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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 단삼의 항암활성효과를 실험적으로 비교 평가하기 위해 성공적으로 확립된 k-ras가 발현하는 RK3E-ras 세포를 흰쥐에 주입하는 종양모델을 만들어 in 勇&에서 단삼 추출물액을 고형 종양에 직접 주입하고 종양세포의 변화를 육안적 및 조직학적 관찰을 통하여 보고하는 바이다.
제안 방법
- 흰쥐 우측요부에 RK3E-ras cell 주입으로 7일 이내에 종양이 발달하는 것을 관찰하고, 단삼 추출물을 제조하여 항종양 효과를 관찰하고자 1주 후부터 2주 동안 육종 부위에 투여 후 종양의 크기와 무게를 측정하고 조직학적인 관찰을 통하여 암세포의 발달과 암전이 유무를 살펴보았다. 암종의 크기는 대조군에 비하여 단삼 추출물을 투여한 실험군에서 현저히 감소(p<0.
- Sprague-Dawley계 흰쥐에 종양을 유발시키기 위한 세포주는 RK3E-ras cell로 Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)을 기본 배지로 10% fetal bovine serum(FBS)을 첨가하여 5% CO와 95% air 조건의 배양기 에서 37℃를 유지하며 배양하였다. 실험적 암 전이 모델은 Kim 등(18)의 방법 에 준하였다.
- 실험적 암 전이 모델은 Kim 등(18)의 방법 에 준하였다. in vitro 상에서 배양한 암 세포주 RK3E- ras cell을 FBS 제거 후 계대 배양하여 5xl07 cell/mL 가 되도록 세포 현탁액을 만들어 흰쥐 오른쪽 옆구리 부위에 주사하였다. 암세포 주사 다음날부터 매일 육종 형성상태를 육안으로 확인한다.
- RK3E-ras 세포를 주사 1주일 후 육종을 확인하고 대조군 (saline control), 단삼(Sa/uia miltiorrhiza, SM) 투여군의 2 그룹으로 분류하였다. 대조군은 멸균된 saline을 투여하고, 단삼추출물은 성 인 하루 투여 량을 기준으로 200 ㎎/㎏ 농도로 육종 부위에 48시간 간격으로 14일간 직접 투여하였다.
- 분류하였다. 대조군은 멸균된 saline을 투여하고, 단삼추출물은 성 인 하루 투여 량을 기준으로 200 ㎎/㎏ 농도로 육종 부위에 48시간 간격으로 14일간 직접 투여하였다.
- 암세포 주사 다음날부터 약 일주일 동안 매일 암 전이 상태를 관찰, 유발확인 1주 후 약물을 2주 동안 종양 부위에 직접 주사하였다. 약물 주사 직전을 1주로, 약물 주사 2주 후 개복하여 종양의 크기와 무게를 측정하였다.
- 주사하였다. 약물 주사 직전을 1주로, 약물 주사 2주 후 개복하여 종양의 크기와 무게를 측정하였다. 종양 크기는 Carlsson 등(19)에 준하여 V = ab2/2(a'- longest diameter, b- shortest diameter)로 측정하였다.
- 흰쥐의 간조직과 암종을 적출하여 10%의 포르말린을 사용하여 24시간 동안 고정시킨 다음, 30, 50, 70, 80, 90, 95, 1001, 100II와 같이 알코올 농도를 상승시켜 탈수를 한 다음 xylene으로 투명화 과정을 거친 후 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직은 microtome을 사용하여 5 ym 두께로 절편 하였다.
- 포매된 조직은 microtome을 사용하여 5 ym 두께로 절편 하였다. 절편한 조직을 slide glass 위에 부착시킨 다음 이를 xylene으로 파라핀을 제거한 다음, 100%, 90%, 80% 알코올과 같이 농도가 낮아지는 순으로 5분씩 담구어 함수 과정을 거치게 하였다. Hematoxylin과 eosin으로 이 중 염색을 한 다음 탈수를 하였다.
- Hematoxylin과 eosin으로 이 중 염색을 한 다음 탈수를 하였다. Canada balsam으로 봉합한 후 카메라부착 광학현미경 (Olympus BX51, Japan)으로 관찰한 후 사진을 촬영하였다.
- RK3E~ras 세포를 주사한 다음날부터 약 일주일 동안 매일 육종 형성 정도를 관찰하여 약 3 g의 육종을 확인한 후부터 추출물을 처치하였다. 처치 2주 후 도살하여 육종을 분리한 후 중량을 측정한 결과 생리식염수를 투여한 대조군은 종양이 매우 빠른 속도로 증식하여 중량(36±0.
- RK3E-ras 세포를 흰쥐의 우측 요부에 접종한 1주 후부터 종양의 발달을 확인하고 단삼 추출물액을 종양 부위에 직접 주사하였으며, 2주 후 도살하여 피부를 제거하여 종양을 노출시킨 다음 관찰하였다. 그 결과 생리식염수를 투여한 대조군(Fig.
- RK3E-ras cell에 의하여 형성된 종양 부위에 생리식 염수 또는 추출물을 2주 동안 7회 투여한 다음 도살하여 간 조직을 절취하여 광학현미경 조직표본을 제작하였다. 대조군의 모든 조직들 특히 간문맥 가지 주변에 RK3E-ras 종양세포의 전이가 뚜렷하게 관찰되었다(Fig.
대상 데이터
- 실험동물은 생후 3주령(60±10 g)의 수컷 Sprague- Dawley계 흰쥐를 사용하며, 일반 고형사료(다물 사이언스) 와 물을 충분히 공급하면서 1주간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 단삼은 동신대학교 한방병원에서 제공받아 약제 200 g을 증류수와 배합한 후 100℃에서 3시간동안 전탕한 후 찌꺼기는 따로 분리하고 전탕액을 증류, 냉각, 여과하여 추출물을 얻었다. 얻어진 추출물은 0.
데이터처리
- 모든 값은 평균士표준오차로 나타낸 것이며, 통계처리는 SAS(statistical analysis system, version 6.12) program에 의하여 각 실험군 별로 평균치와 표준오차를 계산하고 unpaired t-test를 시 행하며, 유의수준은 0.05이하인 경우로 한다.
이론/모형
- 배양하였다. 실험적 암 전이 모델은 Kim 등(18)의 방법 에 준하였다. in vitro 상에서 배양한 암 세포주 RK3E- ras cell을 FBS 제거 후 계대 배양하여 5xl07 cell/mL 가 되도록 세포 현탁액을 만들어 흰쥐 오른쪽 옆구리 부위에 주사하였다.
- 약물 주사 직전을 1주로, 약물 주사 2주 후 개복하여 종양의 크기와 무게를 측정하였다. 종양 크기는 Carlsson 등(19)에 준하여 V = ab2/2(a'- longest diameter, b- shortest diameter)로 측정하였다.
성능/효과
- 암종의 크기는 대조군에 비하여 단삼 추출물을 투여한 실험군에서 현저히 감소(p<0.01)하였으며, 암종의 중량 또한 실험군에서 현저히 감소(p<0.01)하였다. 조직학적 관찰 결과 종양을 둘러싸고 있는 섬유막은 대조군에 비하여 실험군에서 발달해 있었으며, 암세포의 밀도는 실험군에 비하여 대조군에서 높았다.
- 01)하였다. 조직학적 관찰 결과 종양을 둘러싸고 있는 섬유막은 대조군에 비하여 실험군에서 발달해 있었으며, 암세포의 밀도는 실험군에 비하여 대조군에서 높았다. 간조직을 관찰한 결과 대조군의 간문맥 주변에서 전이된 것으로 보이는 암세포들이 다수 관찰되었다.
- 조직학적 관찰 결과 종양을 둘러싸고 있는 섬유막은 대조군에 비하여 실험군에서 발달해 있었으며, 암세포의 밀도는 실험군에 비하여 대조군에서 높았다. 간조직을 관찰한 결과 대조군의 간문맥 주변에서 전이된 것으로 보이는 암세포들이 다수 관찰되었다. 이와 같은 결과를 토대로 단삼 추출물이 항종양효과가 있다고 사료된다.
- 추출물을 처치하였다. 처치 2주 후 도살하여 육종을 분리한 후 중량을 측정한 결과 생리식염수를 투여한 대조군은 종양이 매우 빠른 속도로 증식하여 중량(36±0.71 g)이 아주 높게 나타났다. 그러나 SM 추출물을 투여한 군에서는 약물 처치 시작일과 비교하여 중량(0.
- RK3E-ras 세포를 주사한 다음날부터 약 일주일 후 육종형성을 확인하고 종양 크기를 측정한 결과 평균 5, 461±1, 378 mm, 의 크기를 나타냈으며 , 14일동안 saline만 투여한 대조군은 육종의 크기 (39, 563±1, 770 mm3)/} 계속 증가하였다. SM 추출물 투여군에서는 14일째 에 현저 하게 감소하여 크기(743±182 mn?)가 작았다(Fig.
- 다음 관찰하였다. 그 결과 생리식염수를 투여한 대조군(Fig. 3A)과 매우 큰 종양이 관찰되었으며, 특히 생리식염수를 투여한 군에서는 육종의 일부가 괴사되어 있었다. SM 추출물(Fig.
- RK3E-ras cell에 의하여 형성된 우측요부의 종양에 생리식염수를 주사한 대조군에서는 섬유막 층의 형성이 미약하였으며, 커다란 혈관을 비롯하여 직경이 작은 혈관들이 다수관찰되었다. 종양에서는 매우 빠르게 분열하는 암세포들이 밀도가 높게 관찰되었으며, 중앙부위에서는 괴사된 암세포들이 관찰되었다(Fig.
- 4A). SM을 투여한 군에서는 섬유 막 층이 매우 뚜렷하게 관찰되었으며 혈관 구조는 거의 관찰되지 않았을 뿐만 아니라 종양의 중앙부위 세포 밀도는 비교적 낮았다. 암세포의 분열 속도와 밀도 또한 대조군에 비하여 아주 낮게 관찰되었다(Fig.
- 대조군의 모든 조직들 특히 간문맥 가지 주변에 RK3E-ras 종양세포의 전이가 뚜렷하게 관찰되었다(Fig. 5A). SM을 투여한 실험군에서는 간 조직의 극히 일부분에서 전이된 암세포를 확인할 수 있었다(Fig.
- 이에 저자는 단삼이 임상에서 광범위하게 암치료에 활용되기 위한 기초자료를 보강하기 위하여, 최근 Kim 등(18, 30) 이 보고한 대로 종특이성을 갖는 암전이 세포주인 RK3E- ras cell을 흰쥐의 우측 요부에 접종한 1주 후 종양 형성을 확인하고 단삼 약침 액을 2주 동안 종양 부위에 직접 주사하고 도살하여 종양을 육안적으로 측정한 결과 대조군은 종양의 크기가 증가하였고, SM군에서는 약침 치료 전에 비하여 종양의 크기가 감소하였다.
- 종양 부위를 조직학적으로 분석한 결과 대조군의 종양 세포에서는 빠르게 분열하는 암세포들과 괴사된 조직들이 관찰되었다. SM 약침투여군은 육종의 크기에 비 례하여 암세포의 분열 속도와 밀도 또한 대조군에 비해 아주 낮게 관찰되었다.
- RK3E-ras 세포가 다른 조직 즉 간에 전이되는지 관찰한 결과 14일 후 대조군의 간 조직은 매우 큰 범위의 뚜렷한 암세포와 적혈구 침윤현상을 관찰할 수 있었고, 반면 SM 군에서는 간 조직의 극히 일부분에서 전이된 암세포를 관찰할 수 있었다.
- 결과적으로 본 실험은 RK3E-ras 세포 주입으로 유도된 새로운 종양 동물모델에서 단삼 약침이 단기간내에 종양 형 성 및 암전이 억제의 강력한 항종양 효과를 보여주었다. 추후 다양한 동물실험을 통해 단삼의 항암물질로서 효능을 극대화하는 연구가 필요하며 단삼의 항종양 효과가 ras 단백질에 의한 형질변화를 통해서인지 근거를 제시하는 구체적인 기전연구가 필요하다고 사료된다.
후속연구
- 결과적으로 본 실험은 RK3E-ras 세포 주입으로 유도된 새로운 종양 동물모델에서 단삼 약침이 단기간내에 종양 형 성 및 암전이 억제의 강력한 항종양 효과를 보여주었다. 추후 다양한 동물실험을 통해 단삼의 항암물질로서 효능을 극대화하는 연구가 필요하며 단삼의 항종양 효과가 ras 단백질에 의한 형질변화를 통해서인지 근거를 제시하는 구체적인 기전연구가 필요하다고 사료된다.
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