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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 유산균 발효를 통한 흰목이버섯 추출물의 항비만 및 항당뇨 효능 변화를 확인하고, 기능성 생물소재로의 활용가치를 검토하고자 하였다.
- 흰목이버섯은 아시아 전통 의학에서 고혈압, 노화, 암 및 동맥 경화를 예방하는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 L. rhamnosus BHN-LAB 76로 발효된 흰목이버섯 추출물의 항당뇨 효능에 대해 조사하였다. 그 결과, 발효된 흰목이버섯 추출물은 발효하지 않은 추출물에 비해 α-glucosidase 저해 활성을 증가시키고, 3T3-L1 전지방 세포에서의 지방세포 분화 유도를통한 지방구 생성을 억제하는 것을 확인하였다.
제안 방법
- 양성대조구로 acarbose를 사용하였으며, 음성대조구로 α-glucosidase enzyme 대신 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8)를 동량 분주하였다.
- 흰목이버섯 100 g을 분말로 파쇄한 후, 유산균을 1 × 107 CFU/ml로 접종하여 배양기(37℃)에서 72시간 동안 발효하였다. 각각의 유산균으로 발효한 흰목이버섯의 추출법은 추출 용매, 시간, 온도에 따른 최적의 추출 수율을 통해 선별하였으며(data not shown), 선별된 조건인 시료 부피 10배의 에탄올(EtOH)을 가하여 80℃에서 24시간 동안 추출하였다. 추출한 시료는 여과 후 감압 농축기(Eyela, Japan)로60℃에서 감압 농축을 하고, 동결 건조하여 얻은 추출물을 실험에 사용하였다.
- 6-well plate의 well 당 1.2×106 개의 3T3-L1 세포를10% BCS가 첨가된 DMEM 배지에 분주, 배양한 후 100%confluent 한 상태에서 MDI (0.25 μM dexamethasone (Sigma-Aldrich Co.), 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, Sigma-Aldrich Co.), 10 μg/ml의 insulin (Welgene Inc.)을 포함한 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco)가 첨가된 지방분화유도 DMEM 배지로 변경 후 37℃, 5% CO2 조건에서 72시간 동안 배양하였다.
- 24 well plate에 3T3-L1 전지방세포를 well 당 0.5 × 105 개씩 분주하고, confluent 된 상태에서 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 μg/ml의 농도의 흰목이버섯 추출물을 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 처리하였다.
- 시료 추출물은 100, 250, 500, 1000 μg/ml의 농도로 지방유도 배지 변경 시 동시에 처리하였다.
- 그 후, 동일 농도(10 μg/ml)의 insulin을 첨가한 10% FBS를 포함한 DMEM 배지로48시간 간격으로 변경하였다.
- 용해된 formazan은 96-well plate에 각 well 당 90 μl씩넣어 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율(% of Control)은 흰목이버섯 추출물을 처리하지 않은 3T3-L1 전지방세포를 대조군으로 하여 계산하였다.
- 지방세포로의 분화 후, 세포 내 지방구 생성 확인은 Oil red O 염색을 통해 실시하였다. 세포를 배양한 배지를 완전히 제거하고 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척한 후 4%formalin으로 10분간 세포를 고정하였다.
- 세포를 배양한 배지를 완전히 제거하고 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척한 후 4%formalin으로 10분간 세포를 고정하였다. 고정 후, deionized water로 세척하고 Oil red O를 넣어 실온에서 30분간 염색한 후 염색액을 제거하고 deionized water로 3회 세척하여 염색된 지방구를 microscopic image (Olympus, Japan)로관찰하였다. 그 후, 100% isopropyl alcohol를 가하여 염색된지방을 추출하고 microplate reader를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하여 정량 분석하였다.
- 고정 후, deionized water로 세척하고 Oil red O를 넣어 실온에서 30분간 염색한 후 염색액을 제거하고 deionized water로 3회 세척하여 염색된 지방구를 microscopic image (Olympus, Japan)로관찰하였다. 그 후, 100% isopropyl alcohol를 가하여 염색된지방을 추출하고 microplate reader를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하여 정량 분석하였다.
- 5, and 2 mM EDTA) (Bioseang, Korea)를 넣고 5분 간격으로 voltex하여 얼음에 30분간 방치하였다. 그 후 12,000 rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리하고 상등액을 취하여 SMARTTM bicinchoninic assay (BCA) protein assay kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 단백질 양을 정량하였다. 정량한 각 단백질lysate 100 μg을 취하여 SDS loading buffer와 섞고 95℃에서 3분간 반응시킨 후, 얼음에 넣고 10분간 방치하였다.
- 그리고 각각의 1차 항체를 4℃에서12시간 이상 반응시키고 PBS-T로 세척한 후, 1차 항체에 따른 2차 항체를 처리하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다.그 후, enhanced chemiluminoesence (ECL) solution을 처리하고, chemidoc을 이용하여 특정 단백질의 발현양을 분석하였다.
- 본연구에서는 유산 발효에 의한 흰목이버섯 추출물의 당뇨 억제 활성을 α-glucosidase assay를 통해 비교 분석하였다.
- NFTF와 FTF가 세포에 미치는 독성을 평가하기 위하여3T3-L1 전지방세포에 각 추출물을 0.1, 0.25, 0.5, 1 mg/ml의 농도로 처리한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과 NFTF와 FTF를 처리한 모든 농도에서 세포생존율에 영향을 미치지 않아, 모든 실험은 0.
- 5, 1 mg/ml의 농도로 처리한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과 NFTF와 FTF를 처리한 모든 농도에서 세포생존율에 영향을 미치지 않아, 모든 실험은 0.1, 0.25, 0.5, 1mg/ml 농도에서 진행하였다(Fig. 3).
- 흰목이버섯 추출물이 3T3-L1 전지방세포에서 지방분화유도를 통한 지방구 형성에 미치는 영향을 조사하기 위해 8일간 분화 유도 배지에 NFTF와 FTF를 0.25, 0.5, 1 mg/ml의 농도로 처리하였다(Fig. 4). MDI 처리를 통한 전지방세포의지방 분화 유도는 지질 성분에 특이적으로 반응하여 지방구만을 염색하는 Oil red O 시약을 사용하여 염색한 후 현미경 관찰을 통해 확인하였다.
- 4). MDI 처리를 통한 전지방세포의지방 분화 유도는 지질 성분에 특이적으로 반응하여 지방구만을 염색하는 Oil red O 시약을 사용하여 염색한 후 현미경 관찰을 통해 확인하였다. 그 결과, 미분화된 3T3-L1 전지방세포(normal)는 지방구의 형성이 거의 나타나지 않은 반면, 8일간 분화시킨 MDI 양성 대조군에서는 염색된 지방구의 수가 현저하게 증가되었음을 확인하였다(Fig.
- FTF에 의한 지방구 형성의 감소가 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 3T3-L1 전지방세포에서 세포 내 에너지 항상성 조절 인자인 p-AMPK 인산화와 지방 세포 분화에 관여한다고 알려진 insulin을 통해 활성화되는 Akt 단백질의 발현을 확인해보았다[41, 42].
- FTF에 의한 지방구 형성의 감소가 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 3T3-L1 전지방세포에서 세포 내 에너지 항상성 조절 인자인 p-AMPK 인산화와 지방 세포 분화에 관여한다고 알려진 insulin을 통해 활성화되는 Akt 단백질의 발현을 확인해보았다[41, 42]. 또한, 세포 분화에 관여한다고 알려진 JNK의 활성을 western blot을 통해 확인해보았다[43]. 그 결과, 미분화된 3T3-L1 전지방세포의 인산화된 AMPK 유전자 발현은 현저히 감소됨을 확인하였고 이에 비해 FTF을 0.
대상 데이터
- Acarbose, p-nitrophenyl β-D-glucoside (pNPG), sodium phosphate (monobasic, dibasic), α-glucosidase enzyme, dimethyl sulfoxide (DMSO), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone, oil-red-o staining solution은 Sigma-Aldrich Co. (USA)에서 구입하여 사용하였으며 insulin은 Welgene Inc. (Korea)에서 구매하여 사용하였다.
- phospho-AMPKα (Thr172), phospho-JNK (Thr183/Tyr185), phospho-Akt (Ser473), β-actin, anti-HRP rabbit 항체는 Cell Signaling Technology (USA)에서 구매하여 사용하였다.
- 본 연구에서 사용한 흰목이버섯은 (주)부농에서 국내산을 구입하였다. Acarbose, p-nitrophenyl β-D-glucoside (pNPG), sodium phosphate (monobasic, dibasic), α-glucosidase enzyme, dimethyl sulfoxide (DMSO), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone, oil-red-o staining solution은 Sigma-Aldrich Co.
- 본 연구에서 흰목이버섯의 발효를 위해 사용된 유산균은 전통 발효식품으로부터 스크리닝을 통해 분리한 Lactobacillus rhamnosus BHN 76을 사용하였다(Fig. 1). 유산균 배양 조건은 초기 균수 105 CFU/ml로 37℃에서 48시간 동안 MRS broth 배지에서 배양한 후, 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 3T3-L1 전지방세포는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 분양받아 사용하였다. 3T3-L1 세포는 10% bovine calf serum (BCS, Gibco,USA), 1 x antibiotics (Welgene Inc.
- 본 실험에서 사용한 발효하지 않은 흰목이버섯 추출물(Not fermented Tremella fuciformis; NFTF) 및 L. rhamnosus BHN-LAB 76 유산균 발효 흰목이버섯 추출물 (Fermented Tremella fuciformis; FTF)은 100 g의 흰목이버섯을 이용하였으며, 발효 전과 발효 후의 흰목이버섯으로부터 추출 수율을 확인하였다. 각 흰목이버섯 100 g으로부터 에탄올 추출후, 동결 건조한 결과 약 16.
데이터처리
- 각 그룹 간 평균은 SPSS (SPSS Inc., USA)를 이용한 비 모수적 Kruskal-Wallis 및 Mann-Whitney 분석을 사용하여 비교하였으며, p < 0.01 과 p < 0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- α-Glucosidase 저해 활성 측정은 Tibbot과 Skadsen의 방법에 따라 pNPG (p-nitrophenyl β-D-glucoside)에서 유리되어 나오는 반응 생성물(p-nitrophenol)을 측정하여 수행하였다[31].
- 유산균 발효 전과 발효 후 흰목이버섯 추출물의 3T3-L1세포에 대한 독성 평가는 세포에 의해 생성되는 formazan측정을 통한 tetrazolium bromide salt (MTT) assay를 이용하여 진행하였다. 24 well plate에 3T3-L1 전지방세포를 well 당 0.
성능/효과
- 본 실험에서 사용된 모든 실험은 3회 반복하여 진행하였으며, 결과 값은 mean ± standard deviation (SD)로 나타내었다.
- 또한, 모든 흰목이버섯 추출물은 양성대조구에 비해 현저히 증가된 α-glucosidase 억제 활성을 확인하였다(Fig. 2).
- 그결과, 양성대조구로서 사용된 acarbose (1 mg/ml)는 42.21 ± 1.03%의 α-glucosidase 억제 활성이 나타났으며, 동일한 농도 1mg/ml로 처리한 발효하지 않은 흰목이버섯 추출물(NFTF)과 L. rhamnosus BHN-LAB 76 유산균으로 발효한흰목이버섯 추출물(FTF)의 α-glucosidase 억제 활성은 64.83 ± 1.55%, 89.74 ± 1.16%로 유산 발효한 흰목이버섯 추출물은 발효하지 않은 흰목이버섯 추출물 대비 약 138% 배증가하는 것으로 나타났다.
- rhamnosus BHN-LAB 76 유산균 발효 흰목이버섯 추출물 (Fermented Tremella fuciformis; FTF)은 100 g의 흰목이버섯을 이용하였으며, 발효 전과 발효 후의 흰목이버섯으로부터 추출 수율을 확인하였다. 각 흰목이버섯 100 g으로부터 에탄올 추출후, 동결 건조한 결과 약 16.45 g과 21.65 g의 추출 분말을 확보하였으며, 추출 수율은 16.45%와 21.65%로 확인되어,유산균을 통한 발효 흰목이버섯의 추출 효율은 발효하지 않은 흰목이버섯 추출 수율 대비 약 31.6% 증가하는 것을 확인하였다(Table 1). 일반적으로 유산균을 통한 발효 시 다양한 유기산 및 아미노산 등의 대사산물이 생성되며 이러한 대사산물에 의해 pH의 감소에 따라 추출 효율이 증가한다고보고되었으며, 본 연구에서도 유산균 발효흰목이버섯 추출효율이 30% 넘게 증가하였다[32, 33].
- MDI 처리를 통한 전지방세포의지방 분화 유도는 지질 성분에 특이적으로 반응하여 지방구만을 염색하는 Oil red O 시약을 사용하여 염색한 후 현미경 관찰을 통해 확인하였다. 그 결과, 미분화된 3T3-L1 전지방세포(normal)는 지방구의 형성이 거의 나타나지 않은 반면, 8일간 분화시킨 MDI 양성 대조군에서는 염색된 지방구의 수가 현저하게 증가되었음을 확인하였다(Fig. 5A). 양성대조군에 비해, NFTF를 처리한 군에서는 미미하게 감소된지방구가 나타났으나, FTF를 처리한 군에서는 현저히 감소된 지방구를 확인하였고, 용해시킨 지방 축적도는 농도 의존적으로 p < 0.
- 양성대조군에 비해, NFTF를 처리한 군에서는 미미하게 감소된지방구가 나타났으나, FTF를 처리한 군에서는 현저히 감소된 지방구를 확인하였고, 용해시킨 지방 축적도는 농도 의존적으로 p < 0.05, p < 0.01 수준에서 감소하는 것을 확인하였다.
- 특히 FTF 1 mg/ml 농도로 처리한 군에서는 분화배지만을 처리한 군에 비해 현저히 감소된 지방구 형성을 확인하였으며(Fig. 5A), Oil-Red-O 염색약으로 염색된 지방구를100% isopropyl alcohol로 용해시켜 지방 축적도를 확인해본 결과, p < 0.01 수준에서 약 25% 지방 축적 감소를 확인하였다(Fig. 5B).
- 유산균을 통한 발효는 지방 분화 억제 효과를 가진 삼정환의 지방구 생성 억제효과를 더욱 증대시킨다고 보고하였다[40]. 이러한 결과로 미루어 볼 때, FTF는NFTF 보다 지방세포로의 분화 억제 활성이 탁월한 것으로 판단된다.
- 또한, 세포 분화에 관여한다고 알려진 JNK의 활성을 western blot을 통해 확인해보았다[43]. 그 결과, 미분화된 3T3-L1 전지방세포의 인산화된 AMPK 유전자 발현은 현저히 감소됨을 확인하였고 이에 비해 FTF을 0.1, 0.25, 0.5, 1 mg/ml의 농도로 처리한 경우 증가함을 확인하였다. 특히 FTF 1 mg/ml 농도로 처리한 군에서는 확연하게 증가한 AMPK의 발현을 확인하였다.
- 특히 FTF 1 mg/ml 농도로 처리한 군에서는 확연하게 증가한 AMPK의 발현을 확인하였다. 또한Akt 유전자 발현에서 FTF를 처리하지 않은 군에 비해 저농도(0.1, 0.25, 0.5 mg/ml)에서는 유의적인 차이를 보이지는 않았지만, 고농도(1 mg/ml)로 처리한 군에서는 현저하게 증가된 결과를 확인하였다. 추가적으로 JNK 유전자 발현을 통해 세포 분화에 미치는 영향을 확인해 본 결과, 미 분화된3T3-L1 전 지방세포에서는 어떠한 발현이 나타나지 않았지만, 분화 유도한 세포에서는 확연하게 증가된 양상을 확인하였으며, 발효 흰목이버섯 추출물을 처리한 군에서는 농도 의존적이지는 않았지만, 감소된 유전자 발현을 확인하였다(Fig.
- 본 연구에서는 인산화 되기 전 total form을 확인하지 못했으나, β-actin 대비 p-AMPK, p-JNK, p-Akt 수치 정량화를 통해 분석해 본 결과, FTF 처리 전 시료에 비해 각 인자들이 변화하는 것을 확인하였다(Fig. 6B).
- 6B). 이러한 결과를 통해 FTF를 처리한 군에서의 감소된 지방구 형성은 세포 내p-AMPK, p-JNK, p-Akt 유전자 발현을 억제함으로써, 지방세포로의 분화 및 세포 분화 유도에 관여하는 것으로 생각되어진다. Adipogenesis 억제는 AMPK의 활성화를 통한adipogenic transcription factors의 발현 감소가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며[44], Aspergillus oryzae로발효한 울금 주정 추출물에서의 지방 형성 억제 효과는AMPK의 mRNA 발현이 증대되는 것을 통해 나타난다고 보고하였다[45].
- 그 결과, 발효된 흰목이버섯 추출물은 발효하지 않은 추출물에 비해 α-glucosidase 저해 활성을 증가시키고, 3T3-L1 전지방 세포에서의 지방세포 분화 유도를통한 지방구 생성을 억제하는 것을 확인하였다.
- Adipogenesis 억제는 AMPK의 활성화를 통한adipogenic transcription factors의 발현 감소가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며[44], Aspergillus oryzae로발효한 울금 주정 추출물에서의 지방 형성 억제 효과는AMPK의 mRNA 발현이 증대되는 것을 통해 나타난다고 보고하였다[45]. 따라서, 유산균으로 발효한 흰목이버섯 추출물은 항비만 및 항당뇨 효과가 있을 것으로 판단되며, 건강기능식품으로 활용 및 발전 가능성을 확인하였다.
- 그 결과, 발효된 흰목이버섯 추출물은 발효하지 않은 추출물에 비해 α-glucosidase 저해 활성을 증가시키고, 3T3-L1 전지방 세포에서의 지방세포 분화 유도를통한 지방구 생성을 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 발효된 흰목이버섯은 지방 및 세포 분화 유도에 관여한다고 알려진 AMPK, Akt의 유전자 발현을 촉진하고, JNK의 발현을 억제하는 것을 통해 지방생성억제 및 항당뇨 활성이 증가됨을 확인하였다. 따라서 L.
- 5 mg/ml)에서는 유의적인 차이를 보이지는 않았지만, 고농도(1 mg/ml)로 처리한 군에서는 현저하게 증가된 결과를 확인하였다. 추가적으로 JNK 유전자 발현을 통해 세포 분화에 미치는 영향을 확인해 본 결과, 미 분화된3T3-L1 전 지방세포에서는 어떠한 발현이 나타나지 않았지만, 분화 유도한 세포에서는 확연하게 증가된 양상을 확인하였으며, 발효 흰목이버섯 추출물을 처리한 군에서는 농도 의존적이지는 않았지만, 감소된 유전자 발현을 확인하였다(Fig. 6A). 본 연구에서는 인산화 되기 전 total form을 확인하지 못했으나, β-actin 대비 p-AMPK, p-JNK, p-Akt 수치 정량화를 통해 분석해 본 결과, FTF 처리 전 시료에 비해 각 인자들이 변화하는 것을 확인하였다(Fig.
후속연구
- 이러한 결과로 미루어 볼 때, 유산균으로 발효한 흰목이버섯 추출물은 α-glucosidase 저해 활성을 증가시켜 당뇨 억제 활성을 촉진하는 것으로 판단되며, 추가 연구를 통해 유산균 발효 흰목이버섯 추출물의 항당뇨 활성을 확인해 볼 필요성이 있다고 판단된다.
- 이러한 발효된 흰목이버섯은 지방 및 세포 분화 유도에 관여한다고 알려진 AMPK, Akt의 유전자 발현을 촉진하고, JNK의 발현을 억제하는 것을 통해 지방생성억제 및 항당뇨 활성이 증가됨을 확인하였다. 따라서 L. rhamnosus BHN-LAB 76으로 발효한 흰목이버섯 추출물은 항비만 및 항당뇨 기능성 소재 및 식품 개발로의 활용이 가능할 수 있음을 제안한다.
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