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문제 정의
- 본 연구에서는 음식물 퇴비화과정 중 발생되는 대표적인 악취물질인 암모니아성 질소를 제거해 줄 수 있는 미생물을 담체충진형 바이오필터에 이용하기 위하여, 암모니아성 질소 산화능이 우수하며 자연계에서 생육이 양호한 균주를 분리하였으며 생육특성 및 암모니아성 질소 산화능을 조사하여 현장처리 공정에 적용할 수 있는 균주개발을 위한 기초적 연구를 수행하였기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 16S rDNA에 의한 분리균주의 계통분석은 Applied Biosystems 사의 ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kits을辎 이용하여 시퀀싱 반응을 하고, MJ Research 사의 PTC-225 Peltier Thermal Cycler를 사용하여 얻은 PCR 산물을 ABI PRISM 3730XL Analyzer로 분석을 하였다.
- 20。(二 30。。, 40℃로 조절하여 액체배지에서 1주일간 배양시키면서 각 온도에서의 균 성장과 산화율을 비교 조사하였다.
- 돈분, 우분, 계분이 자연 숙성된 퇴비와 음식물 퇴비 등의 시료로부터 선택배지를 사용하여 암모니아 산화 능이 우수한 그람음성 단간균인 B. diminutae 분리하였다. 이 균은 30℃ 배양 조건에서 초기 pH 5에서 pH 9까지의 범위에서 생육이 왕성하였으며, 배양온도 20℃, 30℃, 40℃에서 비슷한 성장특성을 보임으로서 안정적인 처리 효율을 유지할 수 있는 균주인 것으로 조사되었다.
- 배양액 1 m/을 취하여 Griess-Ilosvay 시약으로 NO2 의 생성능을 테스트한 후 발색반응이 좋은 배양액을 일차적으로 선별을 하였으며 암모니아가 포함된 고체 배지에서 도말하여 호기성 조건으로 3주간 정치배양을 한 다음 집락을 선별해서 암모니아산화세균 선택배지에 재접종하여 발색반응을 통해 암모니아 산화능이 우수한 균을 선별하였다.地
- 분리 균주의 성장은 UV-Spectrophotometer(UVmini 1240X 사용하여 540 nm에서 홉광도로 측정하였다. 암모니아 산화율은 배지 내의 암모니아성 질소 및 아질산성 질소의 농도 변화를 측정하였다.
- 분리된 균을 탄소원으로 포도당을 0%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1.0%, 2.0%로 각각 다른 농도로 첨가된 암모니아 산화세균 분리용 액체배지에 접종하여 30℃, pH 7 .에서 1주일 간 배양하면서 균의 성장 및 암모니아 산화 특성을 조사하였다.
- 분리된 균이 암모니아성 질소를 산화하는데 미치는 최적 pH를 조사하기 위하여 최적배양온도에서 pH 5, pH 7, pH 9로 조절된 액체배지에서의 균 성장과 산화율을 비교 조사하였다.
- 분리된 암모니아 산화세균의 형태학적인 특징은 광학현미경(Olympus, DPI 1)으로 관찰하였으며, 생화학적 특성은 API 20NE kit (BioMerieux korea)를 사용하여 조사하였다.
- 생육이 가장 우수하고 암모니아 산화능력이 뛰어난 균을 선별하여 생화학적 특성을 API 20NE kit로 조사하고 광학현미경(Olympus, DP11)怛로 형태학적 특징을 관찰한 결과를 Table 1과 Fig. 1에 나타내었다. 또한 분리된 균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과 Fig.
- 측정하였다. 암모니아 산화율은 배지 내의 암모니아성 질소 및 아질산성 질소의 농도 변화를 측정하였다. 측정기기는 Spectrophotometer(Hach, DR-4000)를 사용하여 NH3 및 NQ를 정량적으로 측정하였다.
- 0%로 각각 다른 농도로 첨가된 암모니아 산화세균 분리용 액체배지에 접종하여 30℃, pH 7 .에서 1주일 간 배양하면서 균의 성장 및 암모니아 산화 특성을 조사하였다.
- 암모니아 산화율은 배지 내의 암모니아성 질소 및 아질산성 질소의 농도 변화를 측정하였다. 측정기기는 Spectrophotometer(Hach, DR-4000)를 사용하여 NH3 및 NQ를 정량적으로 측정하였다.
- 퇴비화 공정에서 배출된 음식물 퇴비와 자연 숙성된 돈 분, 우분 및 계분퇴비 시료를 채취하여 암모니아 산화균 선택배지에서 배양되어 농화된 균주를 3단계 희석평판법에 의해 암모니아가 함유된 고체배지에서 3주간 배양 후 생성된 콜로니를 순수 분리하였다. 생육이 가장 우수하고 암모니아 산화능력이 뛰어난 균을 선별하여 생화학적 특성을 API 20NE kit로 조사하고 광학현미경(Olympus, DP11)怛로 형태학적 특징을 관찰한 결과를 Table 1과 Fig.
대상 데이터
- 암모니아 산화세균을 분리하기 위하여 자연 숙성된 돈 분, 우분 및 계분 퇴비와 음식물 퇴비화 공정을 거쳐서 나온 퇴비 등 총 34점의 시료를 채취하였다. 채취한 시료를 25 mZ의 (NH/SQ가 포함된 암모니아 산화 세균 선택 배지[잉ucose 100 nM, (NH4)2SO4 2.
성능/효과
- 4에 나타내었다. 대부분의 온도에서 균 성장에 따른 암모니아성 질소의 농도가 매시간 일정한 감소를보였으나 20℃, "C와 비교해 볼 때 30℃에서는 균의 생육이 높았으며 이에 따른 암모니아성 질소 농도의 급격한 감소로 인하여 30℃ 범위에서 최적생육 조건을 확인하였다.
- dimimMae 교반속도 180rpm으로 30。。에서 배양 조건에서는 초기 pH 5에서 pH 9까지의 범위에서 생육이 왕성하였다. 배양온도 20。(二 30℃, 40。(2에서 1주간 배양한 결과 대체적으로 비슷한 생육을 보임으로서 미생물을 이용한 생물학적 처리의 문제점인 겨울철 처리 효율에 있어서도 안정적인 처리 효율을 유지할 수 있는 균주로서 이용이 가능한 것으로 조사되었다.
- B. diminuta의 배양학적 조건에 따른 질소의 산화력을 조사한 결과 초기 pH가 7이고 배양온도가 30℃인조건에서 균의 생육이 높았으며 암모니아성 질소의 산화율도 가장 좋은 것으로 조사되었다. 유기 탄소 원이 암모니아성 질소의 산화율에 미치는 영향을 조사하고자 포도당을 첨가하여 균의 성장 및 암모니아성 질소의 산화율을 조사한 결과 포도당이 1% 첨가되었을 때 균의 증식 및 산화율이 가장 좋았으며 포도당의 농도가 1%보다 낮을 때는 균의 성장이 저조하였고, 1%보다 높은 포도당농도에서는 오히려 암모니아성 질소의 산화율이 감소하는 것으로 조사되었다.
- 최적 생육 온도는 30。。이며, pH 7인 중성 조건에서 균의 증식과 암모니아성 질소 산화율이 가장 우수한 것으로 조사되었다.
- 이는 탄소원으로 사용된 포도당이 저농도에서는 균체의 빠른 생육에 도움이 되나, 고농도의 포도당 농도가 암모니아 질소의 산화능에는 catabolite repression 작용을 하는 것으로 추측된다. 따라서, 본 연구에서 분리한 미생물의 성장배지에 독립영양균에 자화하기 좋은 탄소원인 포도당을 적절한 농도로(0.5-1.0%, w/v) 첨가해줌으로서 균의 빠른 증식을 유도하여 암모니아 질소 산화능 효율을 향상시킬 수 있을 것으로 생각된다.
- 1에 나타내었다. 또한 분리된 균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과 Fig. 2 와 같았으며, 생리 생화학적 특성 등과 연계하여 검토한 결과 그람음성의 단간균인 Brevundimonas diminuta 와 유의성이 가장 높은 것으로 확인되었다.
- 5에 나타내었다. 산성조건인 pH 5에서는 균성장은 크게 나타나지 않았고 이에 따른 암모니아성 질소 농도의 감소는 가장 낮았으며, pH 7에서 균성장에 따른 암모니아성 질소가 가장 빨리 산화되는 것으로 나타났다. 알카리성 조건인 pH 9에서는 산성조건일 때보다는 산화능이 더 좋은 것으로 조사되었다.
- diminuta의 배양학적 조건에 따른 질소의 산화력을 조사한 결과 초기 pH가 7이고 배양온도가 30℃인조건에서 균의 생육이 높았으며 암모니아성 질소의 산화율도 가장 좋은 것으로 조사되었다. 유기 탄소 원이 암모니아성 질소의 산화율에 미치는 영향을 조사하고자 포도당을 첨가하여 균의 성장 및 암모니아성 질소의 산화율을 조사한 결과 포도당이 1% 첨가되었을 때 균의 증식 및 산화율이 가장 좋았으며 포도당의 농도가 1%보다 낮을 때는 균의 성장이 저조하였고, 1%보다 높은 포도당농도에서는 오히려 암모니아성 질소의 산화율이 감소하는 것으로 조사되었다. 따라서 분리된 B.
- 탄소원으로 포도당을 첨가하여 암모니아성 질소의 산화율에 미치는 영향을 조사한 결과 Fig. 6에서와 같이 액체 배지 속의 포도당 농도가 증가할수록 균체의 성장과 암모니아성 질소의 산화율이 함께 좋았으나, 2%의 포도당 농도에서는 오히려 암모니아성 질소의 산화율이 감소하였다. 이는 탄소원으로 사용된 포도당이 저농도에서는 균체의 빠른 생육에 도움이 되나, 고농도의 포도당 농도가 암모니아 질소의 산화능에는 catabolite repression 작용을 하는 것으로 추측된다.
후속연구
- 유기 탄소 원이 암모니아성 질소의 산화율에 미치는 영향을 조사하고자 포도당을 첨가하여 균의 성장 및 암모니아성 질소의 산화율을 조사한 결과 포도당이 1% 첨가되었을 때 균의 증식 및 산화율이 가장 좋았으며 포도당의 농도가 1%보다 낮을 때는 균의 성장이 저조하였고, 1%보다 높은 포도당농도에서는 오히려 암모니아성 질소의 산화율이 감소하는 것으로 조사되었다. 따라서 분리된 B. diminuta 균주는 암모니아성 질소를 광범위한 온도와 pH 조건에서 효과적으로 제거할 수 있는 공정에 이용될 수 있는 균주로 기대된다.
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