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문제 정의
- 그 일환으로 본 연구는 약용 부위 채취 후의 강황 부산물을 ethanol로 추출하고 그 ethanol 엑스를 몇 가지 용매로 분획하여 얻은 각 분획물에 대해 DPPH free radical 소거활성 및 superoxide quenching 효과를 측정한 결과 ethyl acetate 가용분획에서 가장 강한 활성이 확인되어 ethyl acetate 분획에서 항산화 물질을 분리하고자 실험을 진행하였다. 그 결과 2종의 화합물을 단리하고 그 구조를 확인한 후 2종의 화합물에 대해 항산화 활성을 최종 확인하였기에 이를 보고하고자 한다.
- 따라서 강황 재배 후의 다량으로 발생되는 부산물의 다각적인 이용이 연구되어야 할 것으로 생각된다. 그 일환으로 본 연구는 약용 부위 채취 후의 강황 부산물을 ethanol로 추출하고 그 ethanol 엑스를 몇 가지 용매로 분획하여 얻은 각 분획물에 대해 DPPH free radical 소거활성 및 superoxide quenching 효과를 측정한 결과 ethyl acetate 가용분획에서 가장 강한 활성이 확인되어 ethyl acetate 분획에서 항산화 물질을 분리하고자 실험을 진행하였다. 그 결과 2종의 화합물을 단리하고 그 구조를 확인한 후 2종의 화합물에 대해 항산화 활성을 최종 확인하였기에 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- DPPH free radical 소거법에 의한 항산화활성8)− 96 well plate에 시료를 EtOH로 각 농도별로 조제한 용액에 0.2 mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (EtOH)을 일정량씩 가하였다.
- 이들 분획물에 대해 DPPH free radical 소거 활성과 riboflavin 및 xanthin 유래 superoxide quenching 효능을 측정하여 이 중 가장 강한 항산화 활성을 보인 ethyl acetate분획에서 물질 분리를 시도하였다. Ethyl acetate분획 을 Sephadex LH-20(MeOH) column chromatography를 실시한 후 TLC 양상에 따라 8개 분획(E1-E8)으로 나누었다. 이 중 주요 반점을 나타낸 E7과 E8에서 물질 분리를 시도하였다.
- 항산화효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거작용을 3회 반복하여 측정하였다.
- 강황 지상부로부터 얻은 ethanol 엑스를 용매로 계통분획하여 n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate 및 nbutanol엑스를 제조하였다. 이 중 가장 강한 DPPH radical 소거활성(Fig.
- 강황 지상부의 ethanol 추출물 중 ethyl acetate분획에서 항산화 활성을 갖는 2종의 화합물을 단리하였으며, 이들의 spectral data로부터 구조를 확인한 결과 1,2,3,4,6-penta-Ogalloyl-β-D-glucopyranoside (1)와 gallic acid (2)로 각각 확인·동정하였다.
- 9 kg을 ethanol로 가끔 진탕하면서 5시간씩 50℃에서 3회 온침 추출하였다. 그 추출액을 수욕 상에서 감압농축하여 ethanol 엑스 약 290 g을 얻었으며, 이 ethanol 엑스를 증류수로 현탁시키고 상법에 따라 동량의 nhexane(46 g), methylene chloride(3.8 g), ethyl acetate(2.4 g) 및 n-butanol(14.9 g)의 순으로 용매 분획하여 각각의 분획 물을 얻었다. 이들 분획물에 대해 DPPH free radical 소거 활성과 riboflavin 및 xanthin 유래 superoxide quenching 효능을 측정하여 이 중 가장 강한 항산화 활성을 보인 ethyl acetate분획에서 물질 분리를 시도하였다.
- 반응 혼합액은 2.6 µM riboflavin, 13 mM methionine, 75 µM NBT, 0.1 mM EDTA, PBS(pH 7.4) 및 여러 농도의 시료로 이루어졌다.
- 강황 지상부로부터 얻은 ethanol 엑스를 용매로 계통분획하여 n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate 및 nbutanol엑스를 제조하였다. 이 중 가장 강한 DPPH radical 소거활성(Fig. 1)과 riboflavin 및 xanthin 유래 superoxide quenching 효능(자료 생략)을 나타낸 ethyl acetate 분획물을 몇가지 column chromatography를 반복 실시하여 2종의 페놀성 물질을 단리하였다(Fig. 2).
- Ethyl acetate분획 을 Sephadex LH-20(MeOH) column chromatography를 실시한 후 TLC 양상에 따라 8개 분획(E1-E8)으로 나누었다. 이 중 주요 반점을 나타낸 E7과 E8에서 물질 분리를 시도하였다. E7과 E8을 JAI GS-310 column (MeOH)으로 정제 하여 화합물 1 (9 mg)과 화합물 2 (15 mg)을 각각 얻었다.
- 9 g)의 순으로 용매 분획하여 각각의 분획 물을 얻었다. 이들 분획물에 대해 DPPH free radical 소거 활성과 riboflavin 및 xanthin 유래 superoxide quenching 효능을 측정하여 이 중 가장 강한 항산화 활성을 보인 ethyl acetate분획에서 물질 분리를 시도하였다. Ethyl acetate분획 을 Sephadex LH-20(MeOH) column chromatography를 실시한 후 TLC 양상에 따라 8개 분획(E1-E8)으로 나누었다.
- 이상과 같이 강황 지상부의 ethanol 추출물 분획 중 DPPH free radical 소거활성과 riboflavin 및 xanthine 유래 superoxide quenching 효능이 가장 좋은 ethyl acetate 분획으로부터 물질 2종을 분리하여 그 구조를 동정하였다. 화합물 1과 2는 본 식물에서 처음 보고되는 화합물이며, 분리된 화합물의 DPPH free radical 소거활성은 Fig.
- 이상의 자료를 토대로 화합물 1은 glucose의 hydroxyl radical이 5개의 galloyl기로 치환된 화합물로 추정하였으며 기존 문헌12)의 data와 비교하여 화합물 1을 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranoside 로 확인·동정하였다.
- 이상의 자료를 토대로 화합물 2는 gallic acid로 추정하였으며 기존 문헌13,14)의 data와 비교하여 확인·동정하였다.
- 추출 및 분리 − 신선한 강황 지상부를 음건 세절한 다음 건조하여 얻은 시료 약 1.9 kg을 ethanol로 가끔 진탕하면서 5시간씩 50℃에서 3회 온침 추출하였다.
대상 데이터
- 추출 및 분획용 시약은 1급 용매를 사용하였으며, TLC 및 column용 시약 등은 1급 용매를 재증류하여 사용하거나, 특급시약을 사용하였다. Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60 (Art. 1.07734, 230-400 mesh, Merck)이며, molecular sieve column chromatography용 packing material은 Sephadex LH-20 (Pharmacia)을 사용하였다. TLC plate는 Kiesel gel 60 F254 precoated plate (Art.
- 10초간 진탕한 후 25℃에서 30분간 방치한 후 microplate reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조약물은 L-ascorbic acid와 BHA (butylated hydroxy anisole)를 사용하였다. 항산화효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다.
- ) column을 사용하였다. 발색시약으로는 10% H2SO4 (in EtOH) 시약을 사용하였으며, UV의 검색은 254, 365 nm에서 하였다.
- 시약 및 기기 − 실험에 사용한 기기로는 1H-NMR 및 13CNMR spectrum은 Jeol JMN-EX 400 spectrometer (Japan)를 이용하여 확보하였다.
- 실험재료 − 본 실험에 사용한 강황의 지상부는 2011년 11월에 전라북도 농업기술원에서 채취하였으며, 정확히 감정한 후에 음건세절하여 실험에 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 약학대학 생약학 연구실에 보관하고 있다(WSU-11- 035).
이론/모형
- Xanthin 유래 Superoxide 소거 활성11)− Xanthine/ xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide 라디칼을 Thuong 등의 방법에 따라 측정한다.
성능/효과
- 13C-NMR spectrum에서는 carbonyl 영역의 δ 167.92, 167.30, 167.02, 166.93 및 166.22에서 5개의 carbonyl carbon signal이 확인되었으며, 그 외의 aromatic 영역의 δ 146.54, 146.46, 146.43, 146.36 및 146.27에서 5개 의 peak, δ 140.75, 140.35, 140.29, 140.12 및 140.00에서 5개의 peak, δ 121.05, 120.37, 120.25, 120.21 및 119.74에 서 5개의 peak, δ 110.64, 110.48, 110.42, 110.40 및 110.36 에서 5개의 peak가 관찰되어 전형적인 galloyl기의 peak 양상을 보여 주었다.
- Riboflavin 유래 superoxide quenching 활성 또한 화합물 2(IC50; 6.3 µg/ml)가 화합물 1(IC50; 38.1 µg/ml) 보다 강한 superoxide 소거활성을 보여 주었으며, 화합물 2는 vitamine C(IC50; 5.1 µg/ml)와 유사한 소거효능을 보여 주었다(Fig. 4).
- Xanthine 유래 superoxide quenching 활성은 화합물 2(IC50; 5.8 µg/ml)가 화합물 1(IC50; 31.0 µg/ml) 보다 강한 superoxide 소거활성을 보여 주었으며, 화합물 2는 vitamine C(IC50; 5.8 µg/ml)와 유사한 소거효능을 보여 주었다(Fig. 5).
- 이 화합물 1, 2는 본 식물로부터 처음 분리·보고되는 화합물이며, 화합물 1, 2 모두 강한 DPPH radical 소거 효능 및 riboflavin 및 xanthine 유래 superoxide quenching 활성을 보여 주었다.
- 5). 이상의 결과로 화합물 1과 2는 강황 지상부의 ethanol 추출물이 갖고 있는 항산화활성을 나타내는 일부 구성 물질임을 알 수 있었으며, 강황의 뿌리줄기와 덩이뿌리 등의 약용부위를 채집한 후의 부산물로 남는 지상부는 항산화활성을 갖는 기능성 자원소재으로서의 이용가능성이 충분히 있을 것으로 사료된다.
- 화합물 1과 2는 본 식물에서 처음 보고되는 화합물이며, 분리된 화합물의 DPPH free radical 소거활성은 Fig. 3에 나타난 바와 같이 화합물 2(IC50; 2.3 µg/ml)가 화합물 1(IC50; 16.4 µg/ml)보다 강한 DPPH free radical 소거활성을 보여 주었으며, vitamine C(IC50; 7.42 µg/ml) 보다도 강력한 효능을 보여 주었다.
- 화합물 2는 FeCl3 시액에 양성으로 나타났으며, 1H-NMR spectrum에서 aromatic 영역에서 각각 2H에 해당하는 singlet proton peak가 δ 7.08에서 1개가 관찰되었고, 13C-NMR spectrum에서는 carbonyl 영역의 δ 107.4에서 1개의 carbonyl carbon signal이 확인되었다.
후속연구
- 7) 그러나 뿌리줄기와 덩이뿌리는 전통적으로 약용으로 사용하고 있으나 약용부위를 채취한 후의 150 cm 까지 자라는 지상부를 포함한 부산물은 더 이상 이용되지 못하고 밭에 버려지고 있다. 따라서 강황 재배 후의 다량으로 발생되는 부산물의 다각적인 이용이 연구되어야 할 것으로 생각된다. 그 일환으로 본 연구는 약용 부위 채취 후의 강황 부산물을 ethanol로 추출하고 그 ethanol 엑스를 몇 가지 용매로 분획하여 얻은 각 분획물에 대해 DPPH free radical 소거활성 및 superoxide quenching 효과를 측정한 결과 ethyl acetate 가용분획에서 가장 강한 활성이 확인되어 ethyl acetate 분획에서 항산화 물질을 분리하고자 실험을 진행하였다.
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