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문제 정의
- 바 없다. 따라서, 본 연구에서는 최근 고급 식용 산채로서 각광받고 있는 참나물의 메탄올 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물을 조제하고 이들의 항산화, 항균 및 대장암세포 생육억제 활성을 평가하고자 하였으며, 그 결과 ethylacetate 분획에서 광범위한 항세균 활성과 항산화 활성을, n-hexane및 methylene chloride 분획에서 우수한 nitrite 소거능을, butanol 분획에서 우수한 대장암세포 생육 억제 활성을 확인하였기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 분획물 제조를 위해서는, 메탄올 주줄물을 물에 현탁한 후 n-hexane, methylene chloride, ethylacetate 및 butanol 을 이용하여 순차적으로 분획하고 최종적으로 물 잔류물을 회수하였으며 (15) , filter paper (Whatsman No 2)로 거른 후 다시 감압 건조하여 분말화 하였다. 각각의 시료 분말은 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 에 녹인 후, 적당한 농도로 희석하여 항균, 항산화, 및 대장암세포 생육억제 활성 평가에 사용하였다. 기타 사용한 시 약은 시 약급 이상으로 Sigma Co (St.
- USA)를 이 용하여 동일한 방법으로 30℃에서 24시간 동안 배양 후 생육 저 지환의 크기를 측정하여 항균활성을 평가하였다(19). 대조 구로는 항세균제인 ampicillin과 항진균제인 miconazole (Sigma Co, St. Louis, MO, USA) 을 각각 1 ug/disc 농도로 사용하였으며, 생육저지환의 크기는 육안으로 생육이 나타나지 않는 부분의 지름을 mm 단위 로 측정 하였고, 3회 이 상 평가 후 대표 결과로 나타내었다(20).
- 한편 항진균 활성 평 가를 위해서는 Saccharomyces cerevisiae IF0 0233 및 캔디다증 진균 감염증 원인균 Candida albicans KCTC 1940를 사용하였다(17, 18). 먼저, 항세균 활성 평 가의 경우, Nutrient broth (Difco Co, Detroit, MI, USA) 에 각각의 세균을 접종하여 37 ℃ 에서 24시간 동안 배양한 후 각 균주를 OD값이 0.1 이 되도록 조정하여 Nutrient agar 배지를 포함하는 멸균 petri dish (90x15 mm, 녹십자, 한국)에 100 11L 도말하고, 각각의 시료 5 11L를 멸균 disc-paper (지름 6.5 mm, Whatsman No 2)에 가하여 37 ℃ 에서 24시간 동안 배양하였으며, 진균 의경 우에는 Saboraud dextrose 배지 (Difco Co. USA)를 이 용하여 동일한 방법으로 30℃에서 24시간 동안 배양 후 생육 저 지환의 크기를 측정하여 항균활성을 평가하였다(19). 대조 구로는 항세균제인 ampicillin과 항진균제인 miconazole (Sigma Co, St.
- 이후 추출액은 filter paper (Whatsman No 2)로 거른 후 감압 농축(Eyela Rotaiy evaporator N-1000, Tokyo Rikakikai Co, LTD, Tokyo, Japan)하였다. 분획물 제조를 위해서는, 메탄올 주줄물을 물에 현탁한 후 n-hexane, methylene chloride, ethylacetate 및 butanol 을 이용하여 순차적으로 분획하고 최종적으로 물 잔류물을 회수하였으며 (15) , filter paper (Whatsman No 2)로 거른 후 다시 감압 건조하여 분말화 하였다. 각각의 시료 분말은 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 에 녹인 후, 적당한 농도로 희석하여 항균, 항산화, 및 대장암세포 생육억제 활성 평가에 사용하였다.
- Louis, MO, USA)> 가하고 혼합하였다. 이후 15분간 실온에서 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 nitrite 양을 측정하였다. NSA(%)는 다음의 식에 의해 계산하였다 [21].
- 인간유래 대장암세포 HCT-116 세포주의 배양 및 계대에는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco-BRL Inc., USA)를 사용하였으며, 10% Fetal Bovine Serum (Gibco- BRL Inc., USA), 1% penicillin 및 streptomycin (WelGene Inc., Daegeon, Korea)을 첨가하여 사용하였다(22). 한편 조제된 참나물 메탄올 추출물 및 이의 분획물들이 HCT-116 세포주의 생육에 미치는 영향은 One solution cell proliferation assay kit (Promega, USA) 을 이용하여 평 가하였다(22).
- 한편 조제된 참나물 메탄올 추출물 및 이의 분획물들이 HCT-116 세포주의 생육에 미치는 영향은 One solution cell proliferation assay kit (Promega, USA) 을 이용하여 평 가하였다(22). 즉, 96 well plate에 well당 3><103개의 세포를 접종하고 24시간 배양한 후 다양한 농도의 참나물 추출물 및 분획물을 각각 처리하고 24시간 동안 반응시킨 후, 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxphenyl) -2-(4-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium (MTS; Promega, USA) 용액을 각 weU 당 20 pL씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 4시간 동안 반응 시켰으며, 반응 종료 후 96 well plate reads- (Expert 96 UV ASYS Hitech, Austria) 를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 성장률을 계산하였다. 결과 수치는 4개의 독립적인 weU 에서 수행한 값을 평균과 편차 값으로 나타내었으며, 50% 성장억제를 나타내는 농도를 IGo로 표시하였다 (23).
- 참나물 추출물 및 이의 분획물의 항산화 활성은 DPPH (1, 1 -diphenyl-2-picryl hydrazyl) 음이온 소거 능, ABTS [2, 2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonate)] 양이온 소거능, nitrite 소거능 및 환원력 측정으로 평가하였다(21). 먼저 DPPH 음이온 소거능 측정의 경우, 다양한 농도로 희석한 시료 20 pL에 99.
- , Daegeon, Korea)을 첨가하여 사용하였다(22). 한편 조제된 참나물 메탄올 추출물 및 이의 분획물들이 HCT-116 세포주의 생육에 미치는 영향은 One solution cell proliferation assay kit (Promega, USA) 을 이용하여 평 가하였다(22). 즉, 96 well plate에 well당 3><103개의 세포를 접종하고 24시간 배양한 후 다양한 농도의 참나물 추출물 및 분획물을 각각 처리하고 24시간 동안 반응시킨 후, 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxphenyl) -2-(4-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium (MTS; Promega, USA) 용액을 각 weU 당 20 pL씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 4시간 동안 반응 시켰으며, 반응 종료 후 96 well plate reads- (Expert 96 UV ASYS Hitech, Austria) 를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 성장률을 계산하였다.
- 환원력 평가는 Oyaizu등의 방법(15)을 변형하여 측정하였다. 에탄올에 용해한 시료 2.
- 5 mL를 첨가하여 반응을 종료하고 4000 X g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 증류수로 2배 희석한 후, 신선하게 조제된 0.1% ferric chloride 용액과 5:1 (v/v) 비율로 혼합하고 700 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 상기의 항산화 실험에서 대조구로는 vitamin C를 사용하였으며, 용매 대조 구로는 DMSO를 사용하였다.
대상 데이터
- 1% ferric chloride 용액과 5:1 (v/v) 비율로 혼합하고 700 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 상기의 항산화 실험에서 대조구로는 vitamin C를 사용하였으며, 용매 대조 구로는 DMSO를 사용하였다. 각각의 활성 평가는 각각 3회 이상 반복한 실험의 평균과 편차로 표시하였으며, 소거능 평가에서 50%의 소거능이 나타나는 시료 농도를 IC5o (Inhibitory Concentration 50)로 나타내었다(21).
- 실험에 사용한 참나물은 경북 안동에서 2010년 6월 재배한 시료로, 참나물 12 kg을 3일간 음건한 후, 추출에 적합하도록 절단한 후 10배 부피의 메탄올(Daejung Chemicals & Metals Co, LTD, Sihyung, Kyunggi, Korea) 을 가하여 상온에서 3회 주줄하였다. 이후 추출액은 filter paper (Whatsman No 2)로 거른 후 감압 농축(Eyela Rotaiy evaporator N-1000, Tokyo Rikakikai Co, LTD, Tokyo, Japan)하였다.
- 참나물의 항균 활성을 평가하기 위해 그람 음성균으로 Escherichia coli KCTC 1682, Pseudomonas aeruginosa KACC 10186, Proteus vulgaris KCTC 2433, Salmonella typhimurium KCTC 1926을, 그람 양성균으로는 Bacillus subtilis KCTC 1924, Listeria monocytogenes KACC 10550, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus KCTC 1916을 사용하였다. 한편 항진균 활성 평 가를 위해서는 Saccharomyces cerevisiae IF0 0233 및 캔디다증 진균 감염증 원인균 Candida albicans KCTC 1940를 사용하였다(17, 18).
- KCTC 1916을 사용하였다. 한편 항진균 활성 평 가를 위해서는 Saccharomyces cerevisiae IF0 0233 및 캔디다증 진균 감염증 원인균 Candida albicans KCTC 1940를 사용하였다(17, 18). 먼저, 항세균 활성 평 가의 경우, Nutrient broth (Difco Co, Detroit, MI, USA) 에 각각의 세균을 접종하여 37 ℃ 에서 24시간 동안 배양한 후 각 균주를 OD값이 0.
이론/모형
- 총 플라보노이드의 함량 측정은 기존에 보고한 방법 (16) 에 따라 측정하였으며, 5 mg/mL 농도가 되도록 조제 한 각각의 추출물 및 분획물 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고 여과한 주줄 검액 400 pL 에 90% diethylene glycol 4 mL를 첨 가하고 다시 1 N NaOH 40 yL를 넣고 37 ℃ 에서 1시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시 약으로는 rutin을 사용하였다.
- 표준시 약으로는 tannic acid를 사용하였다. 한편 종당은 phenol-sulfuric acid법(15)을 이용하여 정 량하였으며, 환원당은 dinitrosalicylic acid 변법(15)을 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- 생육 억제 활성을。, 25, 50, 100 및 2如 ug/mL 농도에서 평가한 결과, 메탄올 추출물 및 n-hexane 분획은 실험농도 범위에서 암세포 생육에 영향을 주지 않았으며, butanol 분획 및 물 분획물은 암세포 생육을 저해하였다. 특히 butanol 분획은 농도 의존적으로 강력한 생육저해를 나타내었으며, 100 및 200 H g/mL 농도에서 각각 57% 및 46%의 세포성장을 나타내었으며, IC50는 166 ug/mL으&로 계산되었다(Fig.
- 2b). Nitrite 소거 능의 경우, 메탄올 주줄물, n-hexane 분획, methylene chloride 분획, ethylacetate 분획, butanol분획 및 물 잔류물이 각각 100 Ug/mL 농도에서 42%, 58%, 60%, 47%, 34% 및 10% 소거 능을 나타내어, 참나물이 다양한 지용성 및 수용성 성분의 nitrite 소거물질을 함유하고 있음을 알 수 있었다(Fig. 2c). 한편 대조구로 사용된 vitamin C는 25 yg/tnL 농도에서 87% 소거능을 나타내었다.
- 반면 n-hexane 분획 및 물 잔류물에서는 상대적으로 매우 낮은 함량을 보였다. 건강식품으로 알려진 마 및 체리의 주줄물에서도 종 폴리페놀 함량은 ethylacetate 분획에서 가장 높게 나타났으며, 마는 48.3 mg/g(15), 체리는 52.47 mg/g(16)을 나타낸 결과와 비교하면 참나물 메탄올 주줄물의 ethylacetate 분획이 상당히 높은 총 폴리페놀 함량을 나타냄을 알 수 있다. 총 플라보노이드 함량 역시 ethylacetate 분획 에서 가장 높은 함량을 나타내었으며, 총폴리 페놀 분석결과와 유사한 양상을 나타내었다.
- 2a에 나타내었다. 대조구로 사용된 vitamin C의 경우 25 yg/mL 농도에서 65% DPPH 소거능을 나타내어 강력한 항산화능을 확인하였다. 참나물 시료 중에서는 ethylacetate 분획물이 500 u g/mL 농도에서 82% DPPH 소거능을 나타내어 가장 우수한 소거 능을 나타내 었으며 , butan이분획 은 동일농도에서 45% 소거능을 나타내었다.
- Table 2에 나타내었다. 대조구로 사용된 항생제 ampicillm 및 miconazolee 실험균주들에 대해 10.0~34.0 mm의 생육억제환을 나타내어 우수한 활성을 나타내 었다. 참나물 메탄올 추출물 및 n-hexane 분획물은 실험에 사용한 4종의 그람 양성균에 모두 항균활성을 나타낸 빈-면, methylene chloride 분획, ethylacetate 분획은 B.
- 항진균 활성의 경우, methylene cHoride 분획, ethylacetate 분획 및 butanol 분획에서만 활성이 나타났다. 따라서 그람양성세균의 제어에는 참나물의 n-hexane 분획이, 그람음성세균의 제어에는 efhylacetate 분획이 효과적임을 알 수 있었다(Table 2).
- 메탄올 추출물의 순차적 분획 수율 및 이들의 성분 분석결과는 Table 1에 나타내었다. 메탄올 주줄 물로부터 n-hexane, methylene chloride, ethylacetate 및 butanol을 이용한 분획물의 수율은 각각 18.71%, 0.7%, 0.56%, 및 4.57%이었으며, 최종적으로 물 잔류물은 71.51% 로 나타났다. 한편 총 폴리페놀 분석 결과 ethylacetate 분획이 200 mg/g으로 가장 높은 함량을 보였으며, methylene chloride 분획, butanol 분획 에서 각각 92.
- 그 연구는 전 세계적으로 미미한 상태이다. 본 연구에서는 최근 고급 식용 산채로서 각광받고 있는 참나물의 메탄올 추출물을 조제하고, 이로부터 n-hexane, methylene chloride, ethylacetate 및 butanol을 이용하여 순차적 유기용매 분획물과 물 잔류물을 조제하여 각각의 항산화, 항균 및 대장암세포 생육억제 활성을 평가하였다’ 참나물 메탄올 추출물의 71.51 %는 물 잔류물로 이행되어 추줄물 대부분이 수용성 물질이었으며, 『hexane, methylene chloride, ethylacetate 및 butanol 분획 효율은 각각 18.71, 0.7, 0.56, 및 4.57%로 나타났다. 총 플라보노이드 및 총 폴리페놀 함량은, 분획수율이 가장 낮은 ethylacetate 분획에서 가장 높았으며 물 잔류물에서 가장 낮았다.
- 실험에 사용된 참나물의 수분함량은 87.3%이었으며, 메탄올 추출수율은 약 4.13%이 었다. Lee 등(11)의 경우 80% 에탄올을 용매로 사용한 경우 추출 수율이 12.
- 0 mm의 생육억제환을 나타내어 우수한 활성을 나타내 었다. 참나물 메탄올 추출물 및 n-hexane 분획물은 실험에 사용한 4종의 그람 양성균에 모두 항균활성을 나타낸 빈-면, methylene chloride 분획, ethylacetate 분획은 B. subtilise 대해서는 항균활성이 나타나지 않았으며, butanol 분획은 B. sMbtilis와 S. wrews에 대해 항균활성이 나타나지 않았다. S.
- 대조구로 사용된 vitamin C의 경우 25 yg/mL 농도에서 65% DPPH 소거능을 나타내어 강력한 항산화능을 확인하였다. 참나물 시료 중에서는 ethylacetate 분획물이 500 u g/mL 농도에서 82% DPPH 소거능을 나타내어 가장 우수한 소거 능을 나타내 었으며 , butan이분획 은 동일농도에서 45% 소거능을 나타내었다. 그 외 분획물들의 DPPH 소거 능은 매우 미 약하였다世ig.
- 57%로 나타났다. 총 플라보노이드 및 총 폴리페놀 함량은, 분획수율이 가장 낮은 ethylacetate 분획에서 가장 높았으며 물 잔류물에서 가장 낮았다. 항균 활성 평가결과, ethylacetate 분획에서 그람양성 및 그람음성세균에 대해 광범위한 항균 활성을 나타내었으며, 특히 그람 양^세균에는 n-hexane 분획 이, 그람음성세균에는 ethylacetate 분획 이 효과적 이 었다.
- 47 mg/g(16)을 나타낸 결과와 비교하면 참나물 메탄올 주줄물의 ethylacetate 분획이 상당히 높은 총 폴리페놀 함량을 나타냄을 알 수 있다. 총 플라보노이드 함량 역시 ethylacetate 분획 에서 가장 높은 함량을 나타내었으며, 총폴리 페놀 분석결과와 유사한 양상을 나타내었다. 총당 의경 우 n-hexane, methylene cHoride 및 ethylacetate 분획 에서 438~475 帽g의 높은 함량을 나타내었으며, 물 잔류물에 이어 butanol 분획에서 275 mg/g으로 가장 낮은 함량을 보였다.
- 총 플라보노이드 함량 역시 ethylacetate 분획 에서 가장 높은 함량을 나타내었으며, 총폴리 페놀 분석결과와 유사한 양상을 나타내었다. 총당 의경 우 n-hexane, methylene cHoride 및 ethylacetate 분획 에서 438~475 帽g의 높은 함량을 나타내었으며, 물 잔류물에 이어 butanol 분획에서 275 mg/g으로 가장 낮은 함량을 보였다. 그러나 환원당 측정의 경우 물 잔류물이 가장 높은 349 m잉g-fraction을 보였으며, 이어 ethylacetate 분획에서 305 mg/g-fraction을 나타내었다.
- 암세포 생육을 저해하였다. 특히 butanol 분획은 농도 의존적으로 강력한 생육저해를 나타내었으며, 100 및 200 H g/mL 농도에서 각각 57% 및 46%의 세포성장을 나타내었으며, IC50는 166 ug/mL으&로 계산되었다(Fig. 3). 한편 methylene chloride 분획은 농도증가에 따라 암세포 성장을 촉진하였으며, 특히 100 및 200 pg/mL 농도에서 각각 148% 및 135% 의 세포성장을 나타내었다.
- 51% 로 나타났다. 한편 총 폴리페놀 분석 결과 ethylacetate 분획이 200 mg/g으로 가장 높은 함량을 보였으며, methylene chloride 분획, butanol 분획 에서 각각 92.84, 72.66 mg/g을나타내었다. 반면 n-hexane 분획 및 물 잔류물에서는 상대적으로 매우 낮은 함량을 보였다.
- 분획물의 대부분을 차지하는 물 잔류물은 그람양성세균뿐만 아니라 그람음성세균및 진균에 대해 전혀 항균활성을 나타내지 않았다. 한편 그람음성세균에 대한 항균력 평가 결과, 물 분획물을 제외한 모든 시료에서 S. 0沥沥小에만 우수한 항균력이 인정되 었으며, 특히 ethylacetate 분획은 사용된 4종의 그람음성균 모두에 우수한 활성을 나타내었다. 참나물의 ethylacetate 분획의 경우 그 수율은 매우 낮지만, 제어가 어렵다고 알려진 E.
- 총 플라보노이드 및 총 폴리페놀 함량은, 분획수율이 가장 낮은 ethylacetate 분획에서 가장 높았으며 물 잔류물에서 가장 낮았다. 항균 활성 평가결과, ethylacetate 분획에서 그람양성 및 그람음성세균에 대해 광범위한 항균 활성을 나타내었으며, 특히 그람 양^세균에는 n-hexane 분획 이, 그람음성세균에는 ethylacetate 분획 이 효과적 이 었다. 항산화 활성 의 경우 ethylacetate 및 butanol 분획에서 양호한 DPPH 및 ABTS 소거능, 환원력을 나타내었으며, n-hexane및 methylene chloride 분획에서 우수한 nitrite 소거능을 나타내었다.
후속연구
- 한편 butanol 분획에서는 다른 분획과는 달리 우수한 인간 대장암세포 생육억제 활성을 나타내었다. 본 연구 결과는 참나물을 이용한 기능성 식품개발 및 ethylacetate 분획을 대상으로 한 유용 소재개발의 기본 자료로 활용될 것이다.
- 이는 세포생육 저해인자와 이를 방해하는 성분의 혼재로 인해 나타나는 현상으로 이해된다. 본 연구의 참나물 추출물의 경우 기존의 보고한 마(15), 체리(旧와 같이 다양한 유기용매 분획물에서 각각 다양한 생리활성이 확인되어 고급산채인 참나물이 다양한 우수활성을 가지고 있음을 증명하였으며, 본 연구결과는 참나물을 이용한 기능성 식품 제조의 기본자료로 이용될 것이다.
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