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문제 정의
- FACT는 Saccharomyces Cerevisiae Sptl6/Cdc68의 인간 유사체와 high mobility froup-1-like protein structure-specific recognition protein-1 (SSRP-1) 의 이종단백질 복합체이다. 본 논문에서는 FACT의 단위체인 hSptl6의 발현이 휴지기의 T98G 세포에서 급격히 감소됨을 면역형광 분석법과 Western blot 분석법을 이용하여 관찰하였다. 이와 반대로 증식기의 T98G 세포에서는 hSptl6이 높은 수준으로 발현되고 있는 것이 관찰되었다.
- 하지만 현재까지 인간 세포에서 hSptl6을 포함하고 있는 FACT 복합체와 세포 주기 사이의 연관 관계에 관한 연구는 이루어지지 않았다. 본 연구에서는 세포 주기에 따른 FACT 복합체의 단위체인 hSptl6 과 SSRP1 단백질의 발현 양상을 각각 분석하였다. hSptl6의 경우 휴지기 세포에서는 발현이 급격히 감소하였으며 세포 주기가 진행됨에 따라 발현이 증가함을 관찰할 수 있었다.
제안 방법
- 이것을 Bio-Rad kit를 이용하여 PVDF membrane으로 옮긴 후 5% skim milk로 실온에서 2시간 동안 blocking 하였다, 일차 항체인 anti-FACT/cdc68 (Upstate, Lake Placid, NY)을 5% skim milk에 1:1000으로 희 석하여 4℃ 에서 9시간 처리하였다. Cyclin DI (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruzz CA) 항체와 SSRP1 (Santa Cruz Biotechnology) 항체는 1:200으로 Cyclin Bl(Cell Signaling) 항체는 1:1000으로 희 석하여 처리하였다. 일차 항체 처리 후 TB&T로 5회 씻어내고 이차 항체를 1:2500으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 처리하였다.
- 24시간 후에 한 well 은 항생제만 첨가된 DMEM으로 두 번 씻어준 후 DMEM으로 배지를 교환하고 asynchronouse T98G 세포주는 10%의 FBS가 첨가된 DMEM배지로 교환한다. DMEM에서 72시간 동안 배양한 T98G 세포주와 10%의 FBS가 첨가된 DMEM에서 배양된 T98G 세포주를 원심분리 하여 모은다. PBS로 1회 씻어준 후 1ml의 nuclear isolation buffer(0.
- 1% NP40, 50ng/ml propidium iodide, lOmg/ml RNase, PBS)에 T98G 세포주를 현탁시키고 4V 어두운 조건에서 20분간 반응시킨다. FACS buffer(l% BSA, 0.2% NaN)로 두 번 씻어준 후 300μl의 FACS buffer에 현탁시킨 후 flow cytometer로 분석하였다.
- FBS가 첨가되지 않은 DMEM에서 배양한지 72시간 후에 배지를 제거하고 PBS로 씻어준다, 4% paraf- ormaldehyde를 20분간 처리하여 고정시키고 0.3% Triton X-100을 10분간 실온에서 처리하였다. 4% BSA를 처리하여 1시간 동안 blocking시켰다.
- 3B). 우리는 또한 면역형광 분석법을 이용하여 hSptl6이 발현되는 위치와 세포주기에 따른 발현 양의 변화를 관찰하였다. Fig.
- 주기를 휴지기(G0)에 정지시켰다. 이를 확인하기 위하여 propidium iodide(PI)으로 DNA를 염색한 후 세포주기를 flow cytometry 분석 법을 수행하였다. Fig.
- 일차 항체를 anti-FACT/ cdc68 (upstate)# 처리한 경우에는 anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology)를 이차 항체로 처리하였고, Cydin D1 항체와 Cyclin Bl 항체를 사용한 경우에는 anti-mouse IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology)를 이차 항체로 사용하였으며, SSRP1 항체를 사용한 membranee anti-goat IgG-HRP (Santa Cruz Bio- technology)를 사용하였다. 이차 항체를 처리 한지 1시간 후에 PVDF membrane을 TBS-T로 4~5회 씻어낸 후 ECL detection system (Santa Cruz Biotechnology)을 이용하여 Sptl6의 양을 측정하였다. Western blot의 결과는 필름을 scan 한 후 Multi-Gage 프로그램을 이용하여 정량 하였다.
- 인간 세포에서 세포 주기에 따른 FACT 복합체의 발현 양상을 분석하기 위하여 인간 뇌로부터 유래한 다형성 아교모세포종 세포주인 T98G 세포주를 FBS 없이 배양하여 세포 분열 주기를 휴지기(G0)에 정지시켰다. 이를 확인하기 위하여 propidium iodide(PI)으로 DNA를 염색한 후 세포주기를 flow cytometry 분석 법을 수행하였다.
- 4% BSA를 처리하여 1시간 동안 blocking시켰다. 일차 항체인 anti-FACT/cdc68을 1:400으로 PBS에 희 석하여 1시간 동안 실온에서 처리하고 이차 항체인 anti-rabbit IgG-fluorescence(Molecular Probes, Junction City, OR)를 PBS에 1:400으로 희석하여 어두운 조건에서 1시간 동안 처리하였다. PI를 50 ng/ml으로 희석하여 1분간 어두운 상태에서 처리한 후 ProLong® Gold antifade reagent (Molecular Probes)> 떨어뜨리고 sealing한다.
대상 데이터
- 세포배양에 필요한 배지 Dulbecco's modified Eagles medium(DMEM)과 배지에 첨가하는 항생제 (120 pg penicillin/ml, and 200 pg streptomycin/ml) 및 FBS(fetal bovine serum)은 Hyclone(Loganz UT) 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용한 T98G세포주(CRL-1690)는 American Type Culture Collection(Rovillez MD, USA)로부터 분양 받아 사용하였다. 세포배양에 필요한 배지 Dulbecco's modified Eagles medium(DMEM)과 배지에 첨가하는 항생제 (120 pg penicillin/ml, and 200 pg streptomycin/ml) 및 FBS(fetal bovine serum)은 Hyclone(Loganz UT) 제품을 사용하였다.
이론/모형
- 이차 항체를 처리 한지 1시간 후에 PVDF membrane을 TBS-T로 4~5회 씻어낸 후 ECL detection system (Santa Cruz Biotechnology)을 이용하여 Sptl6의 양을 측정하였다. Western blot의 결과는 필름을 scan 한 후 Multi-Gage 프로그램을 이용하여 정량 하였다.
- 4℃Z 13000rpm에서 10분간 원심분리 한 후 상층 액을 새 tubc로 옮기고 이것을 이용하여 단백질을 정량 하였다. 단백질의 정 량은 Bradford method를 이용하였고, 표준 단백 시료는 bovine serum albumin (BSA)을 사용하였다. 동일 량의 단백시료를 NuPAGE LDS sample buffer (4X, invitrogen)와 섞은 후 90C에서 5분간 끓이고, NuPAGE gel (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 80V에서 전기영동을 하였다.
- 세포주기의 변화가 FACT 복합체의 단위체중 하나인 SSRP1 단백질 발현에 영향을 미치는지 알아보기 위해 Western blot을 수행하였다. 다른 단위 체인 hSptl6과는 달리 세포주기가 Go기에 정지되어 있는 T98G 세포와 세포주 기가 진행되고 있는 T98G 세포에서 SSRP1 단백질 발현 수준이 변화가 없음을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 이러한 세포주기의 변화가 FACT 복합체의 단위체중 하나인 hSptl6 단백질 발현에 영향을 미치는지 알아보기 위해 Western blot을 수행하였다. Fig.
- 1의 결과에서 보듯이 FBS 없이 배양한 T89G 세포는 세포 주기가 G)기로 정지되어 세포분열이 일어나지 않음을 확인할 수 있었으며, 이와 대조적으로 10% FBS 첨가 하에서 배양한 T89G 세포는 Gl, S, G2/M기의 다양한 주기에 세포가 분포되어 있음을 관찰하였다. 이를 다시 한번 확인하기 위하여 세포주기의 초기인 G1 기에서 S기로 이전되는 과정에서 특이적으로 발현된다고 알려진 cyclin 이과 G2/M기로 진행되는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 cyclin Bl의 단백질 수준을 Western blot을 이용하여 측정하였다. Fig.
성능/효과
- 이를 확인하기 위하여 propidium iodide(PI)으로 DNA를 염색한 후 세포주기를 flow cytometry 분석 법을 수행하였다. Fig. 1의 결과에서 보듯이 FBS 없이 배양한 T89G 세포는 세포 주기가 G)기로 정지되어 세포분열이 일어나지 않음을 확인할 수 있었으며, 이와 대조적으로 10% FBS 첨가 하에서 배양한 T89G 세포는 Gl, S, G2/M기의 다양한 주기에 세포가 분포되어 있음을 관찰하였다. 이를 다시 한번 확인하기 위하여 세포주기의 초기인 G1 기에서 S기로 이전되는 과정에서 특이적으로 발현된다고 알려진 cyclin 이과 G2/M기로 진행되는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 cyclin Bl의 단백질 수준을 Western blot을 이용하여 측정하였다.
- 우리는 또한 면역형광 분석법을 이용하여 hSptl6이 발현되는 위치와 세포주기에 따른 발현 양의 변화를 관찰하였다. Fig. 4의 결과에서 보듯이 세포주기가 G0기에 정지되어 있는 T98G 세포에 비해 세포주기가 진행되고 있는 T98G 세포에서 FITC로 염색된 hSptl6 양이 감소함을 관찰할 수 있었다. 또한 PI를 이용하여 핵을 염색하고 hSptl6의 세포 내 위치를 측정한 결과 기존의 문헌에서 보고된 바와 같이 핵 속에 존재하고 있음이 관찰되었다 (Fig.
- 3A의 결과에서 보듯이 세포주기가 Go기에 정지되어 있는 T98G 세포에서는 세포주기가 진행되고 있는 T98G 세포와 비교하여 볼 때 hSptl6 단백질의 발현 수준이 급격히 감소되어 있음을 관찰할 수 있다. Fig.3A의 결과를 정량적으로 분석해보면 세포주기가 Go기에 정지되어 있는 T98G 세포에 비해 세포주기가 진행되고 있는 T98G 세포에서 hSptl6가 18.5배 많이 발현됨을 알 수 있었다 (Fig. 3B). 우리는 또한 면역형광 분석법을 이용하여 hSptl6이 발현되는 위치와 세포주기에 따른 발현 양의 변화를 관찰하였다.
- blot을 수행하였다. 다른 단위 체인 hSptl6과는 달리 세포주기가 Go기에 정지되어 있는 T98G 세포와 세포주 기가 진행되고 있는 T98G 세포에서 SSRP1 단백질 발현 수준이 변화가 없음을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).
- 4)[6]. 위의 결과들로부터 FACT 단백질 복합체의 단위체인 HSptl6이 휴지기 상태의 세포에서 보다 증식 이 일어나고 있는 세포에서 발현이 증가함을 알 수 있다.
- 2의 결과에서 보듯이 세포주기가 Go기로 정지되어 있는 T98G 세포에서는 cyclin 이과 cyclin Bl의 발현이 관찰되지 않는 반면 세포주기가 진행되고 있는 T98G 세포에서는 cyclin 이과 cyclin Bl의 발현이 관찰되었다. 위의 결과들로부터 FBS가 없는 조건하에서 T98G 세포를 배양할 경우 T98G 세포가 G0기에 세포주기가 정지함을 알 수 있었다.
후속연구
- 이러한 결과는 chromatin assembly factor-1 (CAF-1) 이라는 히스톤 chaperone 이 증식이 일어나고 있는 세포에서 과발현된다는 기존의 연구 결과와 일치하고 있다[20]. 본 연구 결과는 hSptl6 단백질이 세포증식의 표지로 사용될 수 있음을 제시하였고 또한 다양한 암의 진단에 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
- hSptl6의 경우 휴지기 세포에서는 발현이 급격히 감소하였으며 세포 주기가 진행됨에 따라 발현이 증가함을 관찰할 수 있었다. 이 결과로부터 우리는 hSptl6의 세포증식에 대한 표지 단백질로서의 활용 가능성을 제시하였다.
- FACT의 또 다른 단위체 SSRP-1 의 발현은 휴지기나 증식기의 세포에서 변화가 없음이 관찰되었다. 이상의 결과로부터 hSptl6이 발현이 세포의 증식과 연관이 되어 있음을 알 수 있었고 세포 증식 표지 인자로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
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