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문제 정의
- 국내에서는 일부 학자들에 의하여 동백유의 일반 성분 분석과 유박의아미노산 함량이 연구되었고, 동백종실의 함유 지방산은 stearic, palmitic, linoleic 및 oleic acid 등으로 구성되어 있는 것으로 일부 보고되고 있을 뿐이다[11]. 본 연구는 혈관내피세포의 배양계를 이용하여 신생 혈관생성과 혈관내피세포 증식 및 세포 부착 등에 대한 동백꽃 추출물의 효능에대하여 살펴보았다.
제안 방법
- 배지 제거후 1% paraformaldehyde< 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켜 세포를 고정시켰다. 30분 후 PBS+0.5% Tween 20으로두 번 세 척하고, 10% FBS로 1시간 동안 blocking 한 다음, 단일 클론 항체 intercclhilar adhesion molecule-l(ICAM-l)z vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM4) 및 E-Selectin (BD Bioscience, Bedford, MA, USA)를 10% FBS가 참가된 PBS에 각각 2, 5, 5 μg/mL 씩 녹여 2시간 동안 37℃에서 배양 후 PBS+0.5% Tween 20 으로 세척하고' secondary anti- body(Donkey anti-mouse IgG-HRP: Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 10% FBS의 PBS에 1000배 희석하여 실온에서 1시간동안 반응시켜, 발색시 약(western blotting luminol reagent: Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 후 plate reader(UVM 340, ASYS, Austria)를 사용하여 405 nm에서 측정하였다.
- 5x104개의 세포를 넣어 세포를 부착시킨 후 동백꽃 추출물을 농도별로 투여하여 실시하였다. 3시간 후 tube 가 형성되면 불규칙적으로 5면을 선택하여 digital cam- era(Nikonz coolpix 4500)를 이용하여 촬영하였다. NIH pro- gram을 이용하여 형성된 tube의 길이를 측정하여 anti-angiogenesis 효과를 판단하였다.
- HUVECs을 100mm petri dish에 lxl0%ell으로 접종하여 배양한 후 최고조에 도달하면 동백꽃 에틸알콜 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하여 serum-free EBM-2배지로세척하고 대조군 및 처리군을 serum을 첨가하지 않은 채overnight 시킨 후 VEGF(BD Science, Bedford, MAZ USA)를 50 ng/mL가 되게 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. phosphorylation을 방지하기 위하여 세포를 용해시키기 전 7 분간 vanadate(lOOuM)과 hydrogenperoxide(200uM)첨가하였다.
- HUVECs을 96well에 well당 5x103개의 cen 이 되도록 분주하여 2% Fetal bovine serum(FBS)를 첨가한 EBM-2배지에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배 양하여 최고조에 도달하도록배양하였다. 동백꽃 에틸알콜 추출물의 농도를 200, 100, 50 및 25 μg/well이 되게 첨가하고 20시간 배양한 후, phosphate buffered saline(PBS)로 세 척 후 세포부착 인자를 유도하기 위하여 IL-ip(Endogen, Woburn, MAZ USA)를 5 ng/mL의 농도로 첨가하여 6시간 동안 반응시켰다.
- 3시간 후 tube 가 형성되면 불규칙적으로 5면을 선택하여 digital cam- era(Nikonz coolpix 4500)를 이용하여 촬영하였다. NIH pro- gram을 이용하여 형성된 tube의 길이를 측정하여 anti-angiogenesis 효과를 판단하였다.
- Ponceau-S(Markham/ Ontario, Canada) 시약으로 단백질을 확인하였고 5%-non-fat dry milk(NFDM)로 실온에서 1 시간 동안 blocking을 실시한 후 VEGFR2, PI3KZ p-catenin, VE-cadherin(BD Bioscience, Bedford, MAZ USA)등의 pr1mary antibodies* 각각 처리한 후, secondary antibody인 donkey goat HRP를 1:7000의 비율로 반응시 킨 후 형광물질인 ECL(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruze, CA, USA) 을 이용해 film에 감광시키고 현상하였다. Strippinge stripping buffer를 이용하여 50℃에서 5분간 행한 후 blocking을 실시하였다.
- 5% NP-40)를 첨 가하고 20분간 4℃에서 반응시켰다. Scripper■로써 세포를 회수하여 micro eppendorf tube로 옮겨서 4℃Z 14, 000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 단백질은 BCA protein assay kit(Piercez Rockford, IL, USA)을 사용하여 농도를 구한 후 VE-Cadherin antibody(BD Bioscience, Bedford, MAZ USA)를 사용해 1m- munoprecipitation(IP) 을 실시하였다.
- 반응시켰다. phosphorylation을 방지하기 위하여 세포를 용해시키기 전 7 분간 vanadate(lOOuM)과 hydrogenperoxide(200uM)첨가하였다. 그 후 세포를 즉시 냉각시킨 PBS+0.
- 동백꽃 에틸알콜 추출물의 농도를 200, 100, 50 및 25 μg/well이 되게 첨가하고 20시간 배양한 후, phosphate buffered saline(PBS)로 세 척 후 세포부착 인자를 유도하기 위하여 IL-ip(Endogen, Woburn, MAZ USA)를 5 ng/mL의 농도로 첨가하여 6시간 동안 반응시켰다. 배지 제거후 1% paraformaldehyde< 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켜 세포를 고정시켰다.
- 사용하였다. 배지는 EBM-2 배지 (Cambrex, Hopkinton, MA, USA)를 기본으로하여 hydrocortisone, epidermal growth factor(EGF), basic fibroblast growth fac- tor(bFGF), insulin like growth factor-1 (IGF-1), vascular endothelial growth factor(VEGF), ascorbic acid, heparin과 2% fetal bovine serum(FBS)을 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 5%의 CO2 배양기에서 배양하였다.
- 처리하였다. 이를 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간배 양하여, trypsin-EDTA로 처 리후 hemocytometer를 사용하여 살아있는 세포의 수를 헤아려 대조군과 비교하여 독성의여부를 판단하였다.
대상 데이터
- Human umbilical vein endotherial cells(HUVEC)은 Young Science(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였고, 배양은 T75 플라스크를 사용하였다. 배지는 EBM-2 배지 (Cambrex, Hopkinton, MA, USA)를 기본으로하여 hydrocortisone, epidermal growth factor(EGF), basic fibroblast growth fac- tor(bFGF), insulin like growth factor-1 (IGF-1), vascular endothelial growth factor(VEGF), ascorbic acid, heparin과 2% fetal bovine serum(FBS)을 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 5%의 CO2 배양기에서 배양하였다.
- 동백꽃 시료는 Fig. 1과 같이 hexane, chloroform, ehtyl acetate, butanol 의 유기용매 순서로 극성 이 낮은 것부터 높은 순서로 추출하여 분획하였으며, 동결건조 시켜 시료로 사용하였다.
성능/효과
- Cell adhesion 분자인 E-selectin, VCAM-1 및 ICAM-1 들은 Camellia japonica flower(CJF)의 성 분 증가에 따라 발현이감소되는 것으로 보아 cell adhesion의 저해 효과가 높아짐을알 수 있었다(Fig. 4). Fig.
- 4(a)에서 보는 바와 같이 cell adhesion 분자인 ICAM-1 이 동백꽃 추출물의 농도가 증가함에 따라 발현이 감소하여 cell adhesion의 저해 효과가 높아짐을알 수 있었다. 농도가 50 μg일 때 5.9%, 100 u 일 때 29.4%, 200 %일 때 52.9% 저해되었으며, VCAM-1 도 동백꽃 추출물성분증가에 따라 감소하여 저해 효과가 높아졌으며, 특히 농도가 50 μg일 때 12.5%, 100 μg 일 때 43.8%, 200 μg일 때 62.5% 저해되었다(Fig. 4(b)).
- 동백꽃의 에탄올 추출물의 분액으로 신생혈관생성억제 효과를 실험한 결과 butanol 추출물이 강한 제어력(70.2%)를 나타내었고, acetone 층이 54.2%, 그리고 ethylacetate 층이 37.0%, chloroform 층이 21.2%의 유의성 있는 제어력을 나타냄이 밝혀져 동백꽃의 butanol층은 신생 혈관 생성억제제로서 좋은 효과를 보이고 있는 것으로 판단된다. Hexane 추출 과정 중 hexane 층이 응인상태로 되어 분획하는 작업이 어려워서 acetone을 첨가하여 g이을 녹인 후 acetone 층을 sample로 사용하였다(Fig.
- 4(b)). 또한, E-selectin 역시 감소하여 cell adhesion의 저 해 효과가 높아짐을 알 수 있었고, 농도가 50 μg일 때 7.1%, 100 μg 일 때 24.4%, 200 μg일 때 35.7% 저해 되 었다(Fig. 4(c)).
후속연구
- 2(c)). 따라서 동백꽃 추출물의 에탄올 추출물은 신생혈관의 형성을 억제하는 것으로나타나, 생체에 투여할 수 있는 간단한 추출물로서 항암, 암전이 억제, 류마치스성 관절염 [5, 6] 및 항비만 제제 [1, 18, 20] 등의용도로 그 응용가능성이 높을 것으로 판단된다.
- 4(c)). 따라서 동백꽃에는 cell adhesion을 저해시키는 물질이 함유되어 있는 것으로 조사되어 항암 작용, 암전이 억제등에 CJF가 유용하게 사용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 그래프에서 보는 바와 같이 동백꽃의 추출물은 200 ug/well에서도 control 과 비교하여 독성이 전혀 없는 것으로 나타났다. 이것으로써 동백꽃의 다양한 성분이 독성이 낮은 것으로 판단되며, 다양한 제제로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
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