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문제 정의
- 연구 결과 fliC 유전자는 아종 간에도 공통적으로 갖고 있으며 균주 특이성도 매우 높은 것으로 확인되었으나 토양에서의 DNA 회수와 PCR 수율이 낮아서 검출 효율성이 떨어지는 것으로 보고되었다. 따라서 본 연구에서는 토양으로부터 순수한 DNA를 효율적으로 회수하고, 새로운 primer를 고안하여 PCR 산물의 특이성과 수율을 높이는 방법을 모색하는 한편 DNA enzyme-linked immunosorbent assay (DNA ELISA)의 방법을 적용하여 토양 내에 존재하는 R. solanacearum을 효율적으로 검출할 수 있는 기법을 개발하고자 하였다.
- solanaceaiwi의 액체 배양액과 토양 시료에서 PCR 반응을 저해하는 또 다른 물질이 존재한다는 것도 알 수 있었다. 이에 본 연구에서는 일반적으로 사용되는 DNA 회수 방법을 개선하여 토양으로부터 빠르고 단순하면서도 PCR 저해 물질을 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 고안하였다. Chelex-100 resin을 넣고 끓이는 방법은 기존의 guanidine thiocyanate 분해법이나 킬레이트 물질을 첨가하여 독성을 갖거나 인체에 유해한 시약을 사용하는 방법들과 비교하였을 때 알코올 침전 반응을 거치지 않고도 PCR에 바로 사용할 수 있는 순수한 DNA를 얻을 수 있었다.
- 풋마름병에 걸린 모종으로부터 R. solanacearum을 분리하고 genomic DNA를 추출하여 PCR 및 DNA EIA를 통하여 검출하고자 하였다. 4엽기 때의 모종에 R.
제안 방법
- PCRe AmplitronlK 통하여 수행되었다. Primary PCRe 10x PCR buffor에 10 mM dATP, dGTP, dCTP, dUTP와 0.
- PCRe AmplitronlK 통하여 수행되었다. Primary PCRe 10x PCR buffor에 10 mM dATP, dGTP, dCTP, dUTP와 0.5 μ1의 10 pmol primer set와 1 U의 Taq 중합효소 및 5 μ 1의 주형 DNA로 조성되어 수행되었다. 반웅 조건은 초기 94℃ 5분 후, 94℃ 1분, 61℃ 1분, 72℃ 1분으로 구성된 40 cycles의 반응 후 72℃ 5분으로 구성되었다.
- 나타내었다. Primer와 probe는 Primer3 프로그램 (Whitehead Institude, MT center for Genome research)을 통하여 제작되었다. Rsol/ZiC forward와 reverse primer는 fliC 유전자 내의 400 bp PCR 산물을 얻는데 사용되었고 RS_247 forward와 reverse는 nested PCR 을 통하여 247 bp의 산물을 얻는데 사용되었다.
- DNA ELISA는 biotin이 표지된 primer로 증폭되어진 nested PCR 반응 산물과 96-well plate에 코팅되어진 probe 간의 교잡반응으로 진행되었다. Probe와 교잡되어진 nested PCR 반응 산물은 streptavidin-peroxidase와 결합되어지고 반응 후 잔류된 streptavidin-peroxidase에 발색기질인 TMB를 첨가하여 효소 반응을 유도한 뒤 그 값을 측정하였다(Table 3). 반응을 유도하고 값을 측정하는데 있어서 두 가지의 변수가 있었는데, 하나는 96-well plate를 코팅할 때 사용되었던 probe의 농도이고 다른 하나는 교잡 반응을 수행할 때의 온도였다.
- solanacearume\ genomic DNA를 주줄하기위하여 SDS 분해법, STET 상에서의 끓이는 방법, resin을 첨가하여 끓이는 방법과 DNAzol을 이용하는 방법을 각각 독립적으로 또는 복합적으로 적용하여 실험을 수행하였다. 동일한 시료로부터 각 방법들을 통하여 genomic DNA를 추출하고 이를 16S rDNA와 fliC 유전자를 증폭한 뒤 전기영동 상에서 PCR 반응 산물을 비교하였다. 그 결과 DNAzol-S- 사용하여 DNA를 추출하는 방법이 다른 방법들에 비하여 PCR 증폭 효율이 가장 우수하였으며, 추출과정을 비교하였을 때에도 효소의 반응을 수행시키는 단계, 층분리를 유도하는 단계 및 마지막 단계에서 알코올로 침전시키는 단계가 없기 때문에 소요 시간이나 처리 과정이 매우 빠르고 간편하였다.
- 반응 산물에 dUTP가 첨가되도록 하였다. 반응 조성에 10 U UNG를 첨가하고 반응 조건에 초기 37C에서 30분을 시행하여 UNG의 반응이 수행되도록 하였다.
- 2 pmoVgl 농도로 100 μ 1 씩 분주하여 상온에서 18 시간 이상 반응시켰다. 반응 후 Tween20이 포함된 PBS (PBST, 0.1% Tween in PBS)로 3회 세척하고 0.5% BSA가 포함된 PBS로 blocking 하는 단계로 수행하였다. Nested PCR 반응 산물은 95。(2에서 10분간 변성시키고 96-well plate에 첨가되어 6(TC에서 한 시간 반응하였다.
- 배양액과 토양으로부터 R solanacearume\ DNA를 추출하였다. 1 ml의 배양액을 원심분리하여 ceil pellet을 얻었고 phosphate bufier saline (PBS, 0.
- Primary PCR의 반응 산물은 nested PCR의 주형 DNAS. 사용되어졌으며 nested PCR의 조성은 동일하되, 반응 조건은 94℃ 30초, 55℃ 40초, 72℃ 30초로 구성된 30 cycles로 구성되었다. PCR 반응 결과 산물은 2.
- 실제 청고병을 유발시키는 R. solanacearum의 검출여부를 확인하기 위하여 in vivo pot assay를 수행하였다. 지름 10 cm 포트에 바로커 상토(한국농자재 주식회사)를 180 g 채우고 고추 종자를 파종한 다음 25~35。(2로 유지되는 하우스에서 재배하였다.
- 토양 시료 lg 당 lx IO, 에서 lx 10-3까지 농도별로 희석한 R solmaceariim을 접종하였고 균주의 농도는 Haemacytometer (Marienfeld, Germany)를이용하여 계수하였다. 이후 R. solanacearume] 접종되어진 토양으로부터 DNA를 직접 추출하여 실험에 사용하였고 균주가 접종되지 않은 토양 시료를 대조군으로 사용하였다.
- solanacearum 현탁액 30 ml (107 CFU/ml)을 관주하여 발병을 유도하였다. 이후 모종의 발병을 확인하고 발병되어진 모종의 뿌리 근처의 도관으로부터 R. solaHaceanim을 분리하였으며, 분리되어진 균주의 genomic DNA를 회수하여 PCR 및 DNA EIA의 주형 DNA로 사용하였다.
- 잘못되어진 음성 결과와 교차오염을 방지하기 위하여 실험과정에 dUTP-uracil-N-glycosidase (UNG) 방법을 도입하였는데, PCR 수행시 dUTP가 첨가되어진 dNTP 혼합용액을 사용함으로써 반응 산물에 dUTP가 첨가되도록 하였다. 반응 조성에 10 U UNG를 첨가하고 반응 조건에 초기 37C에서 30분을 시행하여 UNG의 반응이 수행되도록 하였다.
- 토양 시료의 경우 500, 11 부피의 시료를 준비하였다. 준비되어진 시료에 DNAzol (MRC, USA) 1 ml을 첨가하여 잘 섞고, 이후 과정은 DNAzol 제조사에서 제시하는 사용 방법을 준수하였다. DNAzol 처리 이후 얻어진 DNA pellet에 200 μ1의 chelex-100 resin 5%를 첨가하여 10분간 끓인 다음 원심분리하고 상등액 5 μ1를 취하여 PCR 반응의 DNA 주형으로 사용하였다.
- 05% 2, 3, 5- triphenyltetrazolium chloride (TTC)가 포함되어진 TZC 고체 평판배지에서 28T의 온도로 배양되었고, 기타 다른 균주들은 Luria broth 배지에서 341로 배양되었다. 토양 시료 lg 당 lx IO, 에서 lx 10-3까지 농도별로 희석한 R solmaceariim을 접종하였고 균주의 농도는 Haemacytometer (Marienfeld, Germany)를이용하여 계수하였다. 이후 R.
- 토양으로부터 R. solanacearume\ genomic DNA를 주줄하기위하여 SDS 분해법, STET 상에서의 끓이는 방법, resin을 첨가하여 끓이는 방법과 DNAzol을 이용하는 방법을 각각 독립적으로 또는 복합적으로 적용하여 실험을 수행하였다. 동일한 시료로부터 각 방법들을 통하여 genomic DNA를 추출하고 이를 16S rDNA와 fliC 유전자를 증폭한 뒤 전기영동 상에서 PCR 반응 산물을 비교하였다.
대상 데이터
- 4)으로 3회 세척한 뒤 20이니의 PBS에 재현탁시켰다. 토양 시료의 경우 500, 11 부피의 시료를 준비하였다. 준비되어진 시료에 DNAzol (MRC, USA) 1 ml을 첨가하여 잘 섞고, 이후 과정은 DNAzol 제조사에서 제시하는 사용 방법을 준수하였다.
성능/효과
- solanacearum의 모든 아종에서 fliC 유전자 부위가 공통적으로 존재한다는 것을 확인하였다. 액체 배양의 경우, 순차적인 희석법으로 처리되어진 시료를 대상으로 위의 실험을 수행한 결과 IQ。, cell/g 농도의 시료까지 400 bp의 반응 산물을 전기영동 상에서 확인할 수 있었으며 1x103 cell/g 농도의 시료까지 247 bp의 반응 산물을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 토양 시료의 경우 400 bp의 반응 산물은 1x10s, 247 bp의 경우 IxlO3 cell/g 농도까지 확인할 수 있었다(Fig.
- solanacearum을 분리하고 genomic DNA를 추출하여 PCR 및 DNA EIA를 통하여 검출하고자 하였다. 4엽기 때의 모종에 R. solanacearum%: 관 주하고 발병 징후를 관찰한 결과, 관주 후 약 2주 내에 풋마름병의 증상을 보였으며 모종으로부터 분리되어진 R. solanacearum%: 본 실험에 사용되어진 방법으로 검출한 결과 PCR 산물을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- DSM9544 및 KACC의 9종의 R. solanacearum 아종에서 Rsol/Z/C primer 조합에 의하여 증폭되어진 400 bp의 PCR 반응 산물을 확인할 수 있었다. 반면 대조균주인 B.
- 사용되어졌으며 nested PCR의 조성은 동일하되, 반응 조건은 94℃ 30초, 55℃ 40초, 72℃ 30초로 구성된 30 cycles로 구성되었다. PCR 반응 결과 산물은 2.5% agarose 전기영동 상에서 확인하였다.
- 결론적으로 본 연구에서는 DNAzol과 chelex-100 resin을 이용흐} 여 토양으로부터 PCR 저해물질을 쉽게 제거흐}고 DNA를 빠르고 효율적으로 추출할 수 있었으며, Rsol/7/C primer 조합과 DNA ELISA 기법으로 R solanacearume} 검줄 감도 및 정확성을 높일 수 있었다. 최근 정 등(11)의 연구에서는 RT-PCR을 통하여 토양시료로부터 R.
- 동일한 시료로부터 각 방법들을 통하여 genomic DNA를 추출하고 이를 16S rDNA와 fliC 유전자를 증폭한 뒤 전기영동 상에서 PCR 반응 산물을 비교하였다. 그 결과 DNAzol-S- 사용하여 DNA를 추출하는 방법이 다른 방법들에 비하여 PCR 증폭 효율이 가장 우수하였으며, 추출과정을 비교하였을 때에도 효소의 반응을 수행시키는 단계, 층분리를 유도하는 단계 및 마지막 단계에서 알코올로 침전시키는 단계가 없기 때문에 소요 시간이나 처리 과정이 매우 빠르고 간편하였다. 이후 본 실험에서 적용한 chelex-100 resin 을 넣고 끓이는 방법은 토양 내에 존재하는 PCR 저해물질을 제거하는데 매우 효과적이었다(Fig.
- 본 실험에서 primaiy PCR을 통하여 증폭하고자 하였던 fliC는 R. solanacearum GMI1000의 696과 1095의 위치에 존재하는 유전자로써 실험 대상인 모든 R. solanacearum 아종에서 fliC 유전자의 400 bp PCR 반응 산물을 확인할 수 있었던 반면 Rso/awcearum과 유사한 토양내의 이종 세균에서는 검줄되지 않았다. /"C 유전자 내의 위치는 3종류의 biovai를 포함하는 6종류의 R.
- solanacearum을 검줄하였다. 연구 결과 fliC 유전자는 아종 간에도 공통적으로 갖고 있으며 균주 특이성도 매우 높은 것으로 확인되었으나 토양에서의 DNA 회수와 PCR 수율이 낮아서 검출 효율성이 떨어지는 것으로 보고되었다. 따라서 본 연구에서는 토양으로부터 순수한 DNA를 효율적으로 회수하고, 새로운 primer를 고안하여 PCR 산물의 특이성과 수율을 높이는 방법을 모색하는 한편 DNA enzyme-linked immunosorbent assay (DNA ELISA)의 방법을 적용하여 토양 내에 존재하는 R.
- 4). 위의 실험의 결과로 토양 시료의 경우에는 액체 배양액에 비하여 primary PCR 감도가 lx 10배 낮았고, nested PCR의 민감도는 primary PCR에 비하여 IxlO2 배 높았다.
- 데 있어서는 humic acid와 같은 반응 저해물질로 인한 어려움이 많다. 이들이 포함되어진 PCR 혼합 용액 내에서는 Thermus aquticus의 DNA 중합효소, Amplitaq Gold 뿐만 아니라 다른 다양한 종류의 내열성 DNA 중합효소 모두가 활성에 저해를 받는 것으로 알려져 있으며(16), 본 연구의 수행과정에서도 R. solanaceaiwi의 액체 배양액과 토양 시료에서 PCR 반응을 저해하는 또 다른 물질이 존재한다는 것도 알 수 있었다. 이에 본 연구에서는 일반적으로 사용되는 DNA 회수 방법을 개선하여 토양으로부터 빠르고 단순하면서도 PCR 저해 물질을 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 고안하였다.
- aeruginosa에서는 증폭이 되지 않았다. 이후 primary PCR을 주형으로 하는 nested PCR을 수행하여 247 bp의 PCR 반응 산물을 확인할 수 있었으며(Fig. 2), 이로써 실험에 사용되어진 R. solanacearum의 모든 아종에서 fliC 유전자 부위가 공통적으로 존재한다는 것을 확인하였다. 액체 배양의 경우, 순차적인 희석법으로 처리되어진 시료를 대상으로 위의 실험을 수행한 결과 IQ。, cell/g 농도의 시료까지 400 bp의 반응 산물을 전기영동 상에서 확인할 수 있었으며 1x103 cell/g 농도의 시료까지 247 bp의 반응 산물을 확인할 수 있었다(Fig.
- 그 결과 DNAzol-S- 사용하여 DNA를 추출하는 방법이 다른 방법들에 비하여 PCR 증폭 효율이 가장 우수하였으며, 추출과정을 비교하였을 때에도 효소의 반응을 수행시키는 단계, 층분리를 유도하는 단계 및 마지막 단계에서 알코올로 침전시키는 단계가 없기 때문에 소요 시간이나 처리 과정이 매우 빠르고 간편하였다. 이후 본 실험에서 적용한 chelex-100 resin 을 넣고 끓이는 방법은 토양 내에 존재하는 PCR 저해물질을 제거하는데 매우 효과적이었다(Fig. 1).
- fliC 유전자는 편모 단백질의 비기능적 위치를 담고 있기 때문에 병원성을 좌우하는 부분도 아니며 유전자의 수평적 이동도 발견되지 않는다(30). 즉 fliC 유전자는 종내와 아종간의 연관성이 깊기 때문에 R. solanacearum 의 검출을 위한 유전자 지표로서 매우 유효함을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 높일 수 있었다. 최근 정 등(11)의 연구에서는 RT-PCR을 통하여 토양시료로부터 R. eutropha의 모니터링을 수행하였는 바, 본 연구에서 수행한 DNA ELISA의 반정량적 특성 분석기법과 RT-PCR을 병행한다면 잠복기가 긴 R. solanacearum의 동태를 토양 시료로부터 직접 모니터링이 가능할 것으로 판단된다.
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