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제안 방법
- 0의 alkaline buffer로 분리, 정제하여 시알산과 특이적으로 결합하는 렉틴 MFA(Maackia fauriei agglutinin)^] 특성을 처음 보고하였다.或id 본 논문에서는 솔비나무 유래 렉틴 MFA 의 분리 정제 효율을 높이기 위하여 fetuin-affinity column에 흡착된 단백질을 분리할 때 pH 8.0의 borate buffer로 분리하여 그 비활성 도와 수율을 비교하였으며, 적혈구응집반응, 적혈구응집 저해의 방법으로 얻어진 렉틴과 비교하였다. 또한, MFA 렉틴의 당단백질에 대한 결합력을 확인하기 위하여 MFA를 화학적으로 biotin으로 표지한 후 시알산이 결합된 당단백질과의 반응성을 연구하였다.
- 0의 borate buffer로 분리하여 그 비활성 도와 수율을 비교하였으며, 적혈구응집반응, 적혈구응집 저해의 방법으로 얻어진 렉틴과 비교하였다. 또한, MFA 렉틴의 당단백질에 대한 결합력을 확인하기 위하여 MFA를 화학적으로 biotin으로 표지한 후 시알산이 결합된 당단백질과의 반응성을 연구하였다.
- 분리된 렉틴의 분자량 및 정제 순도를 확인하기 위해 Laemmli 의 방법⑵에 따라 12% polyacrylamide gel을 제작후 전기영동 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylaminde gel electrophoresis, SDS-FAGE)을 실시하였다. 분자량 표준물질 (20~250kDa)은 Bio- Rad4에서 구입하여 사용하였다.
- 렉틴용액을 o.i5M NaCl로 2°~아0배까지 희석 후 96-weU U bottom microplate(NUNC)에 50 也씩 넣고 2%로 현탁시킨 사람 ABO, 토끼, 랫트 흰쥐의 적혈구 각각 50 B와 반응시켰다. 1시간동안 실온에 방치한 후 0.
- i5M NaCl로 2°~아0배까지 희석 후 96-weU U bottom microplate(NUNC)에 50 也씩 넣고 2%로 현탁시킨 사람 ABO, 토끼, 랫트 흰쥐의 적혈구 각각 50 B와 반응시켰다. 1시간동안 실온에 방치한 후 0.15 M NaCl 50 以와 2% 적혈구 50 讪 만을 반응시킨 것을 대조군으로 하여, 4°C에서 25간 동안 방치한 후 최종적으로 응집반응을 확인하였다. 대조군과 비교하여적혈구 응집반응이 일어난 경우를 음성반응, 적혈구 응집반응이일어나지 않는 경우를 양성반응으로 판정하였다.
- 15 M NaCl 50 以와 2% 적혈구 50 讪 만을 반응시킨 것을 대조군으로 하여, 4°C에서 25간 동안 방치한 후 최종적으로 응집반응을 확인하였다. 대조군과 비교하여적혈구 응집반응이 일어난 경우를 음성반응, 적혈구 응집반응이일어나지 않는 경우를 양성반응으로 판정하였다.
- 렉틴의 당 결합특이성을 확인하기 위하여 적혈구응집 저해반응을 실시하였다. 렉틴의 적혈구응집 반응 결과 확인된 최대 희석배수보다 한 배수 적게 0.
- 15 M NaCl에 희석하여 사용하였다. 저해제로 사용한 단당, 이당류 및 당단백질을 각각 50 诃와 렉틴 50 |但를 96-well U bottom microplate에 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 각 well에 0.15 M NaCl로 현탁시킨 2% 토끼 적혈구 50 0를 넣고 1시간 동안 실온에 방치하고, 저해제를 넣지않은 대조군과 비교하였다. 이 때, 적혈구 응집반응이 일어난 경우를 저해활성이 있는 것으로 판단하였으며, 저해반응이 확인된경우에는 저해제를 희석하여 렉틴과 반응시키고 당과 반응하는최소저해농도(minimal inhibition concentration)를 구하였다.
- 15 M NaCl로 현탁시킨 2% 토끼 적혈구 50 0를 넣고 1시간 동안 실온에 방치하고, 저해제를 넣지않은 대조군과 비교하였다. 이 때, 적혈구 응집반응이 일어난 경우를 저해활성이 있는 것으로 판단하였으며, 저해반응이 확인된경우에는 저해제를 희석하여 렉틴과 반응시키고 당과 반응하는최소저해농도(minimal inhibition concentration)를 구하였다. 단당, 이당류 및 당단백질은 모두 Sigma에서 구입하였다.
- 5) 1 hU에용해한 용액을 가하였다. 미결합 biotin을 제거하기 위하여 최종반응액을 fetuin-agarose에 용출시킨 후 렉틴-biotin 콘쥬게이트를 분리하였다.
- 02〜2 mg/m/)을 50, 씩 가하여 37°C에서 1시간 반응시킨 후 aspiration에 의해 제거하고 각 well을 100 以 TBST로 3회 세척하였다. 최종적으로 Extravidin(Sigma) 100以 를 가하고 37°C에서 1시간 반응시킨 후 aspiration에 의해 제거하고 각 welli- 100 以 TBS로 3회 세척 후 ABTS(Sigma) 0.55 mg/m/ 용액 100 m/에 H2O2 1 p/를 넣고 각 well에 100 山씩 넣은 후 즉시 microplate reader를 사용하여 405 nm에서 각 well 의 흡광도 값을 측정하고 10분 후 재측정하여 각각의 상대값을구하여 시약을 넣는 순서에 의한 흡광도 오차를 줄였다.
- 최근 본 연구자들이 보고한 솔비나무 유래 렉틴 MFA의 정제효율을 보다 높이기 위하}여 fetuin-affinity column에 흡착된 렉틴에 대해 성분이 다른 용출액으로 분리를 시도하였다. 먼저 fetuin-agarose를 충진시킨 column을 제작하고 솔비나무 유래 단백질 원액을 결합시켜 미결합 물질의 흡광도값이 완전히 0이 된것을 확인하고, 컬럼에 흡착된 단백질은 두 종류(borate buffer, alkaline buffer)로 용출시켜 얻어진 크로마토그램을 각각 작성하였다(Fig.
- 먼저 fetuin-agarose를 충진시킨 column을 제작하고 솔비나무 유래 단백질 원액을 결합시켜 미결합 물질의 흡광도값이 완전히 0이 된것을 확인하고, 컬럼에 흡착된 단백질은 두 종류(borate buffer, alkaline buffer)로 용출시켜 얻어진 크로마토그램을 각각 작성하였다(Fig. 1). 컬럼에 시료를 반응시키고 20번까지 얻어진 분액들은 fetuin 컬럼에 결합하지 않은 단백질들이며, 21번부터는 용출 완충액을 각각 흘려 친화성 컬럼으로부터의 분리를 시도하고흡광도값을 갖는 21~29번 분액들을 각각 얻었다.
- 분리된 렉틴의 순도와 분자량을 확인하기 위하여 12% polyacrylamide gel상에서 전기영동을 실시하고 AgNQ;로 염색하였다(Fig. 2). 그 결과, 단백질 원액 (lane 2)으로부터 fetuin- affinity column에 흡착되지 않은 부분(lane 3)을 제거 후 borate buffeH 의해 용출되면서 농죽된 렉틴은 30 kDa 부근에서 단일밴드를 나타냈다(lane 4).
- 렉틴의 당단백질에 대한 결합력을 재확인하기 위하여 biotin으로 표지한 렉틴을 제작하고 이를 이용하여 MFA와 가장 강한 결합을 하는 fetuin과의 결합에 대한 저해양상을 fetuin, BSM, thyroglobulin에 의해 확인하였다(Fig. 3). 그 결과 fetuin은 예상대로 첨가 농도가 높아짐에 따라 흡광도가 감소하여 fetuin과 MFA와의 반응을 저해함을 확인하였으며, BSM과 thyroglobulin 도 거의 동등한 농도의 비율로 저해함을 확인하였다.
- 렉틴의 암세포에 대한 독성은 사람 유방암세포(MCF-7, Korean Cell Line Bank)에 대해 실시하였다. 37°C, 5% CO?에서 배양한암세포(IxlO'cells/in/)에 렉틴 농도를 달리하여 50 他를 96 well culture plate(Nunc)에 첨가 후 72시간 동안 배양하고 살아있는암세포의 비율은 CCK-8(Dojindo) assay법에 의해 제조회사의 메뉴얼에 따라 계산하였다.
대상 데이터
- 실시하였다. 분자량 표준물질 (20~250kDa)은 Bio- Rad4에서 구입하여 사용하였다.
- 이 때, 적혈구 응집반응이 일어난 경우를 저해활성이 있는 것으로 판단하였으며, 저해반응이 확인된경우에는 저해제를 희석하여 렉틴과 반응시키고 당과 반응하는최소저해농도(minimal inhibition concentration)를 구하였다. 단당, 이당류 및 당단백질은 모두 Sigma에서 구입하였다.
- 또한 사람 유방암세포에 대한 세포독성을 나타내 렉틴으로서의 활성이 유지되고 있음을 확인하였다. 한편, 당단백질에 대한 결합력을 확인할수 있는 콘쥬게이트 MFA 재료를 확보하게 되었다.
이론/모형
- 단백질 정량은 1, 0.1, 0.01, 0.001 m以m/의 bovine serum albumin(Bio-Rad)을 표준물질로 하여 Bradford 법始쎄 따라 실시하였다.
- Line Bank)에 대해 실시하였다. 37°C, 5% CO?에서 배양한암세포(IxlO'cells/in/)에 렉틴 농도를 달리하여 50 他를 96 well culture plate(Nunc)에 첨가 후 72시간 동안 배양하고 살아있는암세포의 비율은 CCK-8(Dojindo) assay법에 의해 제조회사의 메뉴얼에 따라 계산하였다.
- 정제된 렉틴에 대해 Bradford 법을 이용하여 각 단계별로 단백질 정량과 회수율을 비교 확인하였다. Borate buffer를 사용하여 용출한 경우 총 단백질로부터 얻어진 렉틴은 2.
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