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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 기존의 중합효소연쇄반응(PCR) 법보다 효율적인 유전자재조합 콩의 판별기술의 개발을 위해서 새로운 DHPLC (denaturing high perfonnance liquid chromatography) 방법을 적용하여 판별방법을 비교, 검토하였다.
- 본 연구는 유전자재조합(genetically modified, GM) 콩 (Glycine max L. MERRILL)의 검출에 빠르고 감도가 높은 기술을 모색하기 위하여 수행되었다. 기존의 PCR (polymraase chain reaction) 방법과 새로운 방법으로 시도된 DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography) 방법으로 유전자재조합 콩을 확인하였다.
제안 방법
- 중합효소연쇄반응은 시료를 94℃에서 5 분간 주형 DNA 를 완전히 변성시킨 후(hot start) 다시 94℃에서 30 초간 변성, 58℃에서 30 초간 결합(annealing), 72#에서 45 초간 신장(extension) 단계를 30회 반복하고 마지막으로 72°C에서 3 분간 마지 믹" 신장(la마 extension)을 실시하였다. PCR 반응 용액은 총 20 11L이며 10X reaction buffer (100 mM tris-HQ; pH 9.
- 9 pL로 구성 되 어 있다. DNA 증폭은 GeneAmp#PCR System 2700 (Applied Biosystems, USA) 를 이용해서 DNA를 증폭시켰다.
- PCR 증폭산물의 확인을 위하여 2%(w/v) agarose gel을 이용하여 전기 영동장치 (Mupid-u, Advance, Japan)로 분석하였다.
- 분석하였다. 그 후 PCR 산물을 분석하여 대두의 GM 여부를 확인하였다 (Fig. 2). 그 결과 PCR 방법을 통한 결과와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
- 8 yL를 섞어서 gel에 loading 하고 100 V에서 25분 동안 전기영동 시켰다. 그 후에 gel을 ethidium bromide로 10분간 염 색하고 다시 10 분간 증류수로 DNA와 결합하지 못한 ethidium bromide을 씻어 냈으며, UV transilluminator 위 에 agarose gel을 올려 놓고 PCR 여 부를 확인하였다.
- MERRILL)의 검출에 빠르고 감도가 높은 기술을 모색하기 위하여 수행되었다. 기존의 PCR (polymraase chain reaction) 방법과 새로운 방법으로 시도된 DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography) 방법으로 유전자재조합 콩을 확인하였다. DHPLC 방법은 기존의 PCR방법에서의 전기영동이 방법 대신 컬럼을 이용하여 분석할 수 있다.
- 대두의 DNA(15 ng/uL) 를 1/10 만큼 serial dilution 하여 PCR 방법과 DHPLC 방법을 검출 테스트를 한 결과, 각각의 실험에서 농도별 detection limit 확인하였다(Table 3, Fig. 3〜Fig. 6).
- 하였다. 상층액을 버리고 얻어진 pellet을 건조 한 후에 D.W 또는 0.1X TE에 50 pL~100 pL로 용해하여 전기영동으로 확인하였다(12, 13).
- 있지 않다. 앞으로 유전자 변형 농산물의 특이 유전자 부위를 DHPLC 방법을 이용하여 찾아낼 것이다.
- 우선 컬럼의 재현성과 이동상 완충용액의 상태를 확인하기 위해서 size standard를 5 pL씩 3번 주입하여 분석하였다. 그 후 PCR 산물을 분석하여 대두의 GM 여부를 확인하였다 (Fig.
- DHPLC 방법을 사용하였다. 원료 콩을 분말로 분쇄하여 DNA를 채취 후 유전자 변형 대두의 특이 유전자(180 bp, 288 bp)를 증폭하여 검줄 한계를 즉정하였다. 유전자재조합 농작물을 효과적으로 검출할 수 있는 방법은 ELISA와 PCR 방법 이 다.
- 유전자재조합 콩의 판별을 위하여 PCR 산물을 전기영동과 정제 과정을 거치지 않고, 곧바로 DHPLC (WAVER SYSTEM, Transgenomic, USA)를 사용하여 검출하였다.
- 컬럼의 재현성과 완충용액 이동상의 상태를 확인하기 위해 size standard (Trangenomic, USA) 를 5 yL씩 3 번 주입하여 분석하였다 이 후 PCR 산물을 컬럼 오븐 온도 5 CTC에서 이동상의 속도를 0.75 mL/min로 하여 5 11L 주입해 WAVEMAKER™ software (Table 2)에 의해 정해진 gradient 조건으로 분석하였고, UV 검출기로 260 nni에서 검출하였다 (8).
대상 데이터
- 실험에 사용한 원료 콩은 2006년 수확되어 2007년도 재래시장, 유명마트에서 시판되는 국내산 및 수입산 콩으로 서리태와 백태인 대두(GZyci* max L. MERRILL)를 구입하여 공시재료로 사용하였다.
- 원료 콩의 알려져 있는 내재유전자와 GMO유전자 (NO)를 증폭하기 위한 프라이머 세트는 Table 1과 같이 제작하여 사용하였다.
이론/모형
- PCR 방법은 ELISA 방법에 비해 빠르고 간편하여 많이 이용되고 있지만 전기영동으로의 검출 한계가 있어 문제가 되고 있다 따라서 검출 한계를 높일 수 있는 DHPLC 방법을 사용하였다. 그 결과 PCR방법에서는 15 ng/pL의 104 농도까지 검출할 수 있었고, DHPLC 방법으로는 15 ng/pL의 105 농도까지 검출 할 수 있었다.
- 유전자재조합 콩의 간단하고 빠른 분석을 위해 :PCR 방법과 DHPLC 방법을 사용하였다. 원료 콩을 분말로 분쇄하여 DNA를 채취 후 유전자 변형 대두의 특이 유전자(180 bp, 288 bp)를 증폭하여 검줄 한계를 즉정하였다.
성능/효과
- 사용하여 PCR을 실시하였다. Fig. 1에서 GM 콩의 경우에는 내재 유전자인 Lectrn 유전자 밴드(288 bp)와 재조합 유전자인 NOS terminator 유전자 밴드(180 bp)가 확인되었고(Fig. 1. lane 2), GM 콩이 아닌 경우에는 내재 유전자인 Lectin 유전자 밴드만을 확인할 수 있었다(Fig. 1, lane 3). 그 결과 미국산 백태를 제외한 국산 서리태와 백태 그리고 러시아산 백태는 GM 콩이 아닌 것으로 판명되었다(3-5).
- 때문에 분석시간도 60분에서 20분으로 단축시킬 수 있다. 검출한계도 PCR방법에서는 15 ng/pL의 104 농도까지 검출할 수 있었고, DHPLC 방법으로는 15 ng/pLSl 105 농도까지 검출 할 수 있었다. 따라서 유전자재조합 콩 검출법으로 DHPLC 분석법이 PCR 분석법보다 빠르고 정확한 효과적인 방법임을 확인하였다.
- 그 결과 PCR방법에서는 15 ng/pL의 104 농도까지 검출할 수 있었고, DHPLC 방법으로는 15 ng/pL의 105 농도까지 검출 할 수 있었다. 또한 신속성을 비교한 결과 PCR 방법은 전기 영동의 결과가 60분 정도 소요되지만 DHPLC 방법은 20분 안에 결과를 확인할 수 있었다.
- 1, lane 3). 그 결과 미국산 백태를 제외한 국산 서리태와 백태 그리고 러시아산 백태는 GM 콩이 아닌 것으로 판명되었다(3-5).
- 검출한계도 PCR방법에서는 15 ng/pL의 104 농도까지 검출할 수 있었고, DHPLC 방법으로는 15 ng/pLSl 105 농도까지 검출 할 수 있었다. 따라서 유전자재조합 콩 검출법으로 DHPLC 분석법이 PCR 분석법보다 빠르고 정확한 효과적인 방법임을 확인하였다.
- 시간을 절약할 수 있었다. 또한 모든 실험 과정이 자동화되어 있어 분석 결과의 재현성이 높다고 평가할 수 있었다.
- 그 결과 PCR방법에서는 15 ng/pL의 104 농도까지 검출할 수 있었고, DHPLC 방법으로는 15 ng/pL의 105 농도까지 검출 할 수 있었다. 또한 신속성을 비교한 결과 PCR 방법은 전기 영동의 결과가 60분 정도 소요되지만 DHPLC 방법은 20분 안에 결과를 확인할 수 있었다.
- 원료 콩의 DNA(15 ng/#)를 1/10 만큼 serial dilution 하여 PCR 방법과 DHPLC 방법을 검출 테스트를 한 결과, PCR 방법에서는 15 ng/pL 의 10, 의 DNA 농도까지 분석되었으며 DHPIL의 경우는 15 °C 의 105 농도도 분석할 수 있었다 (Table 3, Fig. 3 —Fig. 6 ).
- 유전자재조합 콩의 검출 방법으로 PCR 방법과 DHPLC 방법이 모두 사용가능 하지만 신속성과 감도는 DHPLC 방법이 더 효과적인 것으로 확인되었다.
- 정제 과정을 거치지 않은 PCR 산물을 자동 시료 주입기에 장착하면 syringe에 의해 컬럼에 주입되어 적절한 이동상의 gradient로 분리하면 DNA 단편의 크기 차이에 의해다 형성을 검출할 수 있었다.
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