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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 누에번데기를 식품으로 활용하기 위한 방안을 모색하기 위하여 2종의 정제효소와 2종의 상업용 단백질 가수분해효소를 이용하여 누에번데기 단백질을 가수분해시킨 후 생성된 가수분해물의 in vitro상에서 항고혈압, 항산화활성 등의 생리활성변화를 확인하고 이를 바탕으로 번데기 단백질의 효소적 가수분해 조건을 선정하여 기능성식품 단백질원으로서 번데기 단백질의 이용 가능성을 구명하고자 하였다.
제안 방법
- Louis, MO, USA) 100 μL를 취하여 반응시키고, 가수분해물의 상층액 100 μL를 가하여, 37℃에서 30분 동안 반응을 시켰다. 1 N HCl 0.25 mL를 가하여 반응을 정지시키고, ethyl acetate 1.25 mL를 가하여 vortex로 강하게 15초간 교반한 후 상층액 1 mL 취하여 120℃의 thermo bath(ALB-128, Finepcr, Korea)에서 30분간 건조시킨 다음 증류수 1 mL를 가하여 용해시킨 후 228 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 모든 실험은 3회 반복 실험하였다.
- 가수분해물의 전자공여능(electron donating ability, EDA)은 Roberta 등(19)의 방법을 변형하여 측정하였다. 가수분해물 0.
- 8 mL를 가하고 잘 혼합한 후 실온에서 30분간 방치한 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 가수분해물의 전자공여능은 시료첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 백분율로 구하였으며, 가수분해물의 EDA(%)를 50% 감소시키는 IC50(inhibition concentration)을 구하였고, 모든 실험은 3회 반복 측정하였다.
- 탈지 번데기분말 분산농도는 각 완충용액 70 mL에 2, 5, 10, 15 및 20%의 농도에 해당하는 탈지번데기분말을 첨가하여 가수분해시킨 다음 단백질용해지수를 측정하였다. 단백질용해지수는 BCA(bicinchoninic acid) Protein Assay kit(Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. 즉, 가수분해물 25 μL에 BCA kit 시약 200 μL를 첨가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰다.
- 번데기 단백질의 최적 가수분해 조건을 선정하기 위해 4종의 가수분해 효소를 이용하여 번데기분말 첨가량별 및 가수분해시간에 따른 단백질 용해지수, 각각의 가수분해물의 ACE 저해활성 및 항산화활성 등을 조사하였다. 탈지번데기분말의 최적 분산농도는 5～10% 범위였으며 가수분해시간은 18시간이었고, ACE 저해활성은 neutrase, trypsin, pepsin 및 alcalase 효소처리 시 각각, 85.
- 9946)을 이용하여 가수분해물의 단백질 함량을 구하였으며, 표준물질로 BSA(bovine serum albumin, Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하였다. 상기 방법에 의해 결정된 탈지 번데기 분말 분산농도에 대한 가수분해시간을 결정하기 위하여 6, 12, 18, 24 및 30시간 동안 가수분해한 다음 단백질 용해지수를 측정하여 최적 가수분해시간을 결정하였고, 이 조건으로 가수분해물을 제조하여 실험에 사용하였다.
- 정해진 시간동안 반응시킨 후 반응을 정지시키고, 3,000×g에서 20분간 원심분리하여 얻은 상층액을 단백질용해지수(protein solubility index)와 특성 분석에 사용하였다.
- 탈지된 번데기 박을 감압건조기(Townson & Mercer, UK)를 이용하여 40℃에서 48시간 진공 건조하여 번데기 박에 남아있는 hexane을 완전히 제거하였다. 진공 건조된 탈지 번데기분말을 분쇄한 다음 60 mesh 체를 통과시켜 탈지 번데기 분말을 제조하였다. 위와 같은 방법으로 제조한 탈지 번데기 분말을 -20℃의 냉동고에 보관하면서 실험에 이용하였으며, 탈지 번데기 분말의 제조 수율은 약 34%이었다.
- 본 실험에 사용된 번데기는 시중에 유통되는 청주의 재래시장에서 냉동 번데기(Bombyx mori, China, 2006)를 구입하여 -20℃의 냉동고에 보관하면서 사용하였다. 탈지 번데기 분말 제조는 Jeon과 Park(16)의 방법을 참고하여 번데기를 -50℃에서 72시간 동결건조기(Modulyod-115, Thermo Electron Co., Waltham, MA, USA)로 건조한 후 5배량의 n-hexane을 넣어 분쇄기(HM-180, Hi-bell, Korea)로 5분간 습식 분쇄한 후 6시간 동안 실온에서 교반하면서 탈지시켰으며, 이 과정을 5회 반복하였다. 탈지된 번데기 박을 감압건조기(Townson & Mercer, UK)를 이용하여 40℃에서 48시간 진공 건조하여 번데기 박에 남아있는 hexane을 완전히 제거하였다.
- 0)을 사용하였다. 탈지 번데기 분말(단백질함량 70%)에 완충용액을 첨가하여 분산시킨 후 효소처리를 하였다. 처리한 효소의 양은 시료 중의 단백질함량 대비 1:100(효소 : 시료의 단백질함량, w/w)으로 하였으며(17,18), 가수분해는 37℃에서 250 rpm으로 교반하면서 실시하였다.
- 탈지 번데기분말 분산농도는 각 완충용액 70 mL에 2, 5, 10, 15 및 20%의 농도에 해당하는 탈지번데기분말을 첨가하여 가수분해시킨 다음 단백질용해지수를 측정하였다. 단백질용해지수는 BCA(bicinchoninic acid) Protein Assay kit(Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 탈지 번데기분말의 분산농도를 결정하기 위하여 2, 5, 10, 15 및 20% 현탁액을 제조하고, 정제효소 2종(pepsin 및 trypsin)과 상업용 효소 2종(alcalase 및 neutrase)으로 가수분해시킨 후 단백질용해지수를 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 비 효소 처리구인 대조구의 경우 탈지번데기분말 분산농도에 관계없이 약 15%의 용해지수를 보였다.
대상 데이터
- 반응물을 실온으로 냉각한 다음 562 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 검량선(R2=0.9946)을 이용하여 가수분해물의 단백질 함량을 구하였으며, 표준물질로 BSA(bovine serum albumin, Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하였다. 상기 방법에 의해 결정된 탈지 번데기 분말 분산농도에 대한 가수분해시간을 결정하기 위하여 6, 12, 18, 24 및 30시간 동안 가수분해한 다음 단백질 용해지수를 측정하여 최적 가수분해시간을 결정하였고, 이 조건으로 가수분해물을 제조하여 실험에 사용하였다.
- 번데기 단백질의 가수분해를 위하여 정제효소 2종(pepsin 및 trypsin)과 상업용 효소 2종(alcalase 및 neutrase)을 사용하였다. 정제효소인 pepsin(E.
- 본 실험에 사용된 번데기는 시중에 유통되는 청주의 재래시장에서 냉동 번데기(Bombyx mori, China, 2006)를 구입하여 -20℃의 냉동고에 보관하면서 사용하였다. 탈지 번데기 분말 제조는 Jeon과 Park(16)의 방법을 참고하여 번데기를 -50℃에서 72시간 동결건조기(Modulyod-115, Thermo Electron Co.
- 번데기 단백질의 가수분해를 위하여 정제효소 2종(pepsin 및 trypsin)과 상업용 효소 2종(alcalase 및 neutrase)을 사용하였다. 정제효소인 pepsin(E.C. 3.4.23.1 from porcine stomach mucosa, 3,200～4,500 units/mg) 및 trypsin(E.C. 3.4.21.4 from bovine pancreas, 10,000 units/mg)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 상업용 효소인 alcalase(2.5-LDX, Subtilisin EC 3.4.21.62 from Bacillus licheniformis, 2.4 AU/mg) 및 neutrase(1.5-MG, EC 3.4.24.28 from Bacillus amyloliquefaciens, 0.8AU/mg)는 Novozyme(Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하여 사용하였다. 번데기 단백질의 가수분해를 위한 효소처리는 Lee 등(17)의 방법을 참고하여 처리하였다.
이론/모형
- 8AU/mg)는 Novozyme(Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하여 사용하였다. 번데기 단백질의 가수분해를 위한 효소처리는 Lee 등(17)의 방법을 참고하여 처리하였다. Pepsin은 0.
- 효소를 이용하여 가수분해시킨 번데기 가수분해물의 ACE(angiotensin Ⅰ converting enzyme) 저해활성은 Do 등(13)의 방법으로 측정하였다. 즉, ACE 효소액 80 μL(0.
성능/효과
- 본 실험결과 처리시간이 길어질수록 가수분해에 따른 용해지수가 증가하는 경향을 보였지만, 지나친 가수분해 처리 시 경제성 및 이취의 발생 등을 고려하여 가수분해시간을 18시간이 적당한 것으로 판단되었다. 18시간 가수분해 시 단백질의 용해지수는 대조구는 15% 정도이었으며, pepsin, trypsin, nutrase 및 alcalase 처리구에서는 각각 31, 46.86, 32.17 및 35.87%로 나타났다.
- 대조구의 경우 추출시간에 상관없이 약 15%의 용해지수를 보인 반면, 효소처리구의 경우 가수분해시간이 길어질수록 용해지수도 높아지는 경향을 나타내었다. Pepsin 처리구의 경우 6시간 처리 시 19.95%에서 12시간 처리 시 31.76%로 급격히 증가하다가 이후 완만히 증가하는 경향을 보였고, neutrase 처리구의 경우 6시간 처리 시 28.03%에서 30시간 처리 시 34.65%로 약 7% 증가한 것에 비해 trypsin 및 alcalase 처리구의 경우 6시간 처리 시 각각 39.02 및 23.87%였으며, 30시간 처리 시 각각 59.63 및 43.20%로 약 20% 이상 증가하였다. 본 실험결과 처리시간이 길어질수록 가수분해에 따른 용해지수가 증가하는 경향을 보였지만, 지나친 가수분해 처리 시 경제성 및 이취의 발생 등을 고려하여 가수분해시간을 18시간이 적당한 것으로 판단되었다.
- 37%로 가장 높은 용해지수를 보였다. Trypsin 처리구와 neutrase 처리구의 경우 탈지번데기분말 분산농도 10% 현탁액에서 가장 높은 용해지수를 보였으며, 특히 trypsin 처리구의 경우 59.37%로서 다른 효소 처리구에 비해 약 1.5～2.0배의 용해지수를 보였다. 대조구의 경우 탈지번데기분말 분산농도에 관계없이 용해지수는 유의적인 차이가 없었으나, 효소처리구의 경우 2～10%의 분산농도범위에서 용해지수가 높았으며, 10% 이상의 분산 농도에서는 용해지수가 감소하는 경향을 보였다.
- 가수분해물의 단백질 농도를 100μg/mL로 일정하게 조정한 후 ACE 저해활성을 측정한 결과대조구는 24.94%의 저해활성을 나타내었으며, pepsin 처리 가수분해물의 경우 70.45%, trypsin 처리구의 경우 83.46%, neutrase 및 alcalase 처리 가수분해물의 경우 각각 85.16 및 65.39%의 저해활성을 나타내었다.
- 2와 같다. 대조구의 경우 추출시간에 상관없이 약 15%의 용해지수를 보인 반면, 효소처리구의 경우 가수분해시간이 길어질수록 용해지수도 높아지는 경향을 나타내었다. Pepsin 처리구의 경우 6시간 처리 시 19.
- 0배의 용해지수를 보였다. 대조구의 경우 탈지번데기분말 분산농도에 관계없이 용해지수는 유의적인 차이가 없었으나, 효소처리구의 경우 2～10%의 분산농도범위에서 용해지수가 높았으며, 10% 이상의 분산 농도에서는 용해지수가 감소하는 경향을 보였다. Jeon과 Park(16)의 연구에 의하면 10%의 탈지번데기분말 분산농도에서 효소처리를 하였다고 보고하고 있으며, Han과 Hwang(20)은 5% 탈지번데기분말 분산농도에서 용해지수가 가장 높았으며, 그 이상의 농도에서는 용해지수가 감소하였다고 보고한 것과 비슷한 경향을 보였다.
- 즉, 효소마다 약간의 차이는 있으나 분산농도 5～10% 범위에서 용해지수가 높았으며, 분산 농도 10% 이상에서는 오히려 용해지수가 감소하였다. 따라서 탈지번데기분말의 최적 분산농도는 효소마다 약간의 차이는 있으나 5～10% 범위로 판단되었다.
- 특히 대조구에 비해 모든 효소 처리구에서 ACE 저해활성이 2～3배 높은 활성을 나타났다. 또한 가수분해율과 용해지수를 감안할 때 trypsin은 3배, 그리고 나머지 효소 처리구에서는 2배 이상 증가하는 것으로 나타났다. Zhang 등(23)은 중국 전통발효 콩의 ACE 저해활성에 미치는 peptide에 관한 연구에서 500 μg/mL의 농도에서 70% 이상의 ACE 저해활성을 나타내었다고 보고하였고, Do 등(13)은 어육단백질로부터 분리한 ACE 저해 peptide에 관한 연구에서 250 μg/mL의 농도에서 70% 저해 활성을 보인다고 보고한 바 있으며, Yeum과 Kim(24)은 식품단백질 효소가수분해물의 angiotensin-I 전환효소 저해작용에 대한 연구에서 효소의 복합적인 분해에 의해 생성되는 서로 다른 구조나 사슬길이 및 아미노산 배열 순서를 가지는 여러 종류의 peptide가 ACE 저해작용을 나타내는 것으로 추정하였고, 이로 미루어 효소별 동일농도의 가수분해물에서 ACE 저해활성에 차이가 나는 것은 효소마다 작용하는 기질의 반응부위가 다르며, 이로 인하여 생성된 peptide의 아미노산 배열이 다르기 때문이라 생각되어진다.
- 20%로 약 20% 이상 증가하였다. 본 실험결과 처리시간이 길어질수록 가수분해에 따른 용해지수가 증가하는 경향을 보였지만, 지나친 가수분해 처리 시 경제성 및 이취의 발생 등을 고려하여 가수분해시간을 18시간이 적당한 것으로 판단되었다. 18시간 가수분해 시 단백질의 용해지수는 대조구는 15% 정도이었으며, pepsin, trypsin, nutrase 및 alcalase 처리구에서는 각각 31, 46.
- Jeon과 Park(16)의 연구에 의하면 10%의 탈지번데기분말 분산농도에서 효소처리를 하였다고 보고하고 있으며, Han과 Hwang(20)은 5% 탈지번데기분말 분산농도에서 용해지수가 가장 높았으며, 그 이상의 농도에서는 용해지수가 감소하였다고 보고한 것과 비슷한 경향을 보였다. 즉, 효소마다 약간의 차이는 있으나 분산농도 5～10% 범위에서 용해지수가 높았으며, 분산 농도 10% 이상에서는 오히려 용해지수가 감소하였다. 따라서 탈지번데기분말의 최적 분산농도는 효소마다 약간의 차이는 있으나 5～10% 범위로 판단되었다.
- 비 효소 처리구인 대조구의 경우 탈지번데기분말 분산농도에 관계없이 약 15%의 용해지수를 보였다. 탈지번데기분말 분산농도 5% 현탁액에서 pepsin 처리구의 경우 35.79%, alcalase 처리구의 경우 43.37%로 가장 높은 용해지수를 보였다. Trypsin 처리구와 neutrase 처리구의 경우 탈지번데기분말 분산농도 10% 현탁액에서 가장 높은 용해지수를 보였으며, 특히 trypsin 처리구의 경우 59.
- 번데기 단백질의 최적 가수분해 조건을 선정하기 위해 4종의 가수분해 효소를 이용하여 번데기분말 첨가량별 및 가수분해시간에 따른 단백질 용해지수, 각각의 가수분해물의 ACE 저해활성 및 항산화활성 등을 조사하였다. 탈지번데기분말의 최적 분산농도는 5～10% 범위였으며 가수분해시간은 18시간이었고, ACE 저해활성은 neutrase, trypsin, pepsin 및 alcalase 효소처리 시 각각, 85.16, 83.46, 70.45 및 65.39%로 모든 효소 처리구가 비효소 처리구(24.94%)에 비해 높은 활성을 나타내었다. 가수분해물의 항산화활성(IC50)은 상업용 효소인 neutrase와 alcalase의 경우 각각 352.
- 39%의 저해활성을 나타내었다. 특히 대조구에 비해 모든 효소 처리구에서 ACE 저해활성이 2～3배 높은 활성을 나타났다. 또한 가수분해율과 용해지수를 감안할 때 trypsin은 3배, 그리고 나머지 효소 처리구에서는 2배 이상 증가하는 것으로 나타났다.
- 24 μg/mL을 나타내었다. 효소 처리구의 경우 효소의 종류에 따라 항산화활성에 커다란 차이를 보였으며, 정제효소인 pepsin 및 trypsin 처리 시 항산화활성이 대조구에 비해 감소하는 경향을 보였으나, 상업용 효소인 netrase와 alcalase 효소처리구와는 유사한 값을 나타내었다. Kim 등(18)은 대구고니 단백질의 효소적 가수분해물로부터 항산화성 펩타이드의 분리 · 정제 및 특성에 관한 연구에서 가수분해물의 항산화활성의 차이는 기질의 차이뿐만 아니라 각 효소가 기질에 작용하는 절단 부위가 다르기 때문에 N-말단 및 C-말단에 위치하는 아미노산의 종류가 달라지므로 항산화활성이 다르게 나타나는 것으로 보고한 바 있으며, Yamaguchi 등(25)은 각종 dipeptide와 이를 구성하는 아미노산의 항산화성 비교에서 dipeptide를 구성하고 있는 아미노산 중 Met, His, Trp, Tyr이 강한 항산화활성을 나타날때 이 아미노산들의 위치에 대해 Met과 His은 C-말단에, Try과 Tyr은 N-말단에 위치할 때 그 효과가 상승된다고 보고하였으며, 이로 미루어 가수분해물의 항산화활성은 가수분해물의 N-말단 및 C-말단에 위치하는 아미노산의 종류에 의해 영향을 받는 것으로 생각되어지며, 광범위한 항산화 펩타이드의 구성 아미노산 종류 및 길이와 항산화효과와의 상관성 규명이 필요할 것으로 판단된다.
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