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문제 정의
- 2. Transmission electron microscopic image of prepared silver nano-particles in this study.
- 본 연구에서는 의치상의 주성분인 PMMA 레진에 질산은과 나노 은 입자의 형태로 투여된 은-의치상 레진 복합체의 항균 치과생체재료로서의 개발 및 적용가능성을 평가하기 위하여 칸디다 균주를 대상으로 향균특성시험, 3점 굽힘 강도 그리고 색조안정성에 대한 시험을 수행한 결과 아래의 3 가지 결론을 도출하였다. 첫 번째, 칸디다 균주에 대한 항균특성은 은의 첨가 농도가 0.
- 본 연구의 목적은 PMMA 의치상 레진에 은을 질산은과 나노 은의 형태로 첨가한 후 의치구내염의 주 원인균인 칸디다에 대한 항균 효과를 관찰하고 은 첨가에 따른 물성을 평가함으로써 항균 의치상 레진재료 개발 및 임상적용의 가능성을 모색하는데 있다.
제안 방법
- 16 따라서 구강 내 의치 장착 시 세균 부착 상황을 재현하기 위하여 본 항균 실험에서는 100 μl의 미량의 세균혼탁액을 은-의치상 레진 시편 위에 직접 접종하였으며 24시간 배양 후 생균수 증감으로 은/의치상 레진의 항균력을 평가하였다. 시편을 수 십 ml 용량의 세균혼탁액(free-floating planktonic phase)내에 침적시켜 평가할 경우 부유되는 칸디다균은 전형적인 세균막(biofilm)으로 보호되는 표면부착상태의 칸디다균보다 더 낮은 항균제 농도에 민감하기 때문에 은/의치상 레진 시편의 항균 성능평가에 있어서 과장된 항균성 도출로 인하여 실제적인 평가가 어려울 수 있다.
- Candida albicans에 대한 은 이온의 MIC의 측정은 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 그리고 4.0 μg/ml 농도의 은 이온을 100 ml 균 현탁액(1X107 CFU/ml)에 각각 첨가하고 37℃에서 24 시간 동안 배양 한 후 1 ml 시료분취액(aliquots)을 분광 광도계(600 nm, optical density 1.0)를 이용하여 시행하였다.
- 먼저 3점 굽힘 강도의 경우 실험 시편을 테플론(Teflon)과 금속 몰드를 이용하여 25 mm × 2 mm × 2 mm(ISO 4049: 2000)의 크기로 하여 제조사의 지시대로 중합한 시편을 각 군당 5 개씩 제작하였고 만능시험기를 이용하여 지점간 거리 20 mm 중앙에 하중속도 1 mm/min의 하중을 가하면서 시편이 파괴될 때의 하중(F)을 측정하여 MPa로 산정하였다. 또한 은 첨가로 인한 의치상 레진의 색조안정성을 평가하기 위해 은이 첨가되지 않은 대조군을 기준으로 은이 첨가 된 시편들과의 색차(△E*)를 측정하였다(n=5).
- 물성 실험으로는 3점 굽힘 강도(3-point flexural strength) 및 은이 첨가 되지 않은 대조군시편과의 색차를 측정하였다. 먼저 3점 굽힘 강도의 경우 실험 시편을 테플론(Teflon)과 금속 몰드를 이용하여 25 mm × 2 mm × 2 mm(ISO 4049: 2000)의 크기로 하여 제조사의 지시대로 중합한 시편을 각 군당 5 개씩 제작하였고 만능시험기를 이용하여 지점간 거리 20 mm 중앙에 하중속도 1 mm/min의 하중을 가하면서 시편이 파괴될 때의 하중(F)을 측정하여 MPa로 산정하였다. 또한 은 첨가로 인한 의치상 레진의 색조안정성을 평가하기 위해 은이 첨가되지 않은 대조군을 기준으로 은이 첨가 된 시편들과의 색차(△E*)를 측정하였다(n=5).
- 은-의치상 레진 복합체로부터 용출되는 은 이온의 양은 각 실험 시편(군 당 5개)을 100 ml 멸균 증류수에 넣고 shaking Incubator에서 37℃, 130 rpm의 조건으로 24시간 용출된 액을 회수한 다음, 원자흡광광도계를 이용하여 정량하여 비교 분석하였다. 물성 실험으로는 3점 굽힘 강도(3-point flexural strength) 및 은이 첨가 되지 않은 대조군시편과의 색차를 측정하였다. 먼저 3점 굽힘 강도의 경우 실험 시편을 테플론(Teflon)과 금속 몰드를 이용하여 25 mm × 2 mm × 2 mm(ISO 4049: 2000)의 크기로 하여 제조사의 지시대로 중합한 시편을 각 군당 5 개씩 제작하였고 만능시험기를 이용하여 지점간 거리 20 mm 중앙에 하중속도 1 mm/min의 하중을 가하면서 시편이 파괴될 때의 하중(F)을 측정하여 MPa로 산정하였다.
- 제조된 각 군의 시편은 잔여 단량체(residual monomer) 제거를 위해 상온에서 증류수에3 주간 보관 후 항균실험 직전 75% alcoh이에 1시간 침적시킨 다음 무균증류수를 이용하여 1 시간동안 초음파 세척을 시행하였고 최종적으로 에틸렌옥사이드(ethylene oxide gas) 소독을 시행하였다. 소독된 시편은 지름 24 mm 배양접시 (well dish)에 멸균된 각 시편을 넣고 시편위에 희석된 균 액을 100 μl 씩 접종 후 가습 환경 하에서 37℃, 24 시간 배양 조건으로 3 번의 반복실험을 시행한 후 균 집락을 계량화하여 항균 효과를 관찰하였다. 은-의치상 레진 복합체의 항균성에 대한 유의차를 검정하기 위해 일원 ANOVA로 통계처리하고 사 후 비교를 위해 Student t-test를 수행하였으며 모든 통계는 99%의 유의수준으로 검정되었다.
- 2에나타낸 투과전자 현미경 사진에 나타낸 바와 같이 약 50~80 nm 범위의 크기로 관측되었다. 은 이온 용액은 질산은(AgNO3)을 초순수에 용해시켜 Ag0와 동일한 은 농도를 기준으로 조절하여 실험하였다. 실험의치상 레진은 임상에서 통상적으로 사용되는 열중합용 의치상 레진(Lucitone 199R, Dentsply, USA)을 선택하였고 실험군 설정은 은 투여 형태에 따라 의치상 레진의 PMMA성분인 파우더 형태의 폴리머와 미리 혼합하여 동결건조 시킨 후 액체상태의 MMA 모노머와 중합하는 형태와 은-모노머 혼합용액을 먼저 제조한 후 폴리머와 중합하는 형태, 그리고 은이 첨가되지 않은 대조군 등 총 5개 군을 설정하였고 이때 초기 은의 혼합을 0.
- 은-의치상 레진 복합체로부터 용출되는 은 이온의 양은 각 실험 시편(군 당 5개)을 100 ml 멸균 증류수에 넣고 shaking Incubator에서 37℃, 130 rpm의 조건으로 24시간 용출된 액을 회수한 다음, 원자흡광광도계를 이용하여 정량하여 비교 분석하였다. 물성 실험으로는 3점 굽힘 강도(3-point flexural strength) 및 은이 첨가 되지 않은 대조군시편과의 색차를 측정하였다.
- 73 X 107 CFU/ml)를 측정하였다. 제조된 각 군의 시편은 잔여 단량체(residual monomer) 제거를 위해 상온에서 증류수에3 주간 보관 후 항균실험 직전 75% alcoh이에 1시간 침적시킨 다음 무균증류수를 이용하여 1 시간동안 초음파 세척을 시행하였고 최종적으로 에틸렌옥사이드(ethylene oxide gas) 소독을 시행하였다. 소독된 시편은 지름 24 mm 배양접시 (well dish)에 멸균된 각 시편을 넣고 시편위에 희석된 균 액을 100 μl 씩 접종 후 가습 환경 하에서 37℃, 24 시간 배양 조건으로 3 번의 반복실험을 시행한 후 균 집락을 계량화하여 항균 효과를 관찰하였다.
- 항균 대상 균주인 Candida albicans를 Sabouraud agar plates상에서 24시간, 30℃의 조건으로 배양하고 균일하고 최상의 배양을 위해 강도 7의 shaking을 시행하였으며 분광기(Milton Roy spectronic 20D+ spectrophotometer, USA)를 이용하여 배양균 액을 600 nm에서 흡광도(optical density) 1.0이 되도록 완중용액(Phosphate Buffer Solution: PBS, pH 7.4)에 단계희석하였으며 초기 생균수 측정을 위하여 단계 희석된 균 액을 도말배양법 (spread method)을 시행하여 37C, 24시 간 배양 후 초기 평균 생균수(1.73 X 107 CFU/ml)를 측정하였다. 제조된 각 군의 시편은 잔여 단량체(residual monomer) 제거를 위해 상온에서 증류수에3 주간 보관 후 항균실험 직전 75% alcoh이에 1시간 침적시킨 다음 무균증류수를 이용하여 1 시간동안 초음파 세척을 시행하였고 최종적으로 에틸렌옥사이드(ethylene oxide gas) 소독을 시행하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 silver nitrate, PVP(PolyN-vinyl2-pyrrolidone)는 Aldrich사 제품을, 열중합용 레진 Lucitone 199R는 Dentsply(USA)사 제품을 구입하여 더 이상의 정제 과정 없이 사용하였으며 항균 대상 균주로서 Candida albicans (American type culture collection: ATCC 66026)을 선택하였다.
- 은 이온 용액은 질산은(AgNO3)을 초순수에 용해시켜 Ag0와 동일한 은 농도를 기준으로 조절하여 실험하였다. 실험의치상 레진은 임상에서 통상적으로 사용되는 열중합용 의치상 레진(Lucitone 199R, Dentsply, USA)을 선택하였고 실험군 설정은 은 투여 형태에 따라 의치상 레진의 PMMA성분인 파우더 형태의 폴리머와 미리 혼합하여 동결건조 시킨 후 액체상태의 MMA 모노머와 중합하는 형태와 은-모노머 혼합용액을 먼저 제조한 후 폴리머와 중합하는 형태, 그리고 은이 첨가되지 않은 대조군 등 총 5개 군을 설정하였고 이때 초기 은의 혼합을 0.002 M, 0.01 M 그리고 0.05 M의 3가지 농도로 하여 지름 20 mm(두께 3 mm) 디스크형태로 제조사의 지시대로 군 당 각각 5 개씩의 시편을 제작하였다(Table 1).
데이터처리
- 소독된 시편은 지름 24 mm 배양접시 (well dish)에 멸균된 각 시편을 넣고 시편위에 희석된 균 액을 100 μl 씩 접종 후 가습 환경 하에서 37℃, 24 시간 배양 조건으로 3 번의 반복실험을 시행한 후 균 집락을 계량화하여 항균 효과를 관찰하였다. 은-의치상 레진 복합체의 항균성에 대한 유의차를 검정하기 위해 일원 ANOVA로 통계처리하고 사 후 비교를 위해 Student t-test를 수행하였으며 모든 통계는 99%의 유의수준으로 검정되었다.
이론/모형
- , USA)를 색조 안정성 평가에는 분광측정기 (Spectrophotometer ColorreaderR Minolta CR-10, Japan)모델을 사용하였다. 또한 은 나노 용액과 입자의 특성 분석에는 자외선/가 시선 흡수 분광기 (UV/VIS Spectroscopy: SCINO, S2100)모델과 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope: Hitachi, H-7100, Japan)모델을 각각 측정에 사용하였다.
- 은 이온의 MIC(Minimum inhibitory concentration; 최소발육저지농도)의 측정과 희석 배양균주 조절을 위해서 분광 광도계(Milton Roy spectronic 20D spectrophotometer, USA)를, 은 이온 용줄량 측정에는 진탕배양기 (Shaking incubator; JEIO TECH, SI-600R, Korea) 모델과 원자흡광광도계(AAS, Atomic Absorption Spectrophotometer; Perkin -Elmer, Analyst 100, USA)를 이용하였고 실험시편들의 3점 굽힘 강도 측정에는 만능시험기(Model 4200, Instron Inc., USA)를 색조 안정성 평가에는 분광측정기 (Spectrophotometer ColorreaderR Minolta CR-10, Japan)모델을 사용하였다. 또한 은 나노 용액과 입자의 특성 분석에는 자외선/가 시선 흡수 분광기 (UV/VIS Spectroscopy: SCINO, S2100)모델과 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscope: Hitachi, H-7100, Japan)모델을 각각 측정에 사용하였다.
성능/효과
- 002 M은 첨가 농도에서 초기 투여 균 수 및 은이 첨가되지 않은 대조군에 비하여 유의성 있는 항균효과가 관찰되지 않았으나(Fig. 3(a)) (Table 2) 0.01 M 및 0.05 M 은-의치상 레진 시편들에서 균 완전사멸효과보다는 초기 투여 균 수 및 대조군에 대하여 유의성 있는 진균억제 효과가 나타났으며 (Fig. 3(b), (c)) 0.
- 05 M 은-의치상 레진 시편들에서 균 완전사멸효과보다는 초기 투여 균 수 및 대조군에 대하여 유의성 있는 진균억제 효과가 나타났으며 (Fig. 3(b), (c)) 0.05 M 농도에서 0.01 M에 대해 은 투여 종도 증가에 따른 유의성 있는 항균력 증진이 나타났으나 (p<0.01) 투여된 Ag+(질산은)와 나노 은 입자사이의 항균력 차이 및 혼합 형태에 따른 항균능력의 차별성은 유의하게 나타나지 않았다(p>0.01) (Table 2).
- 일반적으로 의치상 레진의 기계적 성질을 분석하기 위한 실험으로 인장강도, 압축강도, 3점 굽힘 강도 실험 등이 있으나 본 연구에서 실행된 3점 굽힘 강도 실험은 구강 내에 장착된 의치의 부하형태를 거의 표현할 수 있고 인장 및 압축강도, 비례한계 그리고 탄성계수를 혼합한 형태이므로 인장, 압축강도실험보다 널리 사용되고 있다.20,21 대조군과 비교할 때 0.002 M 그리고 0.01 M 은 함유 농도 시편에서는 투여 은 형태나 혼합 방식에 따른 굽힘 강도의 저하가 나타나지 않았으나 0.05 M 은 투여농도에서는 대조군, 0.002 M 그리고 0.01 M 농도에 대한 굽힘 강도의 유의성 있는 증가가 관찰되었으나(p<0.01) 혼합 방식에 대한 통계적 유의성은 없었다(p>0.01)(Tble 4). 일정 농도이상의 무기 은 첨가는 PMMA 의치상 레진의 기계적 물성을 강화시킬 수 있는 것으로 관측되며 결과적으로 은 첨가에 따른 의치상 레진의 물성은 안정적인 양상을 보였다.
- 05 M 농도에서 유의성 있는 균 억제 능력을 보였고 이때 은 이온의 용출량은 최소발육저지농도보다 낮은 수치를 나타내었으며 질산은과 나노 은 및 혼합방법에 따른 유의성 있는 항균력은 나타나지 않았다. 두 번째, 기계적 물성을 평가하기 위한 3점 굽힘 강도 실험에서 모든 은-의치상 레진은 양호한 물성을 보였으며 세 번째 색조 안정성에서 은의 첨가에 따른 의치상 레진의색차 변화는 임상적용한계를 초과하는 것으로 나타났다.
- 본 실험에서의 Candida albicans (ATCC 66026)에 대한 은 이온의 최소발육저지농도는 3.0 卩g/ml으로 계측되었고 실험 은-의치상 레진시편들의 평균 Ag+ 용출량은 은 첨가 농도에 비례하여 증가되는 경향을 보였으며 최저 0.034~최고 1.325 μg/m로 계측되 었다(Table 3). 따라서 Ag+ 용출이 균 성장억제에 직접적인 영향을 주지 못한 것으로 나타났으며 이는 4급 암모니움을 첨가한 의치상 레진의 자유 모노머나 항균 물질의 배양배지로의 방출이 직접적인 항균효과와 관련 없 었다는 연구결과와 상응하였고18 MDBP(Methacryloyloxydodecylpyridinium bromide)-콤포지트(composite) 레진 복합체의 항균성이 필러 입자표면에 고정된 항균물질분자와 세균과의 직접 접촉기전으로 설명된 연구에서처럼 0.
- 본 연구의 은-의치상 레진은 미량의 Ag- 용출 하에서 내재적인 항균성을 가지며 적절한 물성을 지닌 항균복합체의 성격을 가지며 의치구내염의 예방 및 치료에 효과적인 것으로 사료된다. 의치 보철물에 있어서 살균성이 아닌 정균성은 내성이나 정상균주보호, 부작용 감소의 측면에서 오히려 바람직할 수 있으나 명확한 임상적 적용을 위한 색조안정성 개선 연구는 계속 필요할 것으로 사료된다.
- 값이 2 일 때를 색차구별 및 임상적용의 기준 값으로 규정하고 있다24. 색조안정성 평가에서 은-의치상 레진 시편들은 대조군에 비해 임상적 기준(△E*; 2.0) 수치보다 현저히 높은 8.38~17.3의 색차범위가 나타났으며 첨가 농도가 증가 할수록 색조차이가 유의하게 증가하였고 은 이온과 나노 은 간의 유의한 색조 차이는 나타나지 않았으나 0.01 M 은 투여 농도이상에서 I, II 군의 은/폴리머 (Ag+PMMA) 혼합분말형태가 III, IV 군의 은/모노머(Ag+MMA) 혼합형태보다 색조안정성을 유의하게 더 저하시키는 것으로 나타났다(Tbe 5). 의치상 레진은 치은색을 재현해야하는 심미성도 요구되므로 은 투여에 따른 의치상 레진의 변색은 임상 적용을 위한 필수개선사항으로 나타났다.
- 01)(Tble 4). 일정 농도이상의 무기 은 첨가는 PMMA 의치상 레진의 기계적 물성을 강화시킬 수 있는 것으로 관측되며 결과적으로 은 첨가에 따른 의치상 레진의 물성은 안정적인 양상을 보였다.
- 본 연구에서는 의치상의 주성분인 PMMA 레진에 질산은과 나노 은 입자의 형태로 투여된 은-의치상 레진 복합체의 항균 치과생체재료로서의 개발 및 적용가능성을 평가하기 위하여 칸디다 균주를 대상으로 향균특성시험, 3점 굽힘 강도 그리고 색조안정성에 대한 시험을 수행한 결과 아래의 3 가지 결론을 도출하였다. 첫 번째, 칸디다 균주에 대한 항균특성은 은의 첨가 농도가 0.01 M, 0.05 M 농도에서 유의성 있는 균 억제 능력을 보였고 이때 은 이온의 용출량은 최소발육저지농도보다 낮은 수치를 나타내었으며 질산은과 나노 은 및 혼합방법에 따른 유의성 있는 항균력은 나타나지 않았다. 두 번째, 기계적 물성을 평가하기 위한 3점 굽힘 강도 실험에서 모든 은-의치상 레진은 양호한 물성을 보였으며 세 번째 색조 안정성에서 은의 첨가에 따른 의치상 레진의색차 변화는 임상적용한계를 초과하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 325 μg/m로 계측되 었다(Table 3). 따라서 Ag+ 용출이 균 성장억제에 직접적인 영향을 주지 못한 것으로 나타났으며 이는 4급 암모니움을 첨가한 의치상 레진의 자유 모노머나 항균 물질의 배양배지로의 방출이 직접적인 항균효과와 관련 없 었다는 연구결과와 상응하였고18 MDBP(Methacryloyloxydodecylpyridinium bromide)-콤포지트(composite) 레진 복합체의 항균성이 필러 입자표면에 고정된 항균물질분자와 세균과의 직접 접촉기전으로 설명된 연구에서처럼 0.01 M 및 0.05 M 은-의치상 레진 시편의 칸디다균 억제효과는 균과 PMMA 레진 표면에 고정 분포된 은 이온이나 나노 은 입자와의 직접접촉 시 은의 catalytic action에 의한 활성산소의 항균작용19으로 추측되지만 보다 명확한 항균기전에 대한 차후 연구는 필요하리라 사료된다.
- 용출 하에서 내재적인 항균성을 가지며 적절한 물성을 지닌 항균복합체의 성격을 가지며 의치구내염의 예방 및 치료에 효과적인 것으로 사료된다. 의치 보철물에 있어서 살균성이 아닌 정균성은 내성이나 정상균주보호, 부작용 감소의 측면에서 오히려 바람직할 수 있으나 명확한 임상적 적용을 위한 색조안정성 개선 연구는 계속 필요할 것으로 사료된다.
- 12 그동안 치과용 수복재료나 접착제13 그리고 중심정맥관 (central venous catheter)과 같은 의료용 기구 등에 은이 항균성분으로 적용되어 왔으나14,15 특히 조직면과 직접적으로 접촉되는 치과생체재료인 의치상 레진의 항균성에 대한 연구는 미비한 실정이다. 항생제 남용으로 인한 내성 방지와 약물 치료비용 증가를 극복하기 위한 새로운 항생물질개발의 추세에 맞춰 천연 무기 항균물질인 은을 함유한 항균 의치상의 개발은 의치구내염 예방 및 염증 차단에 큰 의미가 있을 것으로 사료된다.
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