[국내논문]Toll-like receptor 2, 3, 4의 신호전달체계 조절을 통한 curcumin의 항암${\\cdot}$항염증 효과 Anti-cancer and Anti-inflammatory Effects of Curcumin by the Modulation of Toll-like Receptor 2, 3 and 4원문보기
TLRs는 병원균이 숙주의 몸 속에 들어 왔을 때, 병원균들이 가지고 있는 독특한 구조를 인식하여 선천성 면역반응과 뒤이어 후천성 면역반응을 유도하는 중요한 역할을 한다. 우리는 이번 실험을 통하여 curcumin이 선행연구에서 밝혀낸 TLR4 뿐만 아니라 TLR2와 TLR6 그리고 TLR3를 또한 분자학적인 타깃으로 할 수 있다는 것을 알아내었다. Curcumin이 MALP-2(TLR2,6 agonist)에 의해서 유도된 IRAK-1 degradation을 억제시켰다. 이러한 결과는 curcumin의 분자학적인 타깃이 IRAK-1위에 놓여 있으며, TLR2와 TLR6가 될 것이라는 가능성을 제시해 준다고 할 수 있다. 또한 curcumin은 viral 자극제인 poly[I:C](TLR3 agonist)에 의해서 유도된 IRF3나 $NF-{\kappa}B$ 활성화를 억제하였지만, TRIF에 의해서 유도된 IRF3 활성화는 억제시키지를 못하였다. 이러한 결과 또한 TLR3 자체가 curcumin의 분자학적인 타깃이라는 가능성을 제시해 준다고 할 수 있겠다. 이러한 결과를 종합해 볼때, curcumin의 분자학적인 타깃이 $IKK{\beta}$ 이외에 모든 TLRs가 될 수 있다는 가능성을 제시해 준다고 할 수 있겠다. 이러한 결과는 curcumin이 그람음성균 뿐만이 아니라 바이러스나 박테리아 등 여러 병원균들로부터 유도되는 염증반응이나 만성적인 질병들을 조절할 수 있다는 것을 보여주는 결과라 할 수 있겠다.
TLRs는 병원균이 숙주의 몸 속에 들어 왔을 때, 병원균들이 가지고 있는 독특한 구조를 인식하여 선천성 면역반응과 뒤이어 후천성 면역반응을 유도하는 중요한 역할을 한다. 우리는 이번 실험을 통하여 curcumin이 선행연구에서 밝혀낸 TLR4 뿐만 아니라 TLR2와 TLR6 그리고 TLR3를 또한 분자학적인 타깃으로 할 수 있다는 것을 알아내었다. Curcumin이 MALP-2(TLR2,6 agonist)에 의해서 유도된 IRAK-1 degradation을 억제시켰다. 이러한 결과는 curcumin의 분자학적인 타깃이 IRAK-1위에 놓여 있으며, TLR2와 TLR6가 될 것이라는 가능성을 제시해 준다고 할 수 있다. 또한 curcumin은 viral 자극제인 poly[I:C](TLR3 agonist)에 의해서 유도된 IRF3나 $NF-{\kappa}B$ 활성화를 억제하였지만, TRIF에 의해서 유도된 IRF3 활성화는 억제시키지를 못하였다. 이러한 결과 또한 TLR3 자체가 curcumin의 분자학적인 타깃이라는 가능성을 제시해 준다고 할 수 있겠다. 이러한 결과를 종합해 볼때, curcumin의 분자학적인 타깃이 $IKK{\beta}$ 이외에 모든 TLRs가 될 수 있다는 가능성을 제시해 준다고 할 수 있겠다. 이러한 결과는 curcumin이 그람음성균 뿐만이 아니라 바이러스나 박테리아 등 여러 병원균들로부터 유도되는 염증반응이나 만성적인 질병들을 조절할 수 있다는 것을 보여주는 결과라 할 수 있겠다.
Toll-like receptors induce innate immune responses recognizing conserved microbial structural molecules that are known as pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). Ligand-induced homotypic oligomerization was found to proceed in LPS-induced activation of TLR4 signaling pathways. TLR2 is known ...
Toll-like receptors induce innate immune responses recognizing conserved microbial structural molecules that are known as pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). Ligand-induced homotypic oligomerization was found to proceed in LPS-induced activation of TLR4 signaling pathways. TLR2 is known to heterodimerize with TLR1 or TLR6 and recognize diacyl- or triacyl-lipopeptide, respectively. These results suggest that ligand-induced receptor dimerization of TLR4 and TLR2 is required for the activation of downstream signaling pathways. Therefore, receptor dimerization may be one of the first lines of regulation in the activation of TLR-mediated signaling pathways and induction of subsequent innate and adaptive immune responses. Here, we report biochemical evidence that curcumin from the plant Curcuma longa inhibits activation of $NF-{\kappa}B$, expression of COX-2, and dimerization of TLRs induced by TLR2, TLR3 and TLR4 agonists. These results imply that curcumin can modulate the activation of TLRs and subsequent immune/inflammatory responses induced by microbial pathogens.
Toll-like receptors induce innate immune responses recognizing conserved microbial structural molecules that are known as pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). Ligand-induced homotypic oligomerization was found to proceed in LPS-induced activation of TLR4 signaling pathways. TLR2 is known to heterodimerize with TLR1 or TLR6 and recognize diacyl- or triacyl-lipopeptide, respectively. These results suggest that ligand-induced receptor dimerization of TLR4 and TLR2 is required for the activation of downstream signaling pathways. Therefore, receptor dimerization may be one of the first lines of regulation in the activation of TLR-mediated signaling pathways and induction of subsequent innate and adaptive immune responses. Here, we report biochemical evidence that curcumin from the plant Curcuma longa inhibits activation of $NF-{\kappa}B$, expression of COX-2, and dimerization of TLRs induced by TLR2, TLR3 and TLR4 agonists. These results imply that curcumin can modulate the activation of TLRs and subsequent immune/inflammatory responses induced by microbial pathogens.
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문제 정의
우리는 이번 연구를 통하여 curcumin이 여러 TLR agonists에 의해서 유도된 TLRs의 이합체의 형성과 NF-kB 활성화를 억제시키는지를 알아보고자 하였다. 이러한 발견은 TLRs에 의해서 조절되는 염증반응이나 또는 뒤이어 발생하는 만성적인 질병들이 우리가 흔히 먹는 식품들에 포함되어 있는 phytochemicals에 의해서 조절되어질 수 있다는 중요한 가능성을 제시해 줄 수 있다고 할 수 있겠다.
다음 실험으로, TLRs에 의해서 유도되는 신호 전달 체계의 활성화와, 뒤이어 발생하는 선천성 면역반응과 후천성 면역반응을 유도하기 위해서 최초로 일어나는 반응 중 하나로 알려져 있는 이합체의 형성을 curcumin이 억제시키는지를 알아보았다. 선행연구에서 발표된 바와 같이 cureumine LPS에 의해서 유도된 TLR4 의 이합체의 형성을 억제시켰다(Fig.
26). 그러므로 본 연구에서 co-immunoprecipitation과 immunoblotting에의해서 TLR2왠 TLR6의 이종 이합체의 형성이 curcumin에 의해서 억제되는지를 알아보았다. 이 실험을 위해서 HA-tagged TLR2 와 Flag-tagged TLR6가 293T 세포 안으로 transfection되었으며, immunoprecipitation과 immunoblotting으로 TLR2와 TLR6의 이합체의 형성을 알아보았다.
Curcumin이 MALP-2(TLR2,6 agonist)에 의해서 유도된 IRAK-1 degradation을 억제시켰다. 이러한 결과는 curcumin의 분자학적인 타깃이 IRAK-I위에 놓여 있으며, TLR2와 TLR6가 될 것이리는 가능성을 제시해 준다고 할 수 있다. 또한 curcumine viral 자극제인 poly[I:C](TLR3 agonist)에 의해서 유도된 1RF3나 NF-kB 활성회를 억제하였지만, TRIF에 의해서 유도된 IRF3 활성화는 억제시키지를 못하였다.
제안 방법
발광효소 plasmid와 HSP70-p-galactosi- dase plasmid는 Superfect transfection 시으/(Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 세포 안으로 transfection시켰다. 신호 전달 체계의 구성요소인 여러 발현 plasmid나 같은 양의 empty vector를 trans-fection시켰다. 발광효소의 활성화는 Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI)을 사용하여 측정하였으며, Luminometer 는 Centro LB 960( Berthold Technology, Bad Wildbad, Ger- many)을 사용하였다.
발광효소의 활성화는 Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI)을 사용하여 측정하였으며, Luminometer 는 Centro LB 960( Berthold Technology, Bad Wildbad, Ger- many)을 사용하였다. 발광효소의 활성화는 0-gaIactosidase의 활성화를 즉정하여 표준화시켰다.
1% Tween 20 그리고 5% 탈지 건조된 우유를 포함하고 있는 phosphate-buffered saline을 가지고 blocking하였다. Membranee 1차 항체를 가지고 blotting하고, horseradish peroxidase와 복합된 2차 항체에 노출시킨 다음, ECL Western blot detection 시약을 사용하여 원하는 단백질을 구명하였다.
그러므로 본 연구에서 co-immunoprecipitation과 immunoblotting에의해서 TLR2왠 TLR6의 이종 이합체의 형성이 curcumin에 의해서 억제되는지를 알아보았다. 이 실험을 위해서 HA-tagged TLR2 와 Flag-tagged TLR6가 293T 세포 안으로 transfection되었으며, immunoprecipitation과 immunoblotting으로 TLR2와 TLR6의 이합체의 형성을 알아보았다. 그 결과 TLR2는 TLR6와 이종 이합체를 형성하였으나, 이종 이합체의 형성은 curcumin에 의해서 억제되지 않았다(Fig.
대상 데이터
실험에 사용한 ciircuniine Biomol(Plymouth Meeting, PA)로부터 구입하였다. MALP-2(Macrophage-activating lipopeptide of 2 kDa), LPS 그리고 poly[l:C]는 Alexis Biochemical, List Biological Lab 그리고 Amei'sham Biosciences 회사로부터 각각 구입하였다.
구입하였다. MALP-2(Macrophage-activating lipopeptide of 2 kDa), LPS 그리고 poly[l:C]는 Alexis Biochemical, List Biological Lab 그리고 Amei'sham Biosciences 회사로부터 각각 구입하였다. 항체 GFP(green fluorescent protein)는 Molecular Probes (Eugene, OR) 회사로부터 구입하였고, COX-2, IRAK-1 그리고 actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA) 회사로부터 구입하였다.
MALP-2(Macrophage-activating lipopeptide of 2 kDa), LPS 그리고 poly[l:C]는 Alexis Biochemical, List Biological Lab 그리고 Amei'sham Biosciences 회사로부터 각각 구입하였다. 항체 GFP(green fluorescent protein)는 Molecular Probes (Eugene, OR) 회사로부터 구입하였고, COX-2, IRAK-1 그리고 actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA) 회사로부터 구입하였다. 그 밖의 다른 시약들은 Sigma-Aldrich 회사로부터 구입하였다.
RAW264.7 cell(a murine monocytic cell line, ATCC TIB-71) 과 293T cell(human embryonic kidney)은 10%(v/v) FBS, 100 units/ml Penicillin, 100 ㎍/ml streptomycin을 포함하고 있는 Dol- becco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양하였다. 또한 이 실험을 위해서 , TLR4(Flag-, GFP-tagged), CD 14, MD2(Flag- tagged) 단백질들이 안정되게 발현되도록 만들어진 Ba/F3 세포가 사용되었다(19).
7 cell(a murine monocytic cell line, ATCC TIB-71) 과 293T cell(human embryonic kidney)은 10%(v/v) FBS, 100 units/ml Penicillin, 100 ㎍/ml streptomycin을 포함하고 있는 Dol- becco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양하였다. 또한 이 실험을 위해서 , TLR4(Flag-, GFP-tagged), CD 14, MD2(Flag- tagged) 단백질들이 안정되게 발현되도록 만들어진 Ba/F3 세포가 사용되었다(19). 세포들은 5% CO/air를 포함하고 있는 3TC 배양기 안에서 배양하였다.
NF-kB 발광 plasmid는 F. Mercurio(Sign이 Pharmaceuticals, San Diego, CA)로 제공받았으며, heat shock protein 70-p-galac- tosidase plasmid는 R. Mod I in(Uni verity of Califbmia, Los Angeles, CA)으로부터 제공받았다. MyD88 plasmid는 J.
Mod I in(Uni verity of Califbmia, Los Angeles, CA)으로부터 제공받았다. MyD88 plasmid는 J. Echopp(University of Lausanne, Lausanne, Switzerland)으로부터, IFNg PRD I1I-I 발광 plasmid와 TRIF plasmid는 K. Fitzgerald(University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)로부터 그리고 IKKO plasmid는 M Karin(University of California, San Diego, CA)으로부터 제공되었다. Transfection 을 위한 모든 DNA는 Endo Free Plasmid Maxi kit(Qiagen)을 사용하여 준비되었다.
Fitzgerald(University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)로부터 그리고 IKKO plasmid는 M Karin(University of California, San Diego, CA)으로부터 제공되었다. Transfection 을 위한 모든 DNA는 Endo Free Plasmid Maxi kit(Qiagen)을 사용하여 준비되었다.
5A). 이 실험을 위해서 TLR4 (Flag-, GFP-tagged), CD 14, MD2(Flag-tagged) 단백질들이 안정되게 발현되어지도록 만들어진 Ba/F3 세포가 사용되었다. Cwcumin 은 또한 같은 세포에서 LPS에 의해서 유도된 IRAK-1 degradation 을 억제하였다(Fig.
이론/모형
NF-kB 발광효소 유전자 분석은 선행연구에서 사용한 방법에 의하여 분석하였다(23, 24). 발광효소 plasmid와 HSP70-p-galactosi- dase plasmid는 Superfect transfection 시으/(Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 세포 안으로 transfection시켰다.
신호 전달 체계의 구성요소인 여러 발현 plasmid나 같은 양의 empty vector를 trans-fection시켰다. 발광효소의 활성화는 Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI)을 사용하여 측정하였으며, Luminometer 는 Centro LB 960( Berthold Technology, Bad Wildbad, Ger- many)을 사용하였다. 발광효소의 활성화는 0-gaIactosidase의 활성화를 즉정하여 표준화시켰다.
성능/효과
TLRs는 병원균이 숙주의 몸 속에 들어 왔을 때, 병원균들이 가지고 있는 독특한 구조를 인식하여 선천성 면역반응과 뒤이어 후천성 면역반응을 유도하는 중요한 역할을 한다. 우리는 이번 실험을 통하여 curcumin이 선행연구에서 밝혀낸 TLR4 뿐만 아니라 TLR2와 TLR6 그리고 TLR3를 또한 분자학적인 타깃으로 할 수 있다는 것을 알아내었다. Curcumin이 MALP-2(TLR2,6 agonist)에 의해서 유도된 IRAK-1 degradation을 억제시켰다.
(15-17). 본 연구에서 curcumine RAW264.7 세포 안에서 MALP- 2(TLR2와 6 agonist), LPS(TLR4 agonist) 그리고 poly[l:C](TLR3 agonist)에 의해서 유도된 NF-kB 활성화와 COX-2 발현을 억제하였다(Fig. 2A-F). 또한 curcumine LPS(TLR4 agonist)와 polyu:C] (TLR3 agonist)에 의해서 유도된 IRF3 활성화를 억제하였다(Fig.
TLRs는 MyD88 신호 전달체계를 통하여 NF-kB 활성화를 유도하고, TRIF 신호 전달체계를 통하여 NF-kB와 IRF3 활성화를 유도한다. 그러므로 이러한 모든 결과는 curcumin이 여러 TLR agonists에 의해서 유도된 신호 전달체계를 억제한다는 것을 의미한다.
Curcumine MyD88 이나 IKK&의 overexpression에 의해서 유도된 NF-kB 활성화를 억제하였다(Fig. 4A, B). 이러한 결과는 curcumin이 TLRs의 MyD88를 통한 신호전달체계를 억제한다는 것을 의미한다.
이 실험을 위해서 HA-tagged TLR2 와 Flag-tagged TLR6가 293T 세포 안으로 transfection되었으며, immunoprecipitation과 immunoblotting으로 TLR2와 TLR6의 이합체의 형성을 알아보았다. 그 결과 TLR2는 TLR6와 이종 이합체를 형성하였으나, 이종 이합체의 형성은 curcumin에 의해서 억제되지 않았다(Fig. 5C). 그러나, RAW세포 안에서 curcumine MALP-2에 의해서 유도된 [RAK니 degradation을 억제시켰다(Fig.
그러므로 TLRs 이합체의 형성은 신호전달체계의 활성화나, 타깃 유전자의 발현을 위해서 중요한 최초의 빈응중의 하나이다. 본 연구 결과 LPS 에 의해서 유도된 TLR4의 이합체의 형성은 curcumin에 의해서 억제되었다(Fig. 5A). 그러나 293T cell에서 ligand에 독립적인 TLR의 overexpression에 의한 TLR2와 TLR6의 이합체의 형성은 curcumin에 의해서 억제되지를 못하였다.
이러한 결과 또한 TLR3 자체가 cmumin의 분자학적인 타깃이라는 가능성을 제시해 준다고 할 수 있겠다. 이러한 결과를 종합해 볼때, curcumin의 분자학적인 타깃이 IKK0 이외에 모든 TLRs가 될 수 있다는 가능성을 제시해 준다고 할 수 있겠다. 이러한 결과는 curcumin0] 그람음성균 뿐만이 아니라 바이러스나 박테리아 등 여러 병원균들로부터 유도되는 염증반응이나 만성적인 질병들을 조절할 수 있다는 것을 보여주는 결과라 할 수 있겠다.
후속연구
7 cells안에서 MALP-2에 의해 유도된 TLR2와 TLR6의 이합체 형성을 co-immunoprecipitation으로 보고자 하였으나, 세포 안에서 자체적으로 발현하는 TLRs의 단백질양이 충분하지를 않기 때문에 이합체의 형성을 볼 수 없었다. 그래서 TLR4 stable cells과 같이 앞으로 TLR2와 TLR6 stable cells을 이용한 실험이 필요할 것으로 생각한다.
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