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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 알코올에 대한 간 보호 효과가 우수할 것으로 예견되는 참나물 에탄올 추출물 투여가 흰쥐의 만성적인 알코올에 의한 간의 산화적 세포손상에 미치는 영향을 검토코자 하였다.
- 또한 참나물 에탄올 추출물 투여로 유리기 해독 효소의 일종인 catalase의 활성이 유의하게 감소된 것으로 보아 catalase가 비만에 의한 고지혈증 시 동맥경화증의 발생율이 증가한다는 사실[39]과 유리기가 동맥경화증의 발생에 상당한 관련이 있다는 보고[41]를 감안해 볼 때, 본 실험에서 혈청 중 지질 성분의 변동을 검토함은 의의가 있을 것으로 사료된다. 따라서 본 연구진은 참나물 에탄올 추출물이 고콜레스테롤 식이를 급여한 흰쥐의 혈청 중 지질 성상에 관한 연구도 수행하였는데, 참나물은 혈청 중 지질 성상에도 변화를 주어 고지혈증 예방효과가 있는 것으로 보고[28]하였다.
- 본 연구에서는 참나물의 항산화효과를 구명하기 위하여, in Mtro에서 Rancimat에 의한 항산화력 측정과 in vivo에서 Sprague Dawley 종 수컷에 게 만성적으로 알코올 과량 섭 취로 유도된 간조직의 산화적 스트레스가 참나물을 처리함으로써 간조직의 항산화 체계에 어떠한 영향을 미치는지를 비교 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 실험군은 정상군(NOR), 대조군(CON, 35% 알코올 10 ml/kg of b.
가설 설정
- 4)Means with different letters are significantly different (p<0.05).
제안 방법
- 시험관에 working buffer 700 pl, 5, 8"dithio-bis-2-nitrobenzoic acid 100 μ 1, 시료액 20 μ1 및 증류수 180 μ1를 가하여 30 ℃ 에서 3분간 방치한 후 GSSG 5 μ1를 첨가하고 412 nm에서 1분 동안 변화되는 흡광도를 측정하였다. GSH 함량은 GSH 표준액 1 UM, 2 gM, 3 jxM 및 4 μM을 상기와 같은 방법으로 측정하여 계산하였다.
- GSH 함량은 Tietze의 방법 [48]을 약간 변형 하여 측정 하였다. 간조직 0.
- 간조직 0.1 g과 10배의 5%(w/v) sulfosalicylic acid(SSA) 2 ml를 첨가하여 마쇄한 다음 10, 000x g에서 10분간 원심분리한 후 상징액을 GSH 함량 측정을 위하여 사용하였다. 시험관에 working buffer 700 pl, 5, 8"dithio-bis-2-nitrobenzoic acid 100 μ 1, 시료액 20 μ1 및 증류수 180 μ1를 가하여 30 ℃ 에서 3분간 방치한 후 GSSG 5 μ1를 첨가하고 412 nm에서 1분 동안 변화되는 흡광도를 측정하였다.
- 항산화지수(antioxi- dant index, AI)는 분획을 첨가한 실험구의 유도시간을 분획을 첨가하지 않은 대조구의 유도시간으로 나눈 값으로 구하였고, 모든 측정치는 3회 반복 시험하여 얻은 값의 평균치로 표시하였다. 기존의 상업용 합성항산화제인 butylated hy- droxytoluene(BHT)를 참나물 에탄올 분획들과 동일하게 유지에 첨가하여 비교 실험하였다.
- 5)를가하고 4℃에서 ultra turax homogenizerQanke & Kunkel, Germany)로 10, 000x g에서 마쇄한 후, 마쇄 액은 600x g 4℃ 에서 10분간 원심분리하여 핵과 미마쇄 부분을 제거한 다음 상징액을 15,000x g에서 20분간 다시 원심분리하였다. 상징액을 취하여 xanthine oxidase (XO), superoxide dismutase (SOD), catalase 및 glutathione peroxidase (GSH-Px) 활성 측정 을 위한 효소원으로 사용하였다. XO 활성은 Downey 방법[11], SOD 활성은 Crapo 등의 방법 [9], catalase 활성은 Aebi 방법 [1], GSH-Px 활성은 Flohe 등의 방법[15]으로 측정하였다.
- 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 실험군은 정상군(NOR), 대조군(CON, 35% 알코올 10 ml/kg of b.w../day), 참나물 에탄올 추출물 단독투여군(P1), 알코올과 참나물 에탄올 추출물 저용량(200 ㎎/㎏ of b.w./day) 병합투여군 (P2) 및 알코올과 참나물 에탄올 추출물 고용량(400 ㎎/㎏ of b.w./day) 병합투여군(P2)의 5군으로 나누어 6주간 사육하였다. In vitro 연구 결과는 참나물 에탄올 추출물을 계통 분획하여 Rancimat에 의한 항산화지수를 측정하였는데, 분획 중 n-hexane의 항산화력 이 가장 우수하였으며, 합성항산화제인 BHT와 항산화력이 비슷하였다.
- 참나물 에탄올 추출물 투여 용량은 예비 실험을 토대로 독성이 나타나지 않은 수준인 흰쥐 체중 kg 당 200 mg 과 400 mg이 함유되도록 생리식염수에 조제한 시료를, 알코올은 Fujji 등의 방법[1 기에 준하여 35% 알코올을 체중 kg 당 10 ml을 투여하였으며, 정상군은 동일한 양의 생리식염수를 6주간 경구 투여하였다. 실험기간 중 동물의 상태를 관찰하면서 체중은 1주일 간격으로, 식이섭취량은 2일 간격으로 측정하였고 사육기간의 체중증가량을 동일 기간의 식이 섭취량으로 나누어 각 실험군의 식이효율을 구하였다.
- 실험동물은 처치 전 18시간 동안 절식시킨 후 CO2로 가볍게 마취된 상태에서 단두 절단하여 채혈한 후 4, 500x g에서 20분간 원심분리한 다음 분리한 혈청을 ALT 및 AST 활성측정에 사용하였다. 혈액을 채취한 후 얼음위에서 즉시 간을 적출하여 0.
- 각 군당 8마리씩 5군으로 분류하였다. 실험식이는 AIN-93 을 기준43]으로 조제하였으며, 실험군은 정상군(NOR), 대조군(35% 알코올 10 ml/kg of b.w./day, CON, 알코올 투여군) 참나물 에 탄을 추출물(200 ㎎/㎏ of b.w./day) 단독투여군(Pl), 알코올과 참나물 에탄올 추출물 저용량(200 mg/ kg of b.w./day) 병합투여군(P2), 알코올과 참나물 에탄올 추출물 고용량(400 ㎎/㎏ of b.w./day) 병합투여 군(P3)으로 분류하였다. 흰쥐는 cage에 1마리씩 넣어 6주 동안 사육하였다.
- 조선대학교 실험동물센터에서 Sprague-Dawley계 웅성 흰 쥐를 공급받아 실험 전 1 주일간 고형 배합사료(삼양사료) 와 물로 적응시킨 후, 체중 90-130 g인 것을 난괴법 (randomized complete block design)에 의하여 Table 1과 같이 각 군당 8마리씩 5군으로 분류하였다. 실험식이는 AIN-93 을 기준43]으로 조제하였으며, 실험군은 정상군(NOR), 대조군(35% 알코올 10 ml/kg of b.
- 흰쥐는 cage에 1마리씩 넣어 6주 동안 사육하였다. 참나물 에탄올 추출물 투여 용량은 예비 실험을 토대로 독성이 나타나지 않은 수준인 흰쥐 체중 kg 당 200 mg 과 400 mg이 함유되도록 생리식염수에 조제한 시료를, 알코올은 Fujji 등의 방법[1 기에 준하여 35% 알코올을 체중 kg 당 10 ml을 투여하였으며, 정상군은 동일한 양의 생리식염수를 6주간 경구 투여하였다. 실험기간 중 동물의 상태를 관찰하면서 체중은 1주일 간격으로, 식이섭취량은 2일 간격으로 측정하였고 사육기간의 체중증가량을 동일 기간의 식이 섭취량으로 나누어 각 실험군의 식이효율을 구하였다.
- , USA)에 첨가하고 초음파(Ultrasonic processor, UCX-750, USA)를 이용하여 시료 추출물과 유지가 잘 혼합되도록 하였다. 항산화 지수의 측정 조건은 시료 3.0 g를 반응용기에 취하고 증류수 70 ml을 측정용기에 넣은 후 110℃에서 air flow rate를 20 1/hr 로 하여 산화 안정성을 비교하였다[13]. 항산화지수(antioxi- dant index, AI)는 분획을 첨가한 실험구의 유도시간을 분획을 첨가하지 않은 대조구의 유도시간으로 나눈 값으로 구하였고, 모든 측정치는 3회 반복 시험하여 얻은 값의 평균치로 표시하였다.
- 사용하였다. 혈액을 채취한 후 얼음위에서 즉시 간을 적출하여 0.9% 생리식염수로 남아 있는 혈액 및 기타 부착물질을 제거하고 여지로 수분을 제거한 후 효소 활성 저하를 예방하기 위하여 급속 동결하여 -70E의 deep freezer에 보관하면서 항산화 관련 효소 활성 및 항산화 능력 측정에 사용하였다.
대상 데이터
- 참나물(Pimpinella brachycarpa)은 2003년 4월 전남 나주시 소재 전라남도 농업기술원에서 재배한 전초를 수세하고 음건한 것을 분쇄한 후 시료로 사용하였다. 참나물 100 g과 80% 에탄올 500 ml를 혼합하여 blender(Braun MR 350, CA, USA)로 조분쇄하고 65℃에서 환류냉각기를 부착하여 3시간씩 3회 추출한 후 Whatman filter paper (No.
데이터처리
- 3)Values are mean + S.E. of 8 rats per each group and different superscripts in the same column indicate significance at p<0.05 between groups by Tukey's test.
- 본 실험에서 얻은 결과는 SPSS 통계 package를 이용하여실험군당 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원배치 분산분석 (one-way analysis of variance)을 한 후 p<0.05 수준에서 Tuke/s test에 의하여 각 실험군의 평균치간의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 상징액을 취하여 xanthine oxidase (XO), superoxide dismutase (SOD), catalase 및 glutathione peroxidase (GSH-Px) 활성 측정 을 위한 효소원으로 사용하였다. XO 활성은 Downey 방법[11], SOD 활성은 Crapo 등의 방법 [9], catalase 활성은 Aebi 방법 [1], GSH-Px 활성은 Flohe 등의 방법[15]으로 측정하였다.
- 과산화지질 함량은 Buege와 Aust의 방법 [5]에 의하여 측정하였다. TBA 시약(0.
- 단백질의 정 량은 Lowiy 등의 방법[33]에 의하여 bovine serum albuniin(Sigma, A-2153)을 표준물질로 하여 측정하였다.
- 항산화지수는 Joo 등의 방법[22]에 의하여 Rancimat (Metrohm 679, Herisan, Switzerland)을 이용하여 측정하였는데, 분획에 포함된 용매를 완전히 제거한 후 각 분획의 함량이 600 ppm이 되도록 soybean oil(Sigma Co., USA)에 첨가하고 초음파(Ultrasonic processor, UCX-750, USA)를 이용하여 시료 추출물과 유지가 잘 혼합되도록 하였다. 항산화 지수의 측정 조건은 시료 3.
- 혈청 aminotransferase 활성은 Reitman과 Frankel의 방법 [43]으로 조제된 혈청 transaminase 측정용 kit(Shinyang Co., Seoul, Korea)를 사용하여 ALT 및 AST 활성을 측정하였고, 단위는 혈청 ml 당 Karmen unit로 표시하였다.
성능/효과
- 6주간의 체중증가량은 Table 3과 같이 대조군은 정상군에 비하여 현저히 감소되었으나, 알코올과 참나물 에탄올을 병합 투여한 P2군과 P3군은 알코올 투여로 감소된 체중을 정상군에 근접토록 유의하게 증가시켰으나 투여 용량에 따른 변화는 나타나지 않았다. 식이섭취량의 경우도 알코올을 단독투여한 대조군이 다른 군에 비하여 유의하게 저하되었으나, 알코올과 참나물 에탄올 추출물을 용량별 병합투여한 P 2군과 P3군은 정상군에 가깝게 식이섭취량이 증가되었다.
- /day) 병합투여군(P2)의 5군으로 나누어 6주간 사육하였다. In vitro 연구 결과는 참나물 에탄올 추출물을 계통 분획하여 Rancimat에 의한 항산화지수를 측정하였는데, 분획 중 n-hexane의 항산화력 이 가장 우수하였으며, 합성항산화제인 BHT와 항산화력이 비슷하였다. In 沅如에서 항산화 효과를 측정한 결과는 정상식이만을 급여한 정상군과 정상식이와 참나물 에탄올 추출물을 단독투여 한 P1 군 간에는 유의차가 없었으나, 알코올을 투여한 군(대조군, P2 및 P3) 들간에는 유의차를 보였으며 특히, 고용량 병합투여 시 항산화 효과가 높게 나타났다.
- In vitro 연구 결과는 참나물 에탄올 추출물을 계통 분획하여 Rancimat에 의한 항산화지수를 측정하였는데, 분획 중 n-hexane의 항산화력 이 가장 우수하였으며, 합성항산화제인 BHT와 항산화력이 비슷하였다. In 沅如에서 항산화 효과를 측정한 결과는 정상식이만을 급여한 정상군과 정상식이와 참나물 에탄올 추출물을 단독투여 한 P1 군 간에는 유의차가 없었으나, 알코올을 투여한 군(대조군, P2 및 P3) 들간에는 유의차를 보였으며 특히, 고용량 병합투여 시 항산화 효과가 높게 나타났다. 즉 만성 알코올 투여로 감소되어진체중과 식이섭취량은 참나물 에탄올 추출물 병합투여로 정상식이군 수준으로 회복시켰다.
- 간 조직 중 GSH-Px 활성은 대조군이 120.43±18.85 unit로 정상군의 87.6U11.95 unit에 비하여 증가되었으나 참나물 에탄을 추출물 병합투여한 P2군은 98.06+10.40 unit, P3군은 96.51±11.95 unit로 유의하게 감소하였다. GSH-Px는 세포질과 사립체내에 존재하므로 사립체내에서 생성된 H2O2의 소거에 일차적으로 작용하며 km값이 낮기 때문에 H2O2 농도가 낮을 때에도 작용한다.
- 알코올 투여로 인하여 catalase 활성도가 증가된 것은 H2o2와 같은 free radical 생성이 증가되어 나타난 결과로 생각된다. 또한 참나물 에탄올 추출물 투여로 유리기 해독 효소의 일종인 catalase의 활성이 유의하게 감소된 것으로 보아 catalase가 비만에 의한 고지혈증 시 동맥경화증의 발생율이 증가한다는 사실[39]과 유리기가 동맥경화증의 발생에 상당한 관련이 있다는 보고[41]를 감안해 볼 때, 본 실험에서 혈청 중 지질 성분의 변동을 검토함은 의의가 있을 것으로 사료된다. 따라서 본 연구진은 참나물 에탄올 추출물이 고콜레스테롤 식이를 급여한 흰쥐의 혈청 중 지질 성상에 관한 연구도 수행하였는데, 참나물은 혈청 중 지질 성상에도 변화를 주어 고지혈증 예방효과가 있는 것으로 보고[28]하였다.
- 즉 만성 알코올 투여로 감소되어진체중과 식이섭취량은 참나물 에탄올 추출물 병합투여로 정상식이군 수준으로 회복시켰다. 또한 참나물 에탄올 추출물병합투여 시 알코올 투여로 증가된 간조직의 유리기 해독계효소인 XO, catalase 및 GSH-Px 활성 억제와 항산화 작용을 나타내는 GSH 함량을 증가시 킴으로서 지질과산화물에 대한방어력이 증가되었다. 이상의 결과 알코올과 참나물 에탄올 추출물을 병행 투여함으로서 항산화 효소 체계가 향상되었으며, 참나물 에탄올 추출물은 알코올 섭취로 유도된 산화적스트레스와 알코올성 독성으로부터 간을 보호하는 항산화 효과가 있는 것으로 추정된다.
- 38 unit로 활성이 감소되어 정상군의 수치에 근접하였다. 본 실험에서 알코올 투여로 ALT와 AST 활성이 증가되 었음은 Koo 등이 보고[27] 한 바와 같이 지질대사 장애로 간세포의 괴사 및 파괴가 진행됨에 따라 간 중의 aminotransferase가 혈중으로 유출된 결과로 판단되며, 참나물 에탄올 추출물이 알코올 투여로 증가된 AST 활성을 정상식이만을 급여한 정상군에 근접되게 감소시켰음은 참나물이 손상된 간세포 기능을 회복시킨 것으로 사료된다.
- 나타나지 않았다. 식이섭취량의 경우도 알코올을 단독투여한 대조군이 다른 군에 비하여 유의하게 저하되었으나, 알코올과 참나물 에탄올 추출물을 용량별 병합투여한 P 2군과 P3군은 정상군에 가깝게 식이섭취량이 증가되었다. 식이 효율은 실험군 간에 유의차가 나타나지 않았다.
- 또한 참나물 에탄올 추출물병합투여 시 알코올 투여로 증가된 간조직의 유리기 해독계효소인 XO, catalase 및 GSH-Px 활성 억제와 항산화 작용을 나타내는 GSH 함량을 증가시 킴으로서 지질과산화물에 대한방어력이 증가되었다. 이상의 결과 알코올과 참나물 에탄올 추출물을 병행 투여함으로서 항산화 효소 체계가 향상되었으며, 참나물 에탄올 추출물은 알코올 섭취로 유도된 산화적스트레스와 알코올성 독성으로부터 간을 보호하는 항산화 효과가 있는 것으로 추정된다.
- 항산화 지수는 n-hexane 분획이 1.98로 가장 높게 나타났으며, ethylacetate 분획 이 1.29, chlorofonn 분획 이 1.09, n-butanol 분획이 1.07 및 water 분획 이 1.02로 대조구의 항산화지수 1.00보다 높은 활성을 나타냈으며, 특히 n-hexane 분획의 활성이 가장 높아 기존의 항산화제인 BHT와 유사한 활성을 나타냈다. 본 실험에서 참나물 에탄올 추출물의 전 분획에서 대조 구보다 높은 항산화활성을 나타냈는데 이는 참나물 에탄올 추출물에 항산화활성을 나타내는 물질이 다량 함유되어 있는 것으로 판단되며 우수한 항산화제로의 개발이 기대된다.
- 혈청 중 AST 활성은 P1 군이 61.30+7.23 uWt로 정상군의 64.90±5.35 unit와 유사하였으나 알코올만을 단독 투여한 대 조군은 84.08±6.95 unit로 정상군에 비하여 유의하게 증가되었고, 알코올과 참나물 에탄올 추출물 저용량 병합투여한 P2 군은 80.01 ±4.50 unit로 유의적인 변화를 나타내지 않았으나, 고용량 병합투여한 P3군은 67.42±3.38 unit로 활성이 감소되어 정상군의 수치에 근접하였다. 본 실험에서 알코올 투여로 ALT와 AST 활성이 증가되 었음은 Koo 등이 보고[27] 한 바와 같이 지질대사 장애로 간세포의 괴사 및 파괴가 진행됨에 따라 간 중의 aminotransferase가 혈중으로 유출된 결과로 판단되며, 참나물 에탄올 추출물이 알코올 투여로 증가된 AST 활성을 정상식이만을 급여한 정상군에 근접되게 감소시켰음은 참나물이 손상된 간세포 기능을 회복시킨 것으로 사료된다.
후속연구
- 00보다 높은 활성을 나타냈으며, 특히 n-hexane 분획의 활성이 가장 높아 기존의 항산화제인 BHT와 유사한 활성을 나타냈다. 본 실험에서 참나물 에탄올 추출물의 전 분획에서 대조 구보다 높은 항산화활성을 나타냈는데 이는 참나물 에탄올 추출물에 항산화활성을 나타내는 물질이 다량 함유되어 있는 것으로 판단되며 우수한 항산화제로의 개발이 기대된다.
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