선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 靈芝는 임상에서 만성기관지염과 기관지 천식 등의 호흡기질환에도 응용되고 있으므로 본 연구에서 靈芝藥鍼의응용과 靈芝의 효능에 대한 근거를 마련하고자 알레르기질환모델을 이용하여 靈芝藥鍼의 肺俞穴(B13) 처치에 대한 효과를 살펴보고, 靈芝추출액이 rat basophilic leukemia cell line(RBL-2H3)에서 b-hexosaminidase, interleukin(IL)-4와 tumor necrosis factor- alpha(TNF-a)의 매개인자의 생성과 유출에 미치는 영향과 mouse macrophage cell line(Raw264.7)에서 nitric oxide의 생성에 미치는 영향을 조사하여 유의한 결과를 얻어 보고하는 바이다.
- 본 연구의 목적은 알레르기 질환에 대한 靈芝의 효능과 藥鍼응용의 가능성을 검증하고자 알레르기 동물모델과 RBL-2H3과 Raw264.7 cell을 사용하여 靈芝추출액과 B13에 靈芝藥鍼의 처치가 알레르기 반응을 효과적으로 억제할 수 있는지 조사하였다.
- 이미 생성된 IgE 항체를 피부에 주입하여 48시간동안 감작한 후 원인물질에 노출시켜 알레르기 증상의 발현 정도를 살펴보는 방법이다. 따라서 본 연구에서는 이 두 가지 동물모델을 사용하여 알레르기 반응에 대한 억제효과를 조사하였다.
- 본 실험에서 靈芝추출물이 RBL-2H3과 Raw264.7 cell의 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시한 결과. RBL-2H3 cell의 경우 5%(p<0.
제안 방법
- 검액은 人體의 第 3 胸椎棘突起下 兩傍 1寸 5分處에 相 應하는 양쪽 肺俞(B13) 부위와 임의의 부위인 둔부(이에 각각 처치하였다.
- 실험군은 대조군(CON), 10% 靈芝 藥鍼 處置群 (GHA10), 20% 靈芝 藥鍼 處置群(GHA20)과 20% 靈芝 藥鍼 任意穴群(이으로 구분하였다. CONe 양쪽 B13에 각각 25ug의 생리식염수를, GHA10과 GHA20은 양쪽 B13에 각각 25ug의 10%와 20%의 靈芝 藥鍼을, OP는 둔부에 동량의 20% 靈芝 藥鍼을 격일로 3회 처치하였다.
- 任意穴群(이으로 구분하였다. CONe 양쪽 B13에 각각 25ug의 생리식염수를, GHA10과 GHA20은 양쪽 B13에 각각 25ug의 10%와 20%의 靈芝 藥鍼을, OP는 둔부에 동량의 20% 靈芝 藥鍼을 격일로 3회 처치하였다.
- ICR mouse 10마리를 1군으로 하여 실험군 별로 약침 처치 부위를 제모한 후 격일로 3회의 약침을 처치하였다. 마지막 처치 1시간 경과 후 compound 48/80(8㎎/㎏, Sigma)을 복강 내에 투여하고 mouse의 치사율을 60분동안 관찰하였다.
- 처치하였다. 마지막 처치 1시간 경과 후 compound 48/80(8㎎/㎏, Sigma)을 복강 내에 투여하고 mouse의 치사율을 60분동안 관찰하였다.
- IgE 의존형 피부과민반응에 대한 영향을 알아보기 위하여 Katayama 등의 방법에 준하여 Sprague Dawley 계 rat 3마리를 1군으로 하고 실험군 별로 5일간 격 일로 총3 회의 藥鍼을 처치하였다. 실험 3일째 되는 날 rat의 등 부위를 제모하고 0.
- 藥鍼을 처치하였다. 실험 3일째 되는 날 rat의 등 부위를 제모하고 0.5mg의 anti-DNP IgE를 네 군데 피하주사한 후 감작된 부위를 표시하였다. 48시간 경과 후 DNP-HSA 0.
- 5mg의 anti-DNP IgE를 네 군데 피하주사한 후 감작된 부위를 표시하였다. 48시간 경과 후 DNP-HSA 0.5mg과 4% evans blue를 1:1로 혼합하여 mouse의 미정맥에 주사하였다. 30분 후 mouse를 도살하고 청색으로 착색된 등 부위의 피부를 채취하여 1 N KOH 용액 100ug에 침적시켜 37℃에서 24시간 방치하였다.
- 5mg과 4% evans blue를 1:1로 혼합하여 mouse의 미정맥에 주사하였다. 30분 후 mouse를 도살하고 청색으로 착색된 등 부위의 피부를 채취하여 1 N KOH 용액 100ug에 침적시켜 37℃에서 24시간 방치하였다. Acetone과 phosphoric acid(5:13) 혼합액 900ug를 첨가하여 원심분리한 후 상층액을 620nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 30분 후 mouse를 도살하고 청색으로 착색된 등 부위의 피부를 채취하여 1 N KOH 용액 100ug에 침적시켜 37℃에서 24시간 방치하였다. Acetone과 phosphoric acid(5:13) 혼합액 900ug를 첨가하여 원심분리한 후 상층액을 620nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 5%, 1%, 2% 및 5%)로 처리한 후 1시간동안 반응시켰다. 배양액을 제거 한 후 5mg/M의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어 준 후 최대 4시간 37C incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO를 200ue 씩 분주하여 well에 생성된 formazin이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 96well plate에 100ue 씩 옮긴 후 ELISA(Molecular Devices, USA)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3회의 측정으로 그에 대한 평균값과 표준 오차를 구하였다.
- 간략히 요약하면 RBL-2H3을 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 24 well plate에 각 well당 2*105개의 세포가 들어가도록 한 다음 37C 5% CO2 incubator에서 하룻밤 배양한다. 각 well의 세포들을 extracellular buffer(5mM KCl, 12.5 mM NaCl, 20 mM HEPES, 1.5 mM MgCl, 1.5 mM CaCl2, 1 mM dextros, pH 7.4) 로 2번 세척한 다음각 well 당 extracellular buffer와 GE(0%, 0.25%, 0.5%, 1% 및 2%)를 처리한 후 1시간동안 반응시켰다. 이후 PMA(50nM)와 A23187(1mM)을 사용하여 세포를 37 C 5% CO2 incubator에 1시간 반응시키고 ice bath에서 10분 동안 배양한 후 반응을 종결시켰다.
- 5%, 1% 및 2%)를 처리한 후 1시간동안 반응시켰다. 이후 PMA(50nM)와 A23187(1mM)을 사용하여 세포를 37 C 5% CO2 incubator에 1시간 반응시키고 ice bath에서 10분 동안 배양한 후 반응을 종결시켰다. Supernatant 20ug를 96well plate에 옮기고, pellete Triton X- 100(0.
- RBL-2H3 cell을6well plate에 5*105 cell/well의 농도로 분주한 후 24시간 배양한 다음 새로운 DMEM 배지에 GE를 농도별(0%, 0.25%, 0.5%, 1% 및 2%)로 세포에 처리하였다. 1 시간동안 배양한후 A23187(1uM)을 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 처리하고 8시간 동안 배양하였다.
- 5%, 1% 및 2%)로 세포에 처리하였다. 1 시간동안 배양한후 A23187(1uM)을 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 처리하고 8시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후에 상층액을 분리하여 5, 000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 -70C에 보관하였다가 IL-4 kit(BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 1 시간동안 배양한후 A23187(1uM)을 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 처리하고 8시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후에 상층액을 분리하여 5, 000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 -70C에 보관하였다가 IL-4 kit(BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여 측정하였다. ELISA를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 누출된 IL-4.
- 배양이 끝난 후에 상층액을 분리하여 5, 000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 -70C에 보관하였다가 IL-4 kit(BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여 측정하였다. ELISA를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 누출된 IL-4.의 양을 계산하였다.
- RBL-2H3 cell을 6 well plate에 5 x105cell/well의 농도로 분주한 후 24시간동안 배양한 다음 새로운 DMEM배지에 GE를 농도별(0%, 0.25%, 0.5%, 1% 및 2%)로 세포에 처리하였다. 1시간동안 배양한 후 자극제 A23187CUM) 를 처리하고 8시간동안 배양하였다.
- 1시간동안 배양한 후 자극제 A23187CUM) 를 처리하고 8시간동안 배양하였다. 배양이 끝난 후에 상층 액을 분리하여 5000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 -70℃에 보관하였다가 TNF-a kit(BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여 측정하였다. ELISA를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 누출된 TNF-a의 양을 계산하였다.
- 배양이 끝난 후에 상층 액을 분리하여 5000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 분리된 상층액을 -70℃에 보관하였다가 TNF-a kit(BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여 측정하였다. ELISA를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 누출된 TNF-a의 양을 계산하였다.
- 2% Naphthylethylene diamine dihydrochloride in DDW)와 용액 B(2% Sulfonylamide in 5% H3PO4)를 제조하여 냉암소에 보관하며, 사용직전에 두 용액을 1:1로 혼합하여 혼합용액을 사용하였다. 96 well plate에 세포배양액 100ug와 Griess 혼합용액 100ug를 분주한 뒤 ELISA를 사용하여 540ug에서 흡광도를 측정하였고, 미리 작성한 NaNO2의 표준 검량곡선에 의해 nitric oxide의 양을 계산하였다.
- 005) 감소를 나타내어 생존률을 감소시키는 것으로 나타났다(Figure 2). 따라서 본 실험에 사용한 GE의 농도는 생존률 감소에 영향을 미치는 범위를 제외한 2%이내의 농도에서 실시하였다.
- RBL-2H3과 Raw264.7 cell을 24well plate (Corning, USA)에 2*105 cell의 세포수가 되도록 DMEM 배양액에 분주하여 24시간동안 안정화시킨 후 GE를 농도별(0%, 0.25%, 0.5%, 1%, 2% 및 5%)로 처리한 후 1시간동안 반응시켰다. 배양액을 제거 한 후 5mg/M의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어 준 후 최대 4시간 37C incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO를 200ue 씩 분주하여 well에 생성된 formazin이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 96well plate에 100ue 씩 옮긴 후 ELISA(Molecular Devices, USA)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 3회의 측정으로 그에 대한 평균값과 표준 오차를 구하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 靈芝는 우리나라 자연산 靈芝를 사용하였다. 300g을 증류수로 水洗하여 11의 25% ethan이을 加하여 10시간 동안 실온에서 추출하였다.
- 실험에 사용한 동물은 ICR계 mouse(male, 30 g ± 2 g)와 Sprague Dawley계 rat(male, 200g ± 20g)을 (주) 샘타코 바이오 코리아에서 구입해서 사용했으며, 사육은 온도 22℃ ± 2℃, 습도 55 ± 5%, dark/light(12시간) 조건 하에서 고형 pellet 사료와 물은 자유 섭취하도록 하였으며, 구입 후 2주간 실험실 환경에 적응 후 실험에 사용하였다.
- RBL-2H3과 Raw264.7 celle 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받아 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 compound 48/80, anti- deoxynucleoprotein(DNP) immunoglobulin E(IgE), DNP-HSA, Evans blue, KOH, acetone, phosphoric acid, acetic acid, PMA(phorbol-12-myristate-13 acetate), A23187(calcium ionophore) 및 LPS (Lipopolysaccharide)는 Sigma로부터, FBS(fetal bovine serum), penicillin, streptomycin, DMEM (Dulbecco's modification Eagle medium) 및 trypsin- EDTA solutione Gibco BRL로부터, tetrazolium bromide salt(MTT) 및 dimethylsulfoxide(DMSO)는 Amresco로부터, Interleukin(IL)-4와 Tumor Necrosis Factor alpha(TNF-a) kit는 BD Biosciences Pharmingen으로부터 구입하여 사용하였다.
- RBL-2H3과 Raw264.7celle 한국세포주은행(KCLB) 에서 분양받았으며 세포의 배양을 위하여 10% heat inactivated FBS(Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin(Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM(Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다. 세포는 37C, 5% CQ 조건하에서 배양하였고, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.
데이터처리
- ug績은 SPSS 12.0K for Windows 통계 프로그램 패키지를 사용하여 평균치 土 표준오차로 나타내었고 유의수준은 P<0.05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Scheffe test 검정을 실시하였다.
- 05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Scheffe test 검정을 실시하였다.
이론/모형
- ^-Hexosaminidasee release는 Dastych 등"과 Schwartz 등6)의 방법에 의해 측정하였다. 간략히 요약하면 RBL-2H3을 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 24 well plate에 각 well당 2*105개의 세포가 들어가도록 한 다음 37C 5% CO2 incubator에서 하룻밤 배양한다.
- 5%, 1% 및 2%)로 세포에 처리하였다. 2시간 동안 전처리한 후 LPS(0.5ug/me)를 20시간 동안 처리하여 세포 밖으로 생성, 분비되는 nitric oxide의 양을 Griess 방법으로 측정하였다. nitric oxide 생성량을 측정하기 위한 시약인 Griess 시약은 용액 A(0.
- RBL-2H3과 Raw264.7 cell의 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. RBL- 2H3 cell의 경우 아무런 처 리를 하지 않은 세포에서 1.
성능/효과
- Compound 48/80에 의한 active systemic anaphylactic shock에서 CONe 100%의 치사율을 보인데 비해, GHA10과 GHA20은 각각 70%와 80%의 치사율을 보였으며, OP는 90%의 치사율을 보였다 (Table 2).
- 5%와 5%를 제외한 모든 GE 농도에서 유의한 영향을 보이지 않았다. 0.5% GE에서 유의한 (p<0.05) 증가를 나타내어 생존률을 증가시켰으나, 5% GE에서 유의한(p<0.005) 감소를 나타내어 생존률을 감소 시 키는 것으로 나타났다 (Figure 2).
- 5%와 5%를 제외한 모든 GE 농도에서 유의한 영향을 보이지 않았다. 0.5% GE에서 유의한 (p<0.05) 증가를 나타내어 생존률을 증가시켰으나, 5% GE에서 유의한(p<0.005) 감소를 나타내어 생존률을 감소 시 키는 것으로 나타났다 (Figure 2).
- RBL-2H3 cell에서 누출된 ^-hexosaminidasee 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에서 4.33 ± 0.56%이 었으며, PMA 와 A23187로 자극한 세포에서 36.4±1.20% 로 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 유의한(p<0.005) 증가를 나타내었다. 반면 PMA와 A23187로 자극한 후 GE를 0.
- 005) 증가를 나타내었다. 반면 PMA와 A23187로 자극한 후 GE를 0.25%, 0.5%, 1% 및 2%의 농도로 처리한 세포에서 각각 28.28±0.30%, 26.37±1.47%, 18.75±0.55%, 15.41±0.98%로 모든 농도에서 PMA와 A23187로 자극한 세포에 비해 유의한(p<0.005) 감소를 보였다 (Figure 3).
- Anti-DNP IgE를 이용한 passive cutaneous anaphylaxis에서 청색반의 누출량은 CONe 136.3± 16.51始/皿으로 나타났다. 반면 GHA10은 95.
- Compound 48/80에 의한 active systemic anaphylactic shock을 실시한 결과 CONe 100%의 치사율을 보인데 비해, GHA10과 GHA20은 각각 70%와 80%의 치사율을 보였으며, OP는 90%의 치사율을 보였다 (Table 2).
- 이러한 결과는 B13에 대한 10% GHA의 처치가 알레르기 반응을 억제하는 효과가 다른 군에 비해 우수하다는 것을 나타낸다. 또한 OP가 CON에 비해 유의한 억제효과를 나타내는 것으로 볼 때 靈芝의 본초학적 약리효과에 기 인한 결과로 판단된다.
- RBL-2H3 cell에서 분비된 B-hexosaminidase의 양은 PMA와 A23187로 자극한 세포에서 아무런 처 리를 하지 않은 세포에 비해 유의한(p<0.005) 증가를 나타내었으며, PMA와 A23187로 자극한 후 GE를 0.25%, 0.5%, 1% 및 2%의 농도로 처리한 세포에서 PMA와 A23187로 자극한 세포에 비해 유의한(p<0.005) 감소를 보였다(Figure 3).
- 이러한 결과는 靈芝추출물이 PMA 및 A23187로 자극한 RBL-2H3 cell에서 IL-4와 TNF-a의 발현을 억제하였고, LPS로 자극한 Raw264.7 cell에서 nitric oxide의 발현을 억제하여 靈芝추출물이 염증을 억제하는 기전을 가지고 있음을 알 수 있다.
후속연구
- 따라서 이번 연구결과를 요약하면 靈芝藥鍼의 B13 처치와 RBL-2H3과 Raw264.7 cell에 靈芝추출물의 전처치가 알레르기반응을 억제하며, 알레르기 질환치료에 응용 가능 할 것으로 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.