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문제 정의
- 유산균의 EPS는 그 이용성이 무궁한 반면 생산성이 적다는 것에 한계가 있어 이를 최대화하는 연구가 수행되어왔고, 보고된 실험결과 다양한 배지 조건과 환경이 EPS 생산에 영향을 줄 수 있다고 제시된 바 있다(7, 8, 12). 따라서 본연구에서는 배지 환경에 따른 EPS의 생산성 변화와 EPS 생산에 영향을 미치는 중요한 인자를 찾는데 그 목적이 있다.
제안 방법
- 이렇게 얻어진 EPS 침출물을 3차 증류수에 녹인 후 투석막 (7000 Da molecular cut)을 이용하여 하루 동안 투석하였다. EPS 침출물이 포함된 투석된 용액을 동결 건조시키고 EPS를 분리하였다.
- MRS 배지의 개선이 필요하였다. 먼저 beef extract (10 g), yeast extract (5 g), bacto tryptose (10 g) 는 1 L 증류수에 하루 동안 투석막 (Molecular cut 7000 Da)을 통해서 투석을 실시하여 배지 내 고분자 다당 물질을 제거하였고, 증류수에 나머지 성분인 Tween 80 (1 ml), Ammonium citrate (2 g), Sodium acetate (5 g), K가IPO4 (2 g)을 첨가하여 투석용 MRS인 실험 배지를 만들었다
- 배지 내 초기 pH가 EPS 생산량을 변화시키는 요인이 되는지를 알아보기 위해서 pH 조건을 다음과 같은 조건으로 (pH 7, pH 6, pH 5, pH 4) 준비하였고, 10분 간격으로 시료를 취하여 1시간 동안 EPS 생산량 변화를 관찰하였다 (Fig. l.
- 배지의 탄소원으로 glucose를 사용하였고, glucose의 양을 최소 20 g/L부터 최대 80 g/L까지 20 g씩 증가시켰을 때 탄소 원의 증가에 따른 EPS 생산변화를 관찰하였다. EPS 생산은 glucose를 20 g/L로 사용했을 때보다 다음과 같은 3 가지 조건 (40 g/L, 60 g/L, 80 g/L)의 경우에 EPS 생산량이 모두 증가하였으며, 특히 40 以L로 glucose 사용량을 변화시켰을 때 EPS가 18 mg/ml 이상 증가된 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 온도는 25℃, 32℃, 37℃ 그리고 42℃에서 EPS 생산 변화량을 측정하였다. 온도가 25℃ 일 때 EPS 생산량은 L당 63.
- 침전시킨 상등액을 다시 원심분리 (11,000 rpm, 40 min)를 통해서 EPS 침출물을 얻었다. 이렇게 얻어진 EPS 침출물을 3차 증류수에 녹인 후 투석막 (7000 Da molecular cut)을 이용하여 하루 동안 투석하였다. EPS 침출물이 포함된 투석된 용액을 동결 건조시키고 EPS를 분리하였다.
- 질소원의 증가에 따른 EPS 생산량 변화 관계를 알아보기 위해서 casamino acid를 질소원으로 이용하여 EPS 생산량을 관찰하였다. EPS 생산 변화는 30 g/L에서 50 既로 casamino acid의 양을 변화시켰을 때 약 5 mg/ml로 큰 증가를 보이지 않았다(Fig.
- 이는 EPS 생산에 적절한 탄소원의 농도가 40 g/L라는 것을 확인할 수 있었다. 탄소원의 증가에 따른 L. paracasei KLB 58의 성장변화를 관찰하였다. glucose양을 20 g/L에서 40 g/L로 증가시켰을 때, L.
대상 데이터
- 높은 다당 (Exopolysaccharide) 생산성을 가지는 균주를 찾기 위해서 여성의 질에서 분리된 100개의 유산균을 colony 관찰을 통해 외형상 다당을 많이 생산해 내는 10가지 균을 선택하였다. 이렇게 선별된 균주들로부터 다당류를 조분리한후 페놀-황산법을 이용하여 정량하였고(3), 높은 생산량을 가진 Lactobacillus paracasei KLB 58°] 선택되었다.
- 초기 탄소원으로 glucose, galactose, sucrose, lactose 4가지를 사용하였다. galactose를 배지 탄소원으로 사용했을 때 균의 성장이 가장 빨랐으며(Fig.
이론/모형
- 분리한 EPS는 페놀-황산법을 이용하여 정량하였다(3). 분리된 EPS 30 以와 5% phenol 30 以를 잘 섞어 96 well plate에 분주한 후 황산 100 成를 빠르게 96 well plate에 넣어준다.
- 이렇게 선별된 균주들로부터 다당류를 조분리한후 페놀-황산법을 이용하여 정량하였고(3), 높은 생산량을 가진 Lactobacillus paracasei KLB 58°] 선택되었다.
성능/효과
- 2(A)) 과 EPS 생산량 모두 낮았으나(Fig. 2(B)), lactose는 EPS 생산 수율 면에서 다른 어떤 탄소원보다 더 높은 효율을 얻을 수 있었다. 이는 homopolysaccahride 형태의 EPS가 생산될때 나타난다고 보고된 바 있다(11).
- 그러나 배지 내 초기 pH가 6인 경우 L paracasei KLB58의 최대 성장률은 pH 7일 때보다 낮았지만, EPS 생산량은 pH 가 6인 경우 배양 시간 10분부터 증가하기 시작하여, 20분 후에는 pH가 7인 경우보다 생산량이 높아졌음을 알 수 있었다. 30분 후 EPS 최대 생산량 (32.64 mg/ml)을 얻을 수 있었고, 서로 다른 pH 조건에서 pH가 6일 때 가장 높은 EPS 생산량을 얻을 수 있었다. EPS 생산을 수율 (EPS 최대 생산량 / 최대 성장률) 측면에서 본다면 pH가 4일 때를 제외하고, pH가 7보다 낮은 모든 배지에서 EPS 생산 수율이 높음을 관찰할 수 있었으며, pH가 6일 때 EPS 생산량과 수율을 높이기에 가장 적합하다는 것을 알 수 있었다.
- 1(B)). EPS 생산량도 pH가 4인 경우 가장 낮았으나, 배지 내 초기 pH가 5일 때 최대 EPS 생산량은 pH 7과 비슷하였고, EPS 생산량은 각각 26.74 mg/ml, 26.08 mg/ml이었다. 그러나 배지 내 초기 pH가 6인 경우 L paracasei KLB58의 최대 성장률은 pH 7일 때보다 낮았지만, EPS 생산량은 pH 가 6인 경우 배양 시간 10분부터 증가하기 시작하여, 20분 후에는 pH가 7인 경우보다 생산량이 높아졌음을 알 수 있었다.
- EPS 생산은 glucose를 20 g/L로 사용했을 때보다 다음과 같은 3 가지 조건 (40 g/L, 60 g/L, 80 g/L)의 경우에 EPS 생산량이 모두 증가하였으며, 특히 40 以L로 glucose 사용량을 변화시켰을 때 EPS가 18 mg/ml 이상 증가된 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 4(A)).
- 64 mg/ml)을 얻을 수 있었고, 서로 다른 pH 조건에서 pH가 6일 때 가장 높은 EPS 생산량을 얻을 수 있었다. EPS 생산을 수율 (EPS 최대 생산량 / 최대 성장률) 측면에서 본다면 pH가 4일 때를 제외하고, pH가 7보다 낮은 모든 배지에서 EPS 생산 수율이 높음을 관찰할 수 있었으며, pH가 6일 때 EPS 생산량과 수율을 높이기에 가장 적합하다는 것을 알 수 있었다. 즉 L.
- EPS 생산량은 온도가 낮아질수록 점차 높아졌다. L. paracasei KLB 58은 성장하기에 알맞은 최적 온도가 37P 보다 낮은 32C에서도 비슷한 성장률을 보였고, 25℃인 경우는 37℃ 일 때보다는 다소 적지만 거의 비슷한 성장을 보였다. 하지만 42 ℃ 일 때는 37 ℃ 일 때보다 상대적으로 L paracasei KLB 58의 성장률이 낮았다(Fig.
- 5(A)). L. paracasei KLB 58의 성장은 casamino acid의 양을 50 g/L까지 변화를 주었을 때 균의 성장도 증가하였으나, 그 이상인 70 g/L를 넣어주었을 때는 균의 성장이 증가하지 않았다(Fig. 5(B)).
- 08 mg/ml이었다. 그러나 배지 내 초기 pH가 6인 경우 L paracasei KLB58의 최대 성장률은 pH 7일 때보다 낮았지만, EPS 생산량은 pH 가 6인 경우 배양 시간 10분부터 증가하기 시작하여, 20분 후에는 pH가 7인 경우보다 생산량이 높아졌음을 알 수 있었다. 30분 후 EPS 최대 생산량 (32.
- 배지 내 초기 pH가 낮을수록 L. paracasei KLB 58의 성장 속도가 느려졌으며, pH가 4일 때 가장 느려졌다(Fig. 1(B)).
- 측정하였다. 온도가 25℃ 일 때 EPS 생산량은 L당 63.7 mg/ml로 가장 많이 생산되었고, 42℃ 일 때는 L당 19.9 mg/ml로 가장 낮은 EPS 생산량을 보였다(Fig. 3(A)).
- EPS 생산을 수율 (EPS 최대 생산량 / 최대 성장률) 측면에서 본다면 pH가 4일 때를 제외하고, pH가 7보다 낮은 모든 배지에서 EPS 생산 수율이 높음을 관찰할 수 있었으며, pH가 6일 때 EPS 생산량과 수율을 높이기에 가장 적합하다는 것을 알 수 있었다. 즉 L. paracasei KLB 58인 경우 EPS 생산 수율이 정상 조건인 pH가 7일 때보다 산성의 조건에서 높다는 것이 관찰되었다. 산성의 조건은 균의 세포막 형태에 변형을 가져올 수 있으며 이런 물성의 변화가 세포막에 형성되는 EPS 생산량에 변화를 준다고 보고된 바 있다(10).
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