fig. 2에 나타난 바와 같이 sucrose 배지에서 30。。, 48 시간 동안 배양되어 EPS를 생성한 3종의 분리균주는 pH 3.0 의 0.05 M sodium phosphate 용액이나 인공위액에서 2시간이 지난 후에도 사멸하지 않고 초기균수(1渺 CFU/ml)를 유지하며 높은 내산성을 나타내었다. 이는 위에서 생존하여 장으로 이동할 수 있다는 가능성을 제시한 결과라 할 수 있겠다.
- mesenteroides Clle 높은 내산성의 기능을 지니면서 동시에 담즙에 대한 높은 저항성을 나타내어 probiotics로의 기능을 갖추었다고 할 수 있다. 대조군으로서 MRS 배지에서 30℃, 24시간 동안 배양되어 EPS를 생성하지 않았을 때의 경우 산 저항성 실험에서와 인공담즙 실험 모두에서 생균수가 10山 CFU/ml 감소현상을 보여 , 위 내에서의 생존 가능성과 인공담즙에서의 높은 저항성은 분리 균주의 EPS 생성으로 인한 균체 보호막 작용에 의한 결과라고 판단되었다. 뿐만 아니라 Leu.
- coli, 패혈증을 일으키는 Pseudomonas, 식중독의 원인균인 Listeria, Micrococcus, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus속 등에서 항균활성을 지니는 것으로 나타나(Table 1) 장에 머물면서 유해균주를 억제하여 바람직한 장내 환경을 조성함으로서 효과적인 생균활성 기능을 기대할 수 있다. 또한 생산된 항균물질은 trypsin, protease, proteinase K와 같은 단백분해효소에 의하여 실활됨으로 단백질성 물질임을 알 수 있었다(Table 2). 이와 같은 특성은 Leu.
- 분리 균주는 Leuconostoc kimchii, Leuconostoc citreum, Leuconostoc mesenteroides로 동정 되 었 으며, 각각 Leuconostoc kimchii GJ2, Leuconostoc citreum C3, Leuconostoc mesenteroides Cll로 명명하였다. EPS생성 김치유산균의 장내 정착성 여부 확인 결과 pH 3.
- 16S rDNA염기서열 분석 결과 분리된 3종의 균주는 Leuconostoc kimchii AF179386,Leuconostoc citreum AF111949, Leuconostoc mesenteroides AB023246과 99%, 99%, 99% 상동성을 각각 나타내어 Leuconostoc kimchiie Leuconostoc citreume Leuconostoc mes函em泌s로 동정되었다. 분리된 3종의 균주는 각각 Leuconostoc kimchii GJ2, Leuconostoc citreum C3, Leuconostoc mesenteroides Cll로 명명하였다.
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