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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 Henoch-Schönlein 자반증에서 일어나는 일련의 염증 반응에서 중요한 역할을 하는 TNF-α의 유전자 다형성이 개개인에 따른 다양한 Henoch-Schönlein 자반증의 임상상에 대한 설명을 가능하게 한다는 전제하에서 Henoch-Schönlein 자반증으로 진단된 국내 소아를 대상으로 하여 TNF-α 유전자 다형성의 분석을 시도하였다.
- 본 연구에서는 Henoch-Schönlein 자반증으로 진단된 환아들에서 급성기와 관해기에 TNF-α 농도를 측정함으로써 Henoch-Schönlein 자반증의 발병과 임상양상의 발현에 있어 TNF-α의 의의를 평가하고, 각 환자에서 TNF-α -308, -238 유전자 다형성의 유전자형과 대립유전자 빈도를 분석해 봄으로써 Henoch-Schönlein 자반증의 발병에 있어 TNF-α 유전자 다형성이 갖는 의의를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 1) 임상양상의 평가: 후향적인 의무기록지 검토를 통하여 환아들의 임상양상을 조사하였으며, De Mattia에 의해 제시된 Henoch-Schönlein 자반증의 임상 점수화체계(clinical scoring system)에 따라 환자들이 보이는 관절 증상, 복부 증상, 신장 증상을 각 항목당 0∼3점으로 평가하였다(Table 1)6).
- SNaPshot 산물과 Genescan-120 LIZ Size Standard(Applied Biosystems, California, USA), Hi-Di formamide를 녹인 후 각 튜브마다 Hi-Di formamide 9 μL와 SNaPshot 산물 0.5 μL, Genescan-120 LIZ Size Standard 0.5 μL를 분주하여 섞은 후 95oC에서 5분간 두어 변성시키고 얼음 위에 두었다가 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, California, USA)에서 전기영동을 시행하고 ABI PRISM GeneScan Analysis Software 및 Genotyper Software (Applied Biosystems, California, USA)을 이용하여 결과분석을 시행하였다.
- SNaPshot primer로서 TNF-α G-308A에 대해 5’-ATATAATCATGATTATAATCAATGATGATCAATAGGTTTTGAGGGGCATG-3’, TNF-α G-238A에 대해 5’-TAATCAATGATGATAAGACCCCCCTCGGAATC-3’를 준비하여 PCR 산물과 ABI PRISM SNaPshotTM Multiplex kit (Applied Biosystems, California, USA)의 SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix를 반응시키고 얼음 위에 5분간 올려놓은 후 microamp tube에 10 μL씩 분주하였다.
- PCR 반응 조건으로 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 30초를 5회 반복한 후 94℃에서 30초, 65∼55℃에서 30초, 72℃에서 30초를 25회 반복한 후 다시 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초를 15회 반복하였다.
- 추출한 DNA를 primer 1.25 pmol, 250 μM dNTP, 2.5 mM MgCl2, ×10 buffer, Taq polymerase 0.15 unit가 포함된 50 μL의 buffer에서 PCR (polymerase chain reaction) thermal cycler를 이용하여 증폭시켰다.
- . 피부, 관절, 복부, 신장 증상이 완전히 소실되었다가 다시 나타난 경우를 재발로 판정하였다.
- PCR 반응 조건으로 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 30초를 5회 반복한 후 94℃에서 30초, 65∼55℃에서 30초, 72℃에서 30초를 25회 반복한 후 다시 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초를 15회 반복하였다. PCR 생성물을 PCR purification kit (Roche Molecular Biochemicals)을 이용하여 PCR 반응 후 남아있는 dNTP와 primer를 제거하여 정제된 주형을 얻었다.
- 2) Tumor necrosis factor-α (TNF-α)의 측정: 대상 환아들의 혈청을 처음 내원 시와 증상이 소실된 후에 채혈하여 3,000 g에서 5분 동안 원심분리하여 -20℃에서 냉동보관한 후, anti-human TNF-α 항체(R&D Systems Inc, Minneapolis, USA)를 이용한 ELISA법을 사용하여 TNF-α의 농도를 측정하였다.
- 3) TNF-α의 유전자형 분석: 대상 환자 및 대조군의 정맥에서 최소 3 cc의 혈액을 채취하여 채취한 혈액에서 QIAamp DNA Mini Kit (Applied Biosystems, California, USA)를 사용하여 DNA를 추출하여 -20℃에서 냉동보관하였다.
- Multiplex kit (Applied Biosystems, California, USA)의 SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix를 반응시키고 얼음 위에 5분간 올려놓은 후 microamp tube에 10 μL씩 분주하였다. PCR thermal cycler를 이용하여 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 30초를 25회 반복하여 시발체 연장 반응을 시킨 후 Shrimp Alkaline Phosphatase 1 unit를 넣고 37℃에서 1시간 동안 놓아서 남아있는 ddNTP와 primer를 제거하였고 75℃에서 15분간 두어 효소를 불활성화시킴으로써 정제된 SNaPshot 산물을 얻었다.
대상 데이터
- 대조군 32명은 남아 16명, 여아 16명이었으며 평균 연령 10.6±2.6세였다.
- 2004년 3월에서 2005년 11월까지 서울대병원 및 분당서울대병원 소아과에 내원하여 Henoch-Schönlein 자반증으로 진단받은 40명의 소아 환자를 대상으로 하였고, 건강한 소아 환아 32명을 대조군으로 하였다.
데이터처리
- 통계적 분석을 위하여 SPSS 12.0을 이용하였고, 통계적 검정 방법으로 두 군 간의 혈청 TNF-α 농도의 비교를 위해 Student t-test를, 두 군 간의 임상 점수(clinical score) 비교를 위해 Mann-Whitney U test를, 환자군에서 급성기와 관해기의 혈청 TNF-α 농도를 비교하기 위해서 paired Student t-test를, 혈청 TNF-α 농도와 임상점수 간의 상관관계를 보기 위해서 Pearson’s correlation을, 각 유전자형과 대립유전자 빈도의 차이를 분석하기 위해서 Chi-square test를, 각 유전자형에 따른 임상양상의 차이를 분석하기 위하여 Fisher’s exact test를 사용하였다.
성능/효과
- TNF-α -238 loci에서의 대립유전자 빈도는 Henoch-Schönlein 자반증 환아에서 G 98.9%, A 1.1%, 대조군 에서는 G 96.9%, A 3.1%였고, 유전자형 분포는 환자 군에서 GG 97.5%, GA 2.5%였으며 대조군에서는 GG 93.8%, GA 6.3%로서 두 군 사이에 통계적인 유의성이 없었다(p=0.429)(Table 2).
- TNF-α -308 loci에서의 대립유전자 빈도는 Henoch-Schönlein 자반증 환아에서 G 90%, A 10%, 대조군에서 G 96.9%, A 3.1%였으며, 유전자형 빈도는 환자군에서 GG 유전자형이 80%, GA 20%였고 대조군에서는 GG 유전자형이 93.8%, GA 6.2%로서 Henoch-Schönlein 자반증 환아에서 높은 GA 유전자형의 빈도를 보이기는 하였지만 통계적인 유의성은 없었다(p=0.094)(Table 2).
- 관절 증상, 복부 증상, 신장 증상 유무에 따른 급성기 혈청 TNF-α 농도를 살펴보았을 때, 혈청 TNF-α 농도는 관절 증상이 없는 환아에서 14.61±15.5 pg/mL, 관절 증상을 보인 환아에서 26.32±23.54 pg/mL로 유의한 차이가 없었고(p=0.158), 복부 증상이 없는 환아에서 21.43±6.53 pg/mL, 복부 증상을 보인 환아에서 23.45±24.93 pg/mL로 유의한 차이가 없었으며(p=0.835), 신장 증상이 없었던 환아에서 20.04±10.67 pg/mL, 신장 증상을 보인 환아에서 30.3±37.93 pg/mL로 유의한 차이가 없었다(p=0.420).
- 환자군에서 Henoch-Schönlein 자반증의 급성기에 측정한 혈청 TNF-α 농도는 23.17±11.31 pg/mL였으며, 증세가 소실된 후에 측정한 혈청 TNF-α 농도는 10.56±5.59 pg/mL로서 증상의 관해와 더불어 통계적으로 유의하게 감소하였다(p=0.000)(Fig. 1).
- Henoch-Schönlein 자반증 임상양상을 반영하는 임상 점수도 GG 유전자형과 GA 유전자형 간에 유의한 차이를 보이지 않았다(p=0.293).
- TNF-α -238 유전자 다형성도 관절 증상(p=1.000), 복부 증상(p=1.000), 신장 침범 여부(p=0.300)와 유의한 관련성이 없었으며(Table 3), 임상 점수는 GA 유전자형이 GG 유전자형에 비해 유의하게 높았다(p=0.05).
- Henoch-Schönlein 자반증의 재발 여부도 TNF-α 유전자의 -308 loci에서의 유전자형과 통계적 유의성이 없었다(GG 유전자형 45.2%, GA 유전자형 28.6%; p=0.675).
- 본 연구의 결과에서도 Henoch-Schönlein 자반증의 급성기에 혈청 TNF-α 농도가 상승하였다가 증상이 소실되면서 유의하게 감소하는 소견을 보여 기존 보고들과 마찬가지로 Henoch-Schönlein 자반증의 발병에 있어 급성기 임상증상 발현에 있어 TNF-α가 중요한 작용을 한다는 사실을 확인할 수 있었다.
- 또한 TNF-α -308, -238 다형성은 관절 증상이나 복부 증상, 신장 증상과 같은 임상양상의 차이를 반영하지는 못하는 것으로 나타났으며, TNF-α -308, -238 다형성에 따르는 혈청 TNF-α 농도의 차이도 관찰되지 않았다.
- 그 결과 TNF-α 유전자의 전사부위에 해당하는 -308 위치에서의 유전자형, 대립유전자 빈도는 Henoch-Schönlein 자반증 환아와 대조군 간에 유의한 차이를 보이지 않았으며, TNF-α -238 위치에서도 마찬가지로 유의한 차이가 없었다.
- 결론적으로, Henoch-Schönlein 자반증 환자에서 급성기에 혈중 TNF-α가 상승하였다가 관해와 더불어 감소되는 소견은 TNF-α가 Henoch-Schönlein 자반증의 발병에 중요한 역할을 하는 사이토카인임을 시사하는 소견이지만, TNF-α 전사부위의 유전자 다형성이 개개인에서의 TNF-α 생성 정도에 차이를 초래하여 Henoch-Schönlein 자반증의 발병과 다양한 임상양상의 발현을 유발시키는지 여부에 대해서는 확인되지 않았다.
후속연구
- 비록 본 연구에서 TNF-α G-308A나 G-238A 유전자 다형성이 Henoch-Schönlein 자반증의 발병에 미치는 영향이나 Henoch-Schönlein 자반증의 다양한 임상 양상과의 뚜렷한 연관성을 확인하지는 못하였으나 부분적으로나마 이러한 관련성이 시사되었기에, 향후 연구를 통하여 TNF-α 유전자 다형성, 더 나아가서는 다른 여러 다양한 유전자들의 다형성이 Henoch-Schönlein 자반증에 대한 유전적 감수성과 발병기전을 설명해 줄 수 있다는 가능성을 제시하였다고 하겠다.
- 하지만, TNF-α -238에서 GA 유전자형을 보이는 경우에는 GG 유전자형에 비해 임상 점수가 의미 있게 높아서 -238 위치에서 A 대립유전자를 갖는 경우 Henoch-Schönlein 자반증의 임상양상이 심할 가능성을 시사한다고 할 수 있다. 그러나 해당 환자수가 적어서 연구결과를 적용하는 데 한계가 있으므로 향후 대상 환자군을 늘여서 추가적인 연구를 시행함으로써 이에 대해 명확히 규명할 필요가 있을 것이다.
- 향후 지속적인 연구를 통하여 Henoch-Schönlein 자반증의 발병기전과 유전적 감수성을 명확히 밝히려는 시도가 이루어져야 할 것이다.
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