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제안 방법
- MTT 정 량방법을 이용하여 10, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 μg/ml농도의 PLX가 포함된 배양액에서 L929 세포주와 LNCaP 세포주의 24시간 배양 후 세포 생존율을 측정하여 대조군과 비교하였다. L929에서는 PLX 의 농도별 처리에 따라 50, 100 μg/rM에서는 대조군(100%) 에 비하여 약간 증가하는 경향을 보였지만, 2000 μg/ml에서 79.
- PCRe Corbett Rotor-Gene 3000(Corbett Life Science, UK)을 이용하여 수행하였다. 반응은 이미 합성된 2 μl의 cDNA를 주형으로 사용하고, 주형에 대한 primer는 PSA, 5a-reductase, GAPDH 유전자를 증 폭하기 위하여 sense primer(20 pmo*U)와 antisense primer(20 pmol/μ/)를 혼합하여 3 μ7를 가하고, Qiagen사의 QuantiTect SYBR Green PCR kit mix 10 μ/를 첨가한 다음 최종 부피가 20 μl가 되도록 멸균증류수를 가하고 predenaturation; 95℃, 15분, denaturation; 94℃, 20초, annealing; 60℃, 20초, elongation; 72℃, 20초를 60 cycle 조건으로 PCR을 수행하였다(Table I).
- 반응은 이미 합성된 2 μl의 cDNA를 주형으로 사용하고, 주형에 대한 primer는 PSA, 5a-reductase, GAPDH 유전자를 증 폭하기 위하여 sense primer(20 pmo*U)와 antisense primer(20 pmol/μ/)를 혼합하여 3 μ7를 가하고, Qiagen사의 QuantiTect SYBR Green PCR kit mix 10 μ/를 첨가한 다음 최종 부피가 20 μl가 되도록 멸균증류수를 가하고 predenaturation; 95℃, 15분, denaturation; 94℃, 20초, annealing; 60℃, 20초, elongation; 72℃, 20초를 60 cycle 조건으로 PCR을 수행하였다(Table I). PCR을 수행한 후 실 험결과는 Rotor-Gene 3000의 Delta Dellta CT relative Quantitation으로 분석하였다.
- RT 반응은 준비 된 total RNA 3 μg을 65℃에서 5분 동안 변성시키고, 여기에 2.5 μl 10 mM dNTPs, 1 random sequence hexanucleotides (25 pmol/25 μl), RNA inhibitor로서 1 μ/ RNase inhibitor(20 U/ μ/), 1 \xl 100 mM DTT, 4.5 \xl 5X RT buffer(250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgC.)를 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 μ/가 되도록 하였다. 이 20 μ/의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심 침강하여 37℃ 항온 수조에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA/를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다.
- 3 ml 투여하였다. T-control, T-PLX, T-finasteride 군은 testosterone을 실험 시작 일부터 2주째까지 3 ㎎/㎏으 로 2일에 한 번 오후 4시에 피하주사를 하였고, 실험 2주째 부터 종료일인 8주째까지 testosterone을 1.5㎎/㎏으로 3일 에 한 번 오후 4시에 피하 주사하였다. 실험 2주째부터 종 료일까지 T-control, T-PLX, T-finasteride군에게 각각 생리식 염 수 0.
- 세포독성 시험은 MTT 정량법으로 하였다. 먼저, 배양한 세포주를 각각 5x103 cell/μl이 되도록 96 well plate에 분주하여 24시간 배양 후 이들 세포를 O(control), 10, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 μg/m/농도의 실험물질이 포함된 배양액에서 24시간 배양 후 MTT 200 pg/mZ가 포함된 배양액을 well당 200 μg 씩 넣은 후 다시 3시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 버리고 DMSO를 well당 100 gg/me 넣어 5분간 실온에 방 치하며 Formazan을 용해한 후 microplate reader로 흡광도 570nm에서 측정하였다.
- 반응은 이미 합성된 2 μl의 cDNA를 주형으로 사용하고, 주형에 대한 primer는 PSA, 5a-reductase, GAPDH 유전자를 증 폭하기 위하여 sense primer(20 pmo*U)와 antisense primer(20 pmol/μ/)를 혼합하여 3 μ7를 가하고, Qiagen사의 QuantiTect SYBR Green PCR kit mix 10 μ/를 첨가한 다음 최종 부피가 20 μl가 되도록 멸균증류수를 가하고 predenaturation; 95℃, 15분, denaturation; 94℃, 20초, annealing; 60℃, 20초, elongation; 72℃, 20초를 60 cycle 조건으로 PCR을 수행하였다(Table I). PCR을 수행한 후 실 험결과는 Rotor-Gene 3000의 Delta Dellta CT relative Quantitation으로 분석하였다.
- 각 세포주는 37℃, 5% COz로 조정된 배양기 내에서 배양하였으며, 배양 액은 3일마다 교환하였다. 배양된 세포는 Uypsin-EDTA로 부유시킨 후 0.4% trypan blue로 염색하여 혈구계측기 (Hematocytometer)로 세포수를 계산하였다. 세포독성 시험은 MTT 정량법으로 하였다.
- 배양한 LNCaP 세포에 PLX를각각의 dish에 100, 200, 500, 1000 ng/m/ 농도로 처리하고, finasteride를 50 μM의 농도로 처리한 후 24시간 배양하였다. 대조군은 아무것도 처리하지 않은 것으로 하였다.
- 본 실험은 라이코펜이 2% 함유된 토마토 추출액과 키토올리고당을 3:5로 혼합, 균질화한 것을 PLX라고 명명하였으며, PLX를 이용하여 마우스 섬유모 세포인 L929과 전립선암 세포주인 LNCaP에 대한 세포 생존율을 측정하였으며, LNCaP 세포주에서 전립선 특이 항체인 prostate specific antigen (PSA)과 5a-reductase를 역전사중합연쇄반응법으로 유전자 발현 도를 측정하였고, 쥐에게 실험적으로 전립선 비대증을 유발하여 PLX의 구강 투여에 의한 전립선 무게의 감소에 대한 효과를 판별하였다.
- 본 연구는 라이코펜이 2% 함유된 토마토 추출액과 키토올리고당이 3:5의 비율로 혼합된 PLX로 전립선 비대증에 대한 효과를 실험하였다. 전립선 암세포주에 대한 세포 성장 저해 효과를 알아보기 위해 PLX를 마우스 섬유모 세포주인 L929과 전립선 암세포주인 LNCaP에 농도별로 처리한 결과, L929에서는 2000μg/mZ에서 유의적인 성장 저해 효과가 있었지만 LNCaP에서는 100ng/m/에서부터 성장이 저해되는 경향을 보였고 500, 1000, 2000ng/mZ에서 유의적인 저해 효과를 보였다.
- 29,30)남성 호르몬인 testosterone을 쥐에게 주기적으로 과다 투여하게 되면 전립선의 세포 표면에 있는 androgen receptor에 binding 하여 전립선의 성장을 촉진할 뿐 아니라 5a-reductase에 의해 DHT로 변환되어 testosteron보다 강한 활성으로 전립선의 비대를 유발하게 된다. 본 연구진은 예비 실험을 통하여 실험쥐에서 전립선 비대증 유발을 위한 적정 농도의 testosterone 주사량과 주사 일정을 알아본 결과, testosterone 3 ㎎/㎏을 2일에 한 번 피하주사를 하면 전립선 비대증이 유발되지만 실험 물질의 투여에 따른 효과를 보기에는 너무 많은 양의 testosterone0] 들어감으로 인해서 대조군과 실험군의 유의적인 차이를 판별하기 힘들기 때문에, 본 실험에서는 총 실험 기간인 8주에서 첫 2 주 동안은 testosterone 3 rr@kg을 2일에 한 번 피하주사를 하고 나머지 6주 동안은 실험 물질을 경구 투여 하면서 testosterone 1.5 ㎎/㎏을 3일에 한 번 피하주사 하는 방법을 사용하였다. 과다한 호르몬의 투여로 전립선의 비대를 유발하면서 PLX와 finasteride를 경구 투여하여, 실험 8주째에 부검하여 체중 대비 전립선 무게에 1000을 곱한 값을 비교한결과, control군이 3.
- 5㎎/㎏으로 3일 에 한 번 오후 4시에 피하 주사하였다. 실험 2주째부터 종 료일까지 T-control, T-PLX, T-finasteride군에게 각각 생리식 염 수 0.3 ml, PLX 120 ㎎/㎏, finasteride 2 ㎎/㎏을 매일 한 번 경구투여하였다(Fig. 1)
- 15 ml를 3일에 한 번 오후 4시에 피하주사를 하였다. 실험 2주째부터 종료일인 8주째까지는 매일 한 번 구강으로 생리식염수 0.3 ml를 2일에 한 번 오후 4시에 피하주사를 하였 고, 실험 2주째부터 종료일인 8주째까지는 생리식염수 0.15 ml를 3일에 한 번 오후 4시에 피하주사를 하였다. 실험2주째부터 종료일인 8주째까지는 매일 한 번 구강으로 생리 식염수를 0.
- 실험 8주째에 모든 쥐를 안락사 시켜서 체중을 측정하고 부검을 하여 양쪽 고환과 전립선의 무게를 측정하였다. 실험 물질의 효과를 판별하기 위한 최종 데이터는 전립선 무게에서 체중을 나눈 후 1000을 곱한 값으로 하였다.
- 실험 8주째에 모든 쥐를 안락사 시킨 후 체중과 양쪽 고환, 전립선의 무게를 측정하였다. 전립선을 분리할 때에는 요도와 방광, 정낭선이 파열되지 않도록 최대한 둔성 분리하였고, 전립선이 파열되어 선액이 빠져나가지 않도록 주의해서 분리하였다.
- 15 ml를 3일에 한 번 오후 4시에 피하주사를 하였다. 실험2주째부터 종료일인 8주째까지는 매일 한 번 구강으로 생리 식염수를 0.3 ml 투여하였다. T-control, T-PLX, T-finasteride 군은 testosterone을 실험 시작 일부터 2주째까지 3 ㎎/㎏으 로 2일에 한 번 오후 4시에 피하주사를 하였고, 실험 2주째 부터 종료일인 8주째까지 testosterone을 1.
- 고형사료와 물은 상시 공급하고 실온 22±2℃, 상대습도 50~65%, 조도 200 lux (8시 점등, 20시 소등)를 계속 유지하면서 1주간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험군은 testosterone 을 투여하지 않고 생리식염수를 먹인 control군, testosterone 을 투여하고 생리식염수를 먹인「control군, testosterone을 투여하고 PLX를 먹인 T-PLX군, testosterone을 투여하고 finasteride를먹인 T-Finasteride군으로, 총 4군으로 나누었으며 군 당 8마리씩 배정하였다.
- 쥐에게 남성 호르몬인 Testosteronee- 과다 투여하여 전립선 비대증을 유발하였다. 실험군은 총 4군으로 나누었으며 실험 방법은 Fig.
- 1과 같다. 즉, control군은 생리식염수를 testosterone 대신에 다른 군의 testosterone 투여법과 같은 방법으로, 실험 시작일부터 2주째까지는 생리식염수 0.3 ml를 2일에 한 번 오후 4시에 피하주사를 하였고, 실험 2주째부터 종료일인 8주째까지는 생리식염수 0.15 ml를 3일에 한 번 오후 4시에 피하주사를 하였다. 실험 2주째부터 종료일인 8주째까지는 매일 한 번 구강으로 생리식염수 0.
대상 데이터
- 라이코펜이 2% 함유된 토마토 추출액은 Lycored Natural Product Inc.(Israel)에서 제공 받아 사용하였으며, 키토올리고당은 (주)이코바이오에서 제작한 것을 사용하였다. 토마토 추출액과 키토올리고당을 3:5의 비율로 혼합하여 균질화한 물질인 PLX를 본 실험에 사용하였다.
- '9 라이코펜은 안정제로 비타민 E가 소량 포함 시 남성호르몬 관련 유전자의 발현도가 더욱 억제된다.18) 이러한 안정제의 역할을 함과 동시에 콜레스테롤 저하,19) 면역력 증가, % 항균, 2D 항암, 끄) 항산화23)작용 등 탈아세틸화와 분자량에 따라 여러 가지 기능을 나타내는 키토올리고당을 라이코펜이 2% 함유된 토마토 추출액과 혼합하여 본 실험의 실험 물질로 사용하였다.
- 3개월령의 수컷 Sprague Dawley계 쥐를 중앙실험동물에서 공급받아 사용하였다. 고형사료와 물은 상시 공급하고 실온 22±2℃, 상대습도 50~65%, 조도 200 lux (8시 점등, 20시 소등)를 계속 유지하면서 1주간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 세포주는 총 2가지로, 생쥐 섬유모 세포의 일종인 L929과 androgen receptor에 의 존적인 사람유래 전립선 종양 세포인 LNCal을 사용하였다. 세포 배양은, L929은 10% FBS와 100unit/m/의 penicillin/ streptomycin을 1% 첨가한 DMEM배지를 사용하였으며, LNCaPe 10% FBS와 100unit/mZ의 penicillin/streptomycin 을 1% 첨가한 RPMI1640배지를 사용하였다. 각 세포주는 37℃, 5% COz로 조정된 배양기 내에서 배양하였으며, 배양 액은 3일마다 교환하였다.
- 실험에 사용한 세포주는 총 2가지로, 생쥐 섬유모 세포의 일종인 L929과 androgen receptor에 의 존적인 사람유래 전립선 종양 세포인 LNCal을 사용하였다. 세포 배양은, L929은 10% FBS와 100unit/m/의 penicillin/ streptomycin을 1% 첨가한 DMEM배지를 사용하였으며, LNCaPe 10% FBS와 100unit/mZ의 penicillin/streptomycin 을 1% 첨가한 RPMI1640배지를 사용하였다.
- 토마토 추출액과 키토올리고당을 3:5의 비율로 혼합하여 균질화한 물질인 PLX를 본 실험에 사용하였다. 양^ 대조군으로는 5a-reductase inhibitor 제제로 대표적인 약물인 finasteride를 사용하였다.
- (Israel)에서 제공 받아 사용하였으며, 키토올리고당은 (주)이코바이오에서 제작한 것을 사용하였다. 토마토 추출액과 키토올리고당을 3:5의 비율로 혼합하여 균질화한 물질인 PLX를 본 실험에 사용하였다. 양^ 대조군으로는 5a-reductase inhibitor 제제로 대표적인 약물인 finasteride를 사용하였다.
이론/모형
- 4% trypan blue로 염색하여 혈구계측기 (Hematocytometer)로 세포수를 계산하였다. 세포독성 시험은 MTT 정량법으로 하였다. 먼저, 배양한 세포주를 각각 5x103 cell/μl이 되도록 96 well plate에 분주하여 24시간 배양 후 이들 세포를 O(control), 10, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 μg/m/농도의 실험물질이 포함된 배양액에서 24시간 배양 후 MTT 200 pg/mZ가 포함된 배양액을 well당 200 μg 씩 넣은 후 다시 3시간 동안 배양하였다.
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