전통 장류로부터 Exopolysaccharide 생성 유산균의 분리 및 특성 Isolation and Characterization of Exopolysaccharide Producing Lactic Acid Bacteria from Korean Soy Sauce and Soybean Paste원문보기
전통 장류에서 점성물질을 분비하는 유산균을 분리하고 높은 활성을 보이는 N45-10, K6-7 및 N58-5의 3균주를 선발하였다. 선발한 3균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과 N45-10은 Leuc. citreum, K6-7, N58-5는 Leuc. mesenteroides로 동정되었다. 산 저항성과 인공위액 저항성은 3균주 중에서 Leuc. citreum N45-10이 높은 생균수($10^5-10^6$ CFU/ml)를 나타내어 산 저항성과 인공위액 저항성이 가장 우수하게 나타났으며, 인공 담즙 저항성은 Leuc. citreum N45-10은 높은 생균수($10^3-10^4$ CFU/ml)를 유지하여 담즙액 저항성이 우수하게 나타났다. 3균주들 중에서 Leuc. citreum N45-10은 EPS 생성량이 가장 많았고, MRS 배지에서 배양하여 EPS가 생성되지 않았을 때보다 슈크로오스 배지에서 배양하여 EPS를 생성하였을 때 생균수가 더 높게 나타났다. 이것은 EPS 생성이 유산균의 세포벽 주위에 보호막으로 작용한 결과로 생각된다. 선발 유산균 3주의 EPS 생산량은 슈크로오스 액체배지에서 각각 16.173, 8.167, 3.652 g/L였으며, Leuc. citreum N45-10은 글루코오스로만 이루어진 homo-polysaccharide, Leuc. mesenteroides K6-7과 N58-5는 프락토오스, 글루코오스로 구성된 hetero-polysaccharides로 동정되었다. 선발 유산균 3주 모두는 용혈 음성반응을 나타내고, 젤라틴 액화능을 나타내지 않아 안전성이 확인되었다.
전통 장류에서 점성물질을 분비하는 유산균을 분리하고 높은 활성을 보이는 N45-10, K6-7 및 N58-5의 3균주를 선발하였다. 선발한 3균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과 N45-10은 Leuc. citreum, K6-7, N58-5는 Leuc. mesenteroides로 동정되었다. 산 저항성과 인공위액 저항성은 3균주 중에서 Leuc. citreum N45-10이 높은 생균수($10^5-10^6$ CFU/ml)를 나타내어 산 저항성과 인공위액 저항성이 가장 우수하게 나타났으며, 인공 담즙 저항성은 Leuc. citreum N45-10은 높은 생균수($10^3-10^4$ CFU/ml)를 유지하여 담즙액 저항성이 우수하게 나타났다. 3균주들 중에서 Leuc. citreum N45-10은 EPS 생성량이 가장 많았고, MRS 배지에서 배양하여 EPS가 생성되지 않았을 때보다 슈크로오스 배지에서 배양하여 EPS를 생성하였을 때 생균수가 더 높게 나타났다. 이것은 EPS 생성이 유산균의 세포벽 주위에 보호막으로 작용한 결과로 생각된다. 선발 유산균 3주의 EPS 생산량은 슈크로오스 액체배지에서 각각 16.173, 8.167, 3.652 g/L였으며, Leuc. citreum N45-10은 글루코오스로만 이루어진 homo-polysaccharide, Leuc. mesenteroides K6-7과 N58-5는 프락토오스, 글루코오스로 구성된 hetero-polysaccharides로 동정되었다. 선발 유산균 3주 모두는 용혈 음성반응을 나타내고, 젤라틴 액화능을 나타내지 않아 안전성이 확인되었다.
Three slime-forming lactic acid bacteria were isolated from traditional Korean fermented soy sauce and soybean paste and shown to produce exopolysaccharides (EPS) in sucrose media. By isolating the strains, examining their morphological characteristics and determining their 16S rDNA sequences, N58-5...
Three slime-forming lactic acid bacteria were isolated from traditional Korean fermented soy sauce and soybean paste and shown to produce exopolysaccharides (EPS) in sucrose media. By isolating the strains, examining their morphological characteristics and determining their 16S rDNA sequences, N58-5 and K6-7 were identified as Leuconostoc mesenteroides and N45- 10 as Leuconostoc citreum. The acid and bile tolerances of these three strains were investigated. Amongst the three lactic acid bacteria, Leuc. citreum N45-10 exhibited the highest viability ($10^5-10^6$ CFU/ml) in 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 0.3) for 2 h, in artificial gastric juice for 2 h and in 0.3%, 0.5% oxgall for 24h. Leuc. mesenteroides K6-7, N58-5 and Leuc. citreum N45- 10 were grown in sucrose liquid medium and 8.16 g/L, 3.65 g/L, 16.17 g/L of EPS was collected, respectively. The hydrolyzed EPS was analyzed by HPLC in order to determine the sugar composition of EPS. Leuc. mesenteroides K6-7 and N58-5 showed two peaks indicating glucose and fructose, thus they were determined to be hetero-type polysaccharides. Leuc. citreum N45-10 showed only the glucose polymer, indicating it to be a homo-type polysaccharide. In addition, all three lactic acid bacterial hemolysis did not demonstrate a clear zone in blood agar in the area surrounding a lactic acid bacteria colony.
Three slime-forming lactic acid bacteria were isolated from traditional Korean fermented soy sauce and soybean paste and shown to produce exopolysaccharides (EPS) in sucrose media. By isolating the strains, examining their morphological characteristics and determining their 16S rDNA sequences, N58-5 and K6-7 were identified as Leuconostoc mesenteroides and N45- 10 as Leuconostoc citreum. The acid and bile tolerances of these three strains were investigated. Amongst the three lactic acid bacteria, Leuc. citreum N45-10 exhibited the highest viability ($10^5-10^6$ CFU/ml) in 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 0.3) for 2 h, in artificial gastric juice for 2 h and in 0.3%, 0.5% oxgall for 24h. Leuc. mesenteroides K6-7, N58-5 and Leuc. citreum N45- 10 were grown in sucrose liquid medium and 8.16 g/L, 3.65 g/L, 16.17 g/L of EPS was collected, respectively. The hydrolyzed EPS was analyzed by HPLC in order to determine the sugar composition of EPS. Leuc. mesenteroides K6-7 and N58-5 showed two peaks indicating glucose and fructose, thus they were determined to be hetero-type polysaccharides. Leuc. citreum N45-10 showed only the glucose polymer, indicating it to be a homo-type polysaccharide. In addition, all three lactic acid bacterial hemolysis did not demonstrate a clear zone in blood agar in the area surrounding a lactic acid bacteria colony.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 전통 장류에서 분리한 유산균 중 EPS 생산 유산균을 선별하였고, 내산성, 인공위액 및 인공 담즙 저항성 시험을 통하여 선발 유산균의 장내 생존 가능성을 조사하였으며, EPS를 분리, 정제하여 그 특성에 대하여 연구하였다.
제안 방법
DNA 유전자 염기서열 분석은 Solutions for Generic Technologies (Solgent)사에 의뢰하여 분석하였으며, primer로는 Universal PCR primer 27F(5'-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT3')을 사용하였다.
EPS의 구성 당은 EPS 가수분해물을 HPLC (Waters Co., USA)로 분석하였다. EPS를 2 N 황산으로 100℃에서 6시간 동안 가수분해하고, 1 N NaOH로 중화한 다음 0.
crude EPS를 정제하기 위해 배양액에 trichloloacetic acid를 최종농도 4%(w/v)가 되도록 첨가하고 4℃에서 2시간 처리한 후 원심분리(10,000 × g, 25 min, 4℃)하여 균체와 침전된 단백질을 제거하였다.
citreum N45-10과 Leuc. mesenteroides K6-7, N58-5를 슈크로오스 액체배지에 배양한 후, 에탄올 침전법을 이용하여 각각 16.173, 8.167 및 3.652 g/L의 crude EPS를 회수하였다(Table 1). Leuc.
DNA 유전자 염기서열 분석은 Solutions for Generic Technologies (Solgent)사에 의뢰하여 분석하였으며, primer로는 Universal PCR primer 27F(5'-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT3')을 사용하였다. 계통수 작성은 Lasergene사의 DNASTAR pro software (SeqMan Pro)와 The National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 Advanced blast search 프로그램을 통하여 GenBank에 보고된 유사 균주와의 염기서열을 비교, 계통분류학적 유연관계를 분석 하였으며, MEGA v4.0을 이용하여 Tamura-Nei distance model과 neighbor-joining method [26]에 의해 계통수를 작성하였다.
3% 첨가하여 제조하였다[28]. 담즙에 대한 저항성은 슈크로오스 액체배지에 균주를 1%(v/v) 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 다음 인공위액에 2시간 처리하여 후 인공 담즙 저항성을 실험하였다. 인공 위액 처리를 거친 유산균 배양액을 원심분리(10,000 × g, 5 min, 4℃)하여 상징액을 제거, 균체를 회수하였으며 회수된 균체에 조제된 인공담즙액을 제거한 상징액과 동량으로 첨가하여 현탁시킨 후 37℃에서 24시간 배양하였고, 생균수를 측정하여 인공 담즙에 대한 저항성을 조사하였다.
0)과 인공위액을 각각 첨가하여 37℃에서 2시간 배양한 다음 생균수를 측정하여 내산성과 인공위액에 대한 저항성을 평가하였다. 대조군은 MRS 배지에서 배양하여(37℃,48 h), EPS를 생성하지 않은 조건에서 실험구와 동일하게 처리하였다.
0)과 인공위액을 각각 첨가하여 37℃에서 2시간 배양한 다음 생균수를 측정하여 내산성과 인공위액에 대한 저항성을 평가하였다. 대조군은 MRS 배지에서 배양하여(37℃,48 h), EPS를 생성하지 않은 조건에서 실험구와 동일하게 처리하였다.
85% NaCl로 현탁하여 MRS 고체배지에 100 µl 도말하여 37oC에서 48시간 배양하였다. 배양된 미생물의 형태적 차이를 이용하여 1차 선별하고, 유산균으로 확인된 균주를 슈크로오스 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% dipotassium phosphate, 0.5% diammonium citrate, 5% sucrose, pH 7.0)에 도말하여 37℃에서 48시간 배양하여 mucoid colony를 나타내는 점질균을 선별하였다. 이 균주를 슈크로오스 액체배지에 배양하여 점성물질을 분비하는 것을 재확인한 다음 EPS 생성 균주로 선발하여 실험에 사용하였다.
분리 균주의 산 저항성은 단순 산성 pH에 대한 내성실험과 체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 인공위액 내성실험을 실시하여 확인하였다. 산성 pH에 대한 내성은 0.
6 g/L)보다 훨씬 많은 oxgall이 함유된 배지에서 성장할 수 있는 내성을 가져야 한다[23]. 섭취된 유산균은 실제로 위를 통과하여 장으로 이동되는 것을 고려하여 선발된 3균주를 인공 위액에서 2시간 처리한 후, 0.3% 및 0.5% oxgall을 함유한 인공 담즙액에 처리하였다. 그 결과 Leuc.
이동상의 유속은 1.5 ml/min으로 하였으며, 시료는 auto-sampler를 이용하여 20 µl 주입하여 RI (Refractive Index) 검출기로 검출하였다.
인공 위액 처리를 거친 유산균 배양액을 원심분리(10,000 × g, 5 min, 4℃)하여 상징액을 제거, 균체를 회수하였으며 회수된 균체에 조제된 인공담즙액을 제거한 상징액과 동량으로 첨가하여 현탁시킨 후 37℃에서 24시간 배양하였고, 생균수를 측정하여 인공 담즙에 대한 저항성을 조사하였다.
0)을 사용하여 측정하였다[24]. 인공위액 내성 실험은 Kobayashi 등[18]의 방법을 변형하여 1 N HCl로 pH 3.0으로 조정한 MRS 액체 배지에 펩신을 1,000 unit/ml가 되도록 첨가하여 인공위액을 조제, 실험하였다. EPS 생성을 위해 분리 균주를 슈크로오스 액체배지에 1%(v/v) 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후, 원심분리(10,000 × g, 5 min, 4℃)하여 균체를 회수하였다.
EPS 생성을 위해 분리 균주를 슈크로오스 액체배지에 1%(v/v) 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후, 원심분리(10,000 × g, 5 min, 4℃)하여 균체를 회수하였다. 제거된 상징액과 동량의 0.05 M sodium phosphate 용액(pH 3.0)과 인공위액을 각각 첨가하여 37℃에서 2시간 배양한 다음 생균수를 측정하여 내산성과 인공위액에 대한 저항성을 평가하였다. 대조군은 MRS 배지에서 배양하여(37℃,48 h), EPS를 생성하지 않은 조건에서 실험구와 동일하게 처리하였다.
혈액 한천배지(tryptic soy agar에 5% sheep blood 첨가)에 분리한 유산균을 도말하고, 37℃에서 48시간 배양한 다음 균체 주위에 투명환의 생성여부로 용혈성을 판단하였다[20]. 젤라틴 영양 배지(beef extract 0.3%, peptone 0.5%, gelatin 12%)에 분리 균주를 접종한 다음 37℃에서 48시간 배양한 후 젤라틴 영양배지를 4℃에 약 4시간 동안 냉장 방치하여 배지의 응고 여부를 확인하였다. 배지가 응고되지 않으면 액화 반응 양성으로 판정하였다[27].
대상 데이터
본 실험에서 사용한 재래식 간장과 된장은 경기도 양주시와 남양주시 지역의 재래시장에서 구입하거나 가정에서 직접 담근 장류를 수집하였으며, 표준균주 Leuc. mesenteroides KACC12312는 농촌진흥청 한국농업미생물보존센터에서 분양 받아 사용하였다. 분석에 사용한 시약은 Sigma Aldrich(ST.
분석 컬럼은 탄수화물 분석용 컬럼(carbohydrate analysis column)(3.9 mm × 300 mm, Waters Co., USA)을 사용하였으며, 이 동상으로는 75% (v/v) 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하였다.
mesenteroides KACC12312는 농촌진흥청 한국농업미생물보존센터에서 분양 받아 사용하였다. 분석에 사용한 시약은 Sigma Aldrich(ST. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
0)에 도말하여 37℃에서 48시간 배양하여 mucoid colony를 나타내는 점질균을 선별하였다. 이 균주를 슈크로오스 액체배지에 배양하여 점성물질을 분비하는 것을 재확인한 다음 EPS 생성 균주로 선발하여 실험에 사용하였다.
전통 장류 시료에서 미생물의 형태적 차이를 분석, 1차 선별하여 약 1,000여 균주를 선발하였고, 유산균으로 확인된 약 200균주를 슈크로오스 배지에 배양하여 점성물질을 분비하는 균주 중 높은 활성을 보이는 N45-10, K6-7 및 N58-5의 3균주를 선발하였다. 생성된 EPS는 투명하면서 물엿정도의 퍼짐을 나타냈으며 N45-10균주가 가장 많은 EPS를 생성하였다.
전통 장류에서 점성물질을 분비하는 유산균을 분리하고 높은 활성을 보이는 N45-10, K6-7 및 N58-5의 3균주를 선발하였다. 선발한 3균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과 N45-10은 Leuc.
성능/효과
0)이나 인공 위액에서 2시간 처리했을 때 생균수는 EPS를 생성하지 않은 균주보다 높게 나타났다. 3균주 중에서 N45-10은 EPS 생성 유무와 상관없이 높은 생균수(105-106 CFU/ml)를 유지했을 뿐만 아니라 높은 내산성을 가지고 있어 위장에서 장으로 이동할수 있는 가능성이 시사되었다. 이 결과는 김치에서 김 등[15]이 분리한 Leuc.
3균주들 중에서 Leuc. citreum N45-10은 EPS 생성량이 가장 많았고, MRS 배지에서 배양하여 EPS가 생성되지 않았을 때보다 슈크로오스 배지에서 배양하여 EPS를 생성하였을 때 생균수가 더 높게 나타났다. 이것은 EPS 생성이 유산균의 세포벽 주위에 보호막으로 작용한 결과로 생각된다.
mesenteroides K6-7과 N58-5는 거의 사멸하였으나, Leuc. citreum N45-10은 비교적 높은 생균수(103-104 CFU/ml)를 유지하는 것으로 보아 담즙액 저항성이 가장 우수하였다(Fig. 2). 또한 N45-10 균주는 김 등[15]이 보고한 김치에서 분리한 Leuc.
citreum N45-10과 Leuc. mesenteroides K6-7, N58-5의 EPS 생산량은 homo-polysaccharide과 hetero-polysaccharide의 차이에 기인한 것으로 나타났다.
citreum과 K6-7, N58-5 균주는 Leuc. mesenteroides와 100% 상동성을 보여 기존에 알려진 유산균으로 동정되었다.
4와 같은 결과를 얻었다. 본 연구에 사용한 3종류의 유산균 모두 용혈성검사에서 균체 주위에 적혈구가 파괴되어 생기는 투명환이 나타나지 않아 안전성이 확인되었다.
mesenteroides K6-7과 N58-5는 프락토오스, 글루코오스로 구성된 hetero-polysaccharides로 동정되었다. 선발 유산균 3주 모두는 용혈 음성반응을 나타내고, 젤라틴 액화능을 나타내지 않아 안전성이 확인되었다.
1에 나타내었다. 슈크로오스 액체배지에서 EPS 생성을 유도한 균주를 0.05 M sodium phosphate 용액(pH 3.0)이나 인공 위액에서 2시간 처리했을 때 생균수는 EPS를 생성하지 않은 균주보다 높게 나타났다. 3균주 중에서 N45-10은 EPS 생성 유무와 상관없이 높은 생균수(105-106 CFU/ml)를 유지했을 뿐만 아니라 높은 내산성을 가지고 있어 위장에서 장으로 이동할수 있는 가능성이 시사되었다.
mesenteroides C11이 높은 내산성의 기능을 지니면서 동시에 담즙에 대한 높은 저항성을 나타낸다는 결과와 유사하였다. 유산균의 EPS 생성 유무에 따른 담즙 저항성을 비교한 결과, MRS 배지보다 슈크로오스 배지에 배양하였을때, 생균수가 더 높게 나타났다. 이것은 EPS 생성이 유산균의 세포벽 주위에 보호막으로 작용한 결과로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
유산균이란?
유산균은 자연계에 널리 분포하고 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 젖산을 생성하는 미생물로서 유제품, 육류, 채소 등의 다양한 발효식품 가공에 종균으로 사용하고 있으며, 식품의 보존성 향상뿐만 아니라 관능적 특성 및 영양적 가치 향상에 기여하고 있다. 또한 일부 유산균 속은 다당류를 생합성하여 제품의 조직과 점성 향상에도 기여하고 있다[25].
미생물 유래 다당류는 세포벽 위치에 따라 어떻게 나뉩니까?
미생물 유래 다당류는 크게 세포벽의 일부로 존재하는 intracellular polysaccharide, 세포벽 구조성분인 structural polysaccharide, 세포벽 외부에 존재하는 extracellular polysaccharide 등으로 나눌 수 있다. 특히 extracellular polysaccharide는 세포와의 구조적 관계에 따라 slime, capsular, microcapsular의 세 가지 형태로 분류할 수 있으며 이들을 총칭하여 exopolysaccharide (EPS)라 한다[30].
미생물의 exopolysaccharide는 어떤 역할을 합니까?
EPS는 세포벽의 일부로서 세포벽 주위에 협막을 형성하거나 세포벽 외부에 점질 형태로서 발효 중에 축적되는 미생물 다당류로, 1차 또는 2차 대사산물이다[14]. EPS는 에너지원으로 이용되는 것은 아니고 건조, 식균작용, 항생제, 독성 화합물, 삼투압 스트레스 등과 같은 외부환경으로부터 자신을 보호하는 작용을 한다[13]. EPS는 미생물이 가장 많이 생성하는 다당류로, 배양액으로부터 회수가 쉽고 정제비용이 적어 상업적인 잠재력이 가장 높은 다당류이다[31].
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