[국내논문]발효한약추출물 HP-1이 알코올을 투여한 쥐의 알코올 대사에 미치는 영향 Effect of Fermented Herbal Extracts, HP-1 on Enzyme Activities and Gene Expressions Related to Alcohol Metabolism in Ethanol-loaded Rats원문보기
Recently, much attention has been paid to developing various kinds of fermented herbal extracts, a new type of traditional herbal medicine, in the field of Korean traditional medicine. The fermentation of medicinal herbs is intended to exert a favorable influence on digestability, bioavailavility an...
Recently, much attention has been paid to developing various kinds of fermented herbal extracts, a new type of traditional herbal medicine, in the field of Korean traditional medicine. The fermentation of medicinal herbs is intended to exert a favorable influence on digestability, bioavailavility and pharmacological activity of herbal extract in the gastrointestinal tract. It also produces a number of fermentation products that intensify the nutritional and pharmacological aspects of the medicinal herbs. In order to develop a functional beverage of alleviating the aftereffects of the previous drinks, the extracts (HP-1) of fermented herbal mixture, including Artemisia capillaris Thunb., Lonicera japonica Thunberg, and Hovenia dulcis Thunb., were prepared and the medicinal effect as a hangover cure was evaluated in ethanol-loaded rats. The enzyme activities of alcohol dehydrogenase (ADH) and acetaldehyde dehydrogenase-2 (ALDH2) were analyzed by measuring the concentration of blood ethanol and acetaldehyde. The mRNA expression of ADH and ALDH2 was also investigated through RT-PCR analysis. In the HP-1-treated group, the concentration of blood ethanol was significantly reduced at one hour after loading of ethanol, as compared to that in the saline-treated group. The reduced ethanol was converted to acetaldehyde, which resulted in rapid increase in acetaldehyde concentration in an hour. Acetaldehyde was started to decrease at 5 hours after ethanol loading. It implies that HP-1 is highly effective to stimulate the activities of ADH and ALDH2. The HP-1 treatment also activated the mRNA expression of ADH and ALDH. This study suggests that fermented herbal extract, HP-1 can be used as a functional beverage of alleviating the alcohol-induced hangover symptoms by stimulating the activities and gene expression of hepatic alcohol metabolizing enzymes.
Recently, much attention has been paid to developing various kinds of fermented herbal extracts, a new type of traditional herbal medicine, in the field of Korean traditional medicine. The fermentation of medicinal herbs is intended to exert a favorable influence on digestability, bioavailavility and pharmacological activity of herbal extract in the gastrointestinal tract. It also produces a number of fermentation products that intensify the nutritional and pharmacological aspects of the medicinal herbs. In order to develop a functional beverage of alleviating the aftereffects of the previous drinks, the extracts (HP-1) of fermented herbal mixture, including Artemisia capillaris Thunb., Lonicera japonica Thunberg, and Hovenia dulcis Thunb., were prepared and the medicinal effect as a hangover cure was evaluated in ethanol-loaded rats. The enzyme activities of alcohol dehydrogenase (ADH) and acetaldehyde dehydrogenase-2 (ALDH2) were analyzed by measuring the concentration of blood ethanol and acetaldehyde. The mRNA expression of ADH and ALDH2 was also investigated through RT-PCR analysis. In the HP-1-treated group, the concentration of blood ethanol was significantly reduced at one hour after loading of ethanol, as compared to that in the saline-treated group. The reduced ethanol was converted to acetaldehyde, which resulted in rapid increase in acetaldehyde concentration in an hour. Acetaldehyde was started to decrease at 5 hours after ethanol loading. It implies that HP-1 is highly effective to stimulate the activities of ADH and ALDH2. The HP-1 treatment also activated the mRNA expression of ADH and ALDH. This study suggests that fermented herbal extract, HP-1 can be used as a functional beverage of alleviating the alcohol-induced hangover symptoms by stimulating the activities and gene expression of hepatic alcohol metabolizing enzymes.
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문제 정의
본 연구에서는 인진호, 금은화, 지구자 등의 한방소재를 주원료로 제조된 발효한약 추출물 HR1의 숙취해소 효능을 실험적으로 검증하고자 하였으며 이를 위해 에탄올을 투여한 실험용쥐에서 알코올 대사와 관련된 주요효소인 alcohol dehydrogenase (ADH)와 acetaldehyde dehydrogenase-2 (ALDH2)의 효소활성 (enzyme activity)과 유전자 발현량 (gene expression) 을 분석하였다.
본 실험에서는 한의학적으로 해독, 간보호 등에 효과가 있는 것으로 알려진 한방성분을 혼합, 발효하여 제조한 한방 발효약재추출물 HP-10] 숙취해소에 효과가 있는지 동물모델을 대상으로 확인하고자 하였다. 알코올 섭취 후 나타나는 숙취증상에는 메스꺼움, 구토, 현기증, 갈증, 무기력함, 두통, 근육통 등이 있지만, 대부분 주관적이고 주위 환경에 많은 영향을 받으며 동물실험으로 측정하기에 적합하지 않기 때문에 숙취해소에 대한 객관적인 평가 방법으로 사용되는 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 농도측정을 우선적으로 실시하였다.
제안 방법
그 제조방법은 다음과 같다. 인진호, 금은화, 지구자로 구성된 숙취해소용 한방제제에 뽕잎, 호박, 도라지, 은행잎, 당근, 메주, 찹쌀, 맥아, 포도당, 토마토, 감자 등으로 이루어진 일반 식품류를 일정 비율로 혼합하여 제조하였다. 제조 순서는 먼저 일반 식품 원료 혼합물을 35일간 발효하고 여기에 숙취해소용 한방제제를 첨가하여 다시 15일을 발효시킴으로써 총 60일간의 숙성과정을 거쳐 제조하였다.
인진호, 금은화, 지구자로 구성된 숙취해소용 한방제제에 뽕잎, 호박, 도라지, 은행잎, 당근, 메주, 찹쌀, 맥아, 포도당, 토마토, 감자 등으로 이루어진 일반 식품류를 일정 비율로 혼합하여 제조하였다. 제조 순서는 먼저 일반 식품 원료 혼합물을 35일간 발효하고 여기에 숙취해소용 한방제제를 첨가하여 다시 15일을 발효시킴으로써 총 60일간의 숙성과정을 거쳐 제조하였다.
Sprague-Dawley 계 흰 쥐 230 g을 사용하였다. 동물은 일정한 온도 (23±1 ℃)와 규칙적인 조명(12시간 명/암)이 자동 적으로 조절되는 동물실에서 사육되었고 사료와 음수가 자유롭게 공급되었으며, 일주일간의 적응기간을 거친 후 본 실험에 사용하였으며, 실험군은 대조군, 식염수군, HP-1 군의 세 군으로 나누었다. 먼저 사료 섭취로 인해 나타날 수 있는 위장관을 통한 에탄올의 흡수 방해 현상을 배제하기 위해 에탄올을 경구투여하기 전에 18시간 동안 절식시켰다.
먼저 사료 섭취로 인해 나타날 수 있는 위장관을 통한 에탄올의 흡수 방해 현상을 배제하기 위해 에탄올을 경구투여하기 전에 18시간 동안 절식시켰다. 에탄올 투여 30분전에 식염수군에는 식염수 1 ml을, HP-1 투여군에는 HP-1 1 ml을 경구 투여하였고, 모든 군에 에탄올을 체중 kg 당 4 g 수준으로 1회 경구 투여하였다. 시간 경과에 따른 혈중 에탄올 농도와 아세트알데히드 농도변화를 측정하기 위해 에탄올 경구투여 후 1, 2, 3, 5시간 후에 채혈을 실시하였다.
에탄올 투여 30분전에 식염수군에는 식염수 1 ml을, HP-1 투여군에는 HP-1 1 ml을 경구 투여하였고, 모든 군에 에탄올을 체중 kg 당 4 g 수준으로 1회 경구 투여하였다. 시간 경과에 따른 혈중 에탄올 농도와 아세트알데히드 농도변화를 측정하기 위해 에탄올 경구투여 후 1, 2, 3, 5시간 후에 채혈을 실시하였다. 혈액은 4 ℃, 3000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 얻고, 즉시 -80 ℃의 초저온냉동고에 넣어 급속 동결 시켜 보관하였다.
혈청에 함유되어 있는 에탄올과 아세트알데히드는 에탄올측정용 kit (#10-176-290-035, R-Biopharm, Germany) 와 아세트알데히드 측정용 kit (#10-668-613-035, R-Biopharm, Germany)를이용하여 측정하였다. 에탄올은 ADH에 의해 산화되어 아세트알데히드를 생성하고, 아세트알데히드는 ALDH에 의해 산화되어 acetate를 생성한다.
1 ug의 total RNA를 65 ℃ 에서 15분 동안 denaturation 시킨 후, 200 U moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (GIBCO BRL, MD, USA)를 이용하여 최종 부피가 20 μ1인 반응혼합액에서 역전사 반응을 수행하여 cDNA mixture를 얻었다. cDNA는 10 mM Tris-HCl (pH 8.
증폭된 DNA는 1 % agarose ge에서 전기영동 (electrophoresis)하여 확인하였다. gel 상의 band intensity는 ImageMaster TotalLab™ (Amersham Biosceinces, Piscataway, NJ)을 이용하여 분석하였고 내부 표준물질로 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하여 유전자의 정량적 발현 수준을 보정하였다
에탄올대사에서 중요한 역할을 하는 ADH와 ALDH2 유전자의 발현 정도를 비교해 보기 위해 에탄올을 경구 투여한 후 1 시간 후에 간을 적출하여 RT-PCR을 실시하였다(Fig. 3).
하였다. 알코올 섭취 후 나타나는 숙취증상에는 메스꺼움, 구토, 현기증, 갈증, 무기력함, 두통, 근육통 등이 있지만, 대부분 주관적이고 주위 환경에 많은 영향을 받으며 동물실험으로 측정하기에 적합하지 않기 때문에 숙취해소에 대한 객관적인 평가 방법으로 사용되는 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 농도측정을 우선적으로 실시하였다.
혈중 에탄올 및 아세트알데히드 농도 변화를 측정하기 위해 쥐에 에탄올을 경구투여 하기 30분 전에 HP-1 를 경구 투여하였다. 그리고 에탄올을 경구 투여한 후 채혈을 하여 HP-1 대신에 같은 양의 식염수를 투여한 군과 비교하였다.
그리고 에탄올을 경구 투여한 후 채혈을 하여 HP-1 대신에 같은 양의 식염수를 투여한 군과 비교하였다. 그 결과, 혈중 에탄올 농도는 에탄올 투여 후 1시간 후에 유의하게 감소하였다.
pathway에 의해 대사된다. 따라서 HP-1 이 ADH pathway에 영향을 주어 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 농도가감소되었을 것으로 예상하고 ADH pathway에 관여하는 유전자의 발현 정도를 비교하였다.
HP-1 을 투여했을 때 에탄올 투여 후 1시간 후에 혈중 에탄올 농도가 유의하게 감소하였기 때문에 에탄올 투여 후 1시간 후에 간을 적출하여 ADH pathway에 관여하는 ADH와 ALDH2 유전자의 발현량을 RT-PCR을 통해 비교하였다. 그 결과, 식염수를 투여한 군과 비교하여 ADH mRNA 발현은 68 % 증가하였고, ALDH2 mRNA 발현은 32 % 증가하였다.
알코올 해독과 간보호에 효과가 있다고 알려진 인진호, 금은화, 지구자를 혼합, 발효하여 제조한 한방 발효약재 추출물 HP-1 이 에탄올을 투여한 쥐의 혈중 에탄올 및 아세트알데히드 농도와, 에탄올을 대사에 관여하는 유전자의 발현 정도에 어떤 영향을 미치는지 실험하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
본 한방추출물 HP-1은 (주)파스카바이오에서 젲조 공급되었으며 그 제조방법은 다음과 같다. 인진호, 금은화, 지구자로 구성된 숙취해소용 한방제제에 뽕잎, 호박, 도라지, 은행잎, 당근, 메주, 찹쌀, 맥아, 포도당, 토마토, 감자 등으로 이루어진 일반 식품류를 일정 비율로 혼합하여 제조하였다.
실험동물은 (주) 샘타코 (경기 오산, 한국)로부터 구입한 웅성 Sprague-Dawley 계 흰 쥐 230 g을 사용하였다. 동물은 일정한 온도 (23±1 ℃)와 규칙적인 조명(12시간 명/암)이 자동 적으로 조절되는 동물실에서 사육되었고 사료와 음수가 자유롭게 공급되었으며, 일주일간의 적응기간을 거친 후 본 실험에 사용하였으며, 실험군은 대조군, 식염수군, HP-1 군의 세 군으로 나누었다.
본 연구에 사용된 한방 발효약재 추출물 HP-1의 주요 한방성분은 인진호, 금은화, 지구자로써 각 성분의 한의학적 특성 및약리 작용을 알아보면 다음과 같다15). 인진호는 국화과의 사철쑥 (Artemisia capillaris Thunb.
데이터처리
실험 결과의 통계분석은 SPSS를 이용하였고, 각 실험군마다평균±표준오차로 나타내었으며, 각 실험군 간의 유의성은 ANOVA에 의해 검증하였다.
성능/효과
1에서 나타내었다. 대조군과 식염수군은 에탄올투여 1시간 후에 높은 혈중 에탄올 농도를 나타내고 그 후에 크게 감소하는 양상을 보였다. HP-1군은 식염수군과 비교할 때 1 시간째 에탄올 농도가 유의하게 감소하였다.
2에는 혈중 아세트알데히드 농도 변화를 나타내었다. 에탄올군과 식염수군의 혈중 아세트알데히드 농도는 에탄올 투여 후 1시간 후부터 5시간 후까지 접차 높아지는 양상을 보였다. 그에 비해 HP-1 군의 혈중 아세트알데히드 농도는 식염수군과 비교할 때 1시간째에 유의하게 높은 수준에 이른 후, 5시간째에 유의하게 감소하였다.
에탄올군과 식염수군의 혈중 아세트알데히드 농도는 에탄올 투여 후 1시간 후부터 5시간 후까지 접차 높아지는 양상을 보였다. 그에 비해 HP-1 군의 혈중 아세트알데히드 농도는 식염수군과 비교할 때 1시간째에 유의하게 높은 수준에 이른 후, 5시간째에 유의하게 감소하였다.
그리고 에탄올을 경구 투여한 후 채혈을 하여 HP-1 대신에 같은 양의 식염수를 투여한 군과 비교하였다. 그 결과, 혈중 에탄올 농도는 에탄올 투여 후 1시간 후에 유의하게 감소하였다. 그리고 혈중 아세트알데히드 농도는 5시간 후에 유의하게 감소하였다.
그리고 혈중 아세트알데히드 농도는 5시간 후에 유의하게 감소하였다. 이와 같은 결과를 통해서 HP-1 이 체내로 흡수된 에탄올과 에탄올의 대사과정에서 생긴 아세트알데히드를 제거하는데 효과적임을 알 수 있고, 그로 인해 알코올 섭취 후 나타나는 숙취증상을완화시킬 수 있을 것이라고 생각할 수 있다.
발현량을 RT-PCR을 통해 비교하였다. 그 결과, 식염수를 투여한 군과 비교하여 ADH mRNA 발현은 68 % 증가하였고, ALDH2 mRNA 발현은 32 % 증가하였다. 특히 ADH mRNA 의 경우 통계적으로 유의성 있게 증가하는 결과를 보였다.
HP-1 을 투여했을 때 ADH mRNA 발현과 함께 ALDH2 mRNA 발현도 증가하였고, 에탄올 투여 후 5시간 후에 혈중 아세트알데히드의 농도가 유의적으로 감소하였다. 그러므로 에탄올이 산화되어 생성된 아세트알데히드를 제거하는 ALDH2가 증가하여 빠르게 아세트알데히드가 제거되었다고 할 수 있다.
유의하게 감소하였다. 그리고 HP-1 투여 후 ADH mRNA 발현은 식염수군에 비해 68 % 증가하였으며, ALDH2 mRNA 발현은 32 % 증가하였다. 따라서 HP-10] 알코올 대사에 관여하는 ADH와 ALDH2의 발현을 증가시킴으로써 알코올 대사를 촉진시켜 숙취의 원인이 되는 아세트알데히드의 축적을 감소시키는것을 확인할 수 있었다.
그리고 HP-1 투여 후 ADH mRNA 발현은 식염수군에 비해 68 % 증가하였으며, ALDH2 mRNA 발현은 32 % 증가하였다. 따라서 HP-10] 알코올 대사에 관여하는 ADH와 ALDH2의 발현을 증가시킴으로써 알코올 대사를 촉진시켜 숙취의 원인이 되는 아세트알데히드의 축적을 감소시키는것을 확인할 수 있었다.
후속연구
그러므로 에탄올이 산화되어 생성된 아세트알데히드를 제거하는 ALDH2가 증가하여 빠르게 아세트알데히드가 제거되었다고 할 수 있다. 이같은 실험 결과로서 한방 발효약재 추출물 HP-1은 숙취증상을완화하는데 도움이 될 것으로 사료된다.
이상의 실험결과를 종합해 볼 때 HP-1 을 음용하여 음주로 인해 발생하는 숙취 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있으며, 숙취해소음료(숙취해소제)로 개발될 수 있다고 사료된다.
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