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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 하향주 제조에 이용되고 있는 누룩으로부터 젖산균을 분리, 동정하여 그 특성을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 1차적으로 분리된 젖산균의 산생성능을 측정하여 산 생성이 비교적 우수한 균을 다시 분리한 다음 전통주 발효에 적합한 균을 선별하기 위하여 pH 4.0 및 에탄올 10%에서 생육이 저해되면서 산생성이 우수한 균주를 최종 선별하였다.
- 0단위로 조정하여 비교하였다. 그리고 알코올에 대한 내성을 조사하기 위해 배지의 ethanol농도를 2, 4, 6, 8, 10 및 12% 되게 조정한 후 24시간 배양하여 spectrophotometer (Ultraspec 2100 pro Amersham biosciences Co., Sweden)를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하여 균의 생육도를 조사하였다.
- 또한 API 50 CHL kit(Bio Nferieux Co., Rance)을 이용하여 당으로부터 산생성 시험을 수행하였으며, 보다 정확한 동정을 위해 분리 균주의 chromosomal DNA를 분리한 후 16S rDNA sequencing에 사용되는 Universal primer인 27F primer(5'- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3')와 1492R primer (5, - GGT TAC CTT GIT ACG ACT T 3)를 이용하여 PCR 증폭 후 증폭된 PCR 산물을 솔젠트사에 의뢰하여 Applied Biosystems사의 3730XL Capillary DNA Sequencer 를 이용하여 염기서열을 분석하였고, 분석된 염기서열을 이용하여 NCBI의 blast search를 통해 상동성을 조사하여 분리된 젖산균을 동정하였다.
- 발효특성 조사를 위해 배양 온도를 2(045℃까지 5℃단위로 조정하여 산생성능을 비교하였고, 발효 초기 pH에 대한영향을 알아보기 위하여 초기 pH를 4.0-7.0까지 1.0단위로 조정하여 비교하였다. 그리고 알코올에 대한 내성을 조사하기 위해 배지의 ethanol농도를 2, 4, 6, 8, 10 및 12% 되게 조정한 후 24시간 배양하여 spectrophotometer (Ultraspec 2100 pro Amersham biosciences Co.
- 분리 젖산균의 동정을 위해 각 균주의 partial 16S rDNA sequencing 결과를 NCBI의 blast search# 통해 상동성을 조사하였다(Table 4). 그 결과 L-3 균주는 Lactobacillus plantarume- Primer(27F)에서 98%, Primer(1492R)에서 99%의 상동성을 나타내었고, L-10 균주는 Lactobacillus Sakei와 98%의 상동성을 나타내었다.
- 분리된 5개 균주의 발효 초기 pH가 산생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 pH를 4.0, 5.0, 6.0, 7.0으로 조정한 MRS배지에 각각의 균을 접종하여 30℃에서 24시간 발효시켰다. 그 결과 Kg.
- 분리된 젖산균의 산생성능 측정은 Lee 등(15)의 방법을 응용하여 측정하였다. -80℃에서 보관한 젖산균을 이용하여 24시간 전배양한 후 Lactobacilli MRS broth에 접종하여 30℃에서 24시간 배양하였다.
- 1 로 나타났다. 이 결과를 바탕으로 양조학적 특성 이 양호하다고 판단되는 L-3, 8, 10, 11, 12균주를 최종 분리하여 동정을 하였다.
- 배양하였다. 젖산균 분리배지로는 bromocresol purple(BCP) 0.02%를 함유한 Lactobacilli MRS agar(Difco Co., USA)배지를 사용하였으며 산의 생성으로 인해 황색으로 변하는 집 락을 젖산균으로 판단하고 1차적으로 분리하였고, 분리한 젖산균은 2회 이상 계대 배양을 통해 순수분리한 후 20% glycerol에 현탁하여 -80℃에서 보관하면서 사용하였다(16, 17).
- 하향주 제조용 누룩으로부터 분리된 젖산균의 동정을 위해 현미경으로 균의 형태와 운동성을 관찰하였고, oxidase, catalase test, glucose로부터 gas 생성유무, indole 생성능 및 gelatin 액화능 등의 생리적 특성과 배양온도, pH 그리고 NaCl의 영향에 따른 배양학적 특성을 분석하였다. 또한 API 50 CHL kit(Bio Nferieux Co.
- 하향주 제조용 누룩으로부터 젖산균을 분리하기 위해 분쇄한 누룩 1 g을 멸균수에 현탁하고 1V까지 단계 희석하여 희석액 100μL를 젖산균 분리배지에 도말하여 acre에서 2일간 배양하였다. 젖산균 분리배지로는 bromocresol purple(BCP) 0.
- 하향주의 제조에 이용되는 누룩으로부터 젖산균을 분리하고, 배양학적 특성과 생리적 특성을 검토하였다. 분리된 총 11균주를 이용하여 알코올 10%오+ pH 4.
대상 데이터
- 15-20일 정도 자연 발효시켜 제조하였다. 발효가 완료된 누룩은 일광 건조 후 밀봉하여 냉장보관 하면서 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 누룩은 하향주 기술전수자가 직접 제조한 누룩으로 통밀을 지하수에 침지시킨 후 물을 빼고 분쇄하여 사각틀에 넣고, 가로와 세로가 약 18 cm, 두께 가약 3 cm되게 성형하여 발효실에서 발효 초기는 30-35 ℃, 중기 35-40℃이하, 말기에는 30℃전후로 온도를 조절하여 약 15-20일 정도 자연 발효시켜 제조하였다. 발효가 완료된 누룩은 일광 건조 후 밀봉하여 냉장보관 하면서 실험에 사용하였다.
- 젖산균의 분리원으로는 현재 하향주의 제조에 이용되고 있는 누룩을 사용하였고, 젖산균의 배양에는 Lactobacilli MRS(Difco Co., USA)배지를 Gram 염색에는 Bactident Aminopeptidase(Merck Co., USA)를 이용하였다. 그 밖의 모든 시 약은 특급 제품을 사용하여 분석하였다.
- 하향주 제조용 누룩으로부터 bromocresol purple (BCP) 이 포함된 MRS plate상에서 산을 생성하여 집 락주위가 노란색으로 변색되는 균주를 젖산균으로 추정하고 1차 분리하였고, 분리된 균을 대상으로 산생성능을 측정하여 산 생성이 우수한 II균주를 선별하여 실험에 사용하였다. 양조학적으로 적합한 젖산균은 알코올 10%와 pH 4.
성능/효과
- 알코올 농도를 2, 4, 6, 8, 10, 12%로 조정하여 알코올 농도에 따른 젖산균의 생육도를 조사한 결과,Fig. 3에서처 럼 알코올농도 4%까지는 거의 감소되지않았지만 6% 부터 급격하게 감소되기 시작하여 L curvatus L-8, 11, 12는 8% 알코올에서 생육도가 약 98% 감소하였고, L-10은 87%, L-3은 67% 감소되어 L-3이 8% 알코올에서 가장 높은 산을 생성하였다. 10% 알코올에서는 5개의 균주 모두가 산을 거의 생성하지 못하는 것으로 나타났는데, Lee 등(15)이 한국 전통 누룩에서 분리한 젖산균이 10% 알코올에서도 산생성능을 15-30% 유지한다고 보고한 것과는 다소 차이가 있었으며, 본 연구에서 분리된 균주가 전통주 발효 시 젖산종균으로의 이용가능성이 있다고 사료된다.
- , USA)를 이용하여 gram 염색성을 확인한 결과 모두 G(+)로 나타났다. Catalase와 oxidase는 음성 이 었고, indole 생성능과 gelatin 액화능이 없으며, arginine으로부터 ammonia를 생성하지 못하고 glucose로부터 gas 생성이 없는 것으로 보아 동형젖산발효를 하는 것으-로 나타났다. L3, 8, 11, 12 균주는 10℃ 이하와 45℃ 이상의 온도에서는 생육하지 못하였으며, L-10 균주는 40℃에서 생육을 하지 못하여 생육 온도의 범위가 좁게 나타났다.
- L-8, 11, 12균주는 ribose, galactose, fructose, mannose, N-Acetyl-Glucosamine, salicin 그리고 maltose로 부터 산을 생성하는 등 유사한 결과를 보여주어 L-8, 11, 12균주는 동일한 균주인 것으로 판단되었다. L-10 균주는 14종류의 당을 이용할 수 있는 것으로 나타나 23종의 당을 이용한 L-3 균주에 비해당 이용성이 낮고, L-8, 11, 12 균주보다는 당 이용성이 높음을 알 수 있었다.
- 55%로 거의 차이가 없었으나 나머지 4개의 균주는 30℃에서 가장 높은 산생성능을 나타내었다. L-3은 40℃에서 1.35%로 최고 대비 87%정도의 산도를 유지하였고, L CMrvatus로 동일하게 동정 된 L-8, 11, 12는 유사한 경향을 나타내는 것을 알 수 있었다. L-10은 40℃에서 0.
- 4). 그 결과 L-3 균주는 Lactobacillus plantarume- Primer(27F)에서 98%, Primer(1492R)에서 99%의 상동성을 나타내었고, L-10 균주는 Lactobacillus Sakei와 98%의 상동성을 나타내었다. 그리고 L-8, 11, 12 균주는 API kit을 이용한 당 발효 실험에서도 동일한 결과를 나타내었으며, 16S rDNA를 이용한 동정에서도 Lactobacillus curvatus로 동정되어 동일한 결과를 얻을 수 있었다.
- 그 결과 L-3 균주는 Lactobacillus plantarume- Primer(27F)에서 98%, Primer(1492R)에서 99%의 상동성을 나타내었고, L-10 균주는 Lactobacillus Sakei와 98%의 상동성을 나타내었다. 그리고 L-8, 11, 12 균주는 API kit을 이용한 당 발효 실험에서도 동일한 결과를 나타내었으며, 16S rDNA를 이용한 동정에서도 Lactobacillus curvatus로 동정되어 동일한 결과를 얻을 수 있었다.
- 운동성은 없는 것으로 나타났다. 그리고 gram 염색성을 알아보기 위하여 Bactident Aminopeptidase (Merck Co., USA)를 이용하여 gram 염색성을 확인한 결과 모두 G(+)로 나타났다. Catalase와 oxidase는 음성 이 었고, indole 생성능과 gelatin 액화능이 없으며, arginine으로부터 ammonia를 생성하지 못하고 glucose로부터 gas 생성이 없는 것으로 보아 동형젖산발효를 하는 것으-로 나타났다.
- 분리된 5균주는 모두 30℃에서 가장 산 생성 능이 우수하였고, L sakei L-10을 제외한 모든 균주는 45℃에서 생육이 정지되었으나, L sakei L-10은 40℃에서 생육이 저해되었다. 그리고 에탄올 농도가 6%일 때 산의 생성이 급격히 감소되었으며 L curvatus L-8, 11, 12는 8% 에탄올에서 거의 생육이 이루어지지 않아 에탄올에 대한 내성이 낮았으며, L plarttarum L-3과 L sakei L-10은 10% 에탄올에서 생육이 정지되었다.
- 본 연구에서 분리한 젖산균은 L plantanun, L sakei, 그리고 L curvatus로 모두가 Lactobacillus 속의 젖산 간균임을 확인하였다. Cho 등(14)은 전국 각지의 누룩으로부터 Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Enterococcus Jaecium, Lactobacillus plantarume-^\ 다양한 젖산균을 분리하였고, Lee 등(15)은 전국의 시판 누룩에서 Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides 그리고 Pediococcus pentosaceus 등 젖산 구균만 분리 되 었다고 보고 하였는데 본 연구에서 동정된 젖산균은 Lactobacillus 속의 젖산 간균이었다.
- 0에서 생육이 억제되면서 산생성능이 우수한 균주이다(2, 15). 분리된 11 균주를 이용하여 이러한 특성을 검토한 결과, Table 1과같이 알코올 10%에서는 L-3, 8, 10, 11, 12균주가 생육하지 못하였고, pH 4.0에서 L-10 균주는 약한 생육을 나타내었으며, L-8, 11, 12균주는 생육하지 못하였다. 산 생성은 L-3 균주가 1.
- 78%의 산도를 나타내어 나머지 4균주에 비해 약 10배 정도 높은 산을 생성하였다. 분리된 5균주는 모두 30℃에서 가장 산 생성 능이 우수하였고, L sakei L-10을 제외한 모든 균주는 45℃에서 생육이 정지되었으나, L sakei L-10은 40℃에서 생육이 저해되었다. 그리고 에탄올 농도가 6%일 때 산의 생성이 급격히 감소되었으며 L curvatus L-8, 11, 12는 8% 에탄올에서 거의 생육이 이루어지지 않아 에탄올에 대한 내성이 낮았으며, L plarttarum L-3과 L sakei L-10은 10% 에탄올에서 생육이 정지되었다.
- 분리된 총 11균주를 이용하여 알코올 10%오+ pH 4.0에서 생육이 억제되는 양조학적으로 적합한 5균주의 젖산균을 분리하였고, 16S rRNA의 염기서열을 분석하여 동정한 결과 Lactobacillus plantarum 1균주, Lactobacillus sakei 1 균주 및 Lactobacillus curvatus 3균주로 나타났으며 모두 젖산간균으로 확인되었고, 이들을 각각 L plantarum L-3, L. sakei L-10 그리고 L. curvatus L-8, 11, 12로 명명하였다. L plantarum L-3이 배 양 초기 pH 4.
- 분리한 5개의 균주를 동정하기 위하여 현미경을 통해 세포의 형태와 운동성을 검토한 결과 5개 균주 모두 간균이었으며, 운동성은 없는 것으로 나타났다. 그리고 gram 염색성을 알아보기 위하여 Bactident Aminopeptidase (Merck Co.
- 0에서 L-10 균주는 약한 생육을 나타내었으며, L-8, 11, 12균주는 생육하지 못하였다. 산 생성은 L-3 균주가 1.55로 가장 높았으며, L-8, 10, 11, 12 균주도 1.0 이상으로 산생성 능이 양호한 것으로 나타났다. 최 종 pH 역시 L-3균주가 3.
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