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문제 정의
- 6균주 모두 AOS를 첨가하지 않은 MRS 액체배지에서보다 AOS를 첨가한 MRS 액체배지에서 선택적으로 높은 성장율을 나타내었다(data not shown). 따라서 probiotic 특성을 나타내는 분리 균주가 prebiotics로써 AOS를 선택적으로 이용함으로써 AOS의 새로운 prebiotics로써의 가능성을 확인하였다.
- 본 연구에서는 전통 장류에서 분리한 식물성 유산균 중 EPS 생산 유산균을 선발하여 항균 활성, 인공위액 및 인공 담즙 저항성 시험을 통하여 선발 유산균의 probiotics로써 특성 분석과 synbiotics 관점의 prebiotics로써 arabinooligosaccharides(AOS)의 이용 가능성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- DNA 유전자 염기서열 분석은 (주)제노텍(Daejeon, Korea) 에 의뢰하여 분석하였으며, 사용된 primer는 518F(5'- CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3')와 800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3’)을 사용하였다. 16S rDNA 유전자의 염기서열 분석 후, NCBI의 database를 통하여 유사균주들과 비교하였다. 또한 염기서열을 Clustal X program을 이용하여 정렬한 후, neighbor-joining method(13)에 의거 하여 분리 균주의 계통분류학적 위치를 조사하였다.
- Glucose 무첨가 MRS에 3% AOS를 첨가한 배지를 제조하여 균주 배양액을 접종한 후 배양(37°C, 48 hr) 중 일정 시간 간격으로 흡광도(Abs. at 660 nm)를 측정하였다.
- 장류유래 유산 균주의 세포 외 다당 및 올리고당 생산을 스크리닝 하기 위하여 균주 배양액을 thin layer chromatography(TLC) 분석으로 확인하였다. Homo-EPS 생성 확인을 위하여 MRS 배지를 5 kDa cutoff ultrafiltration(Pall, Port Washington, NY, USA)하여 배지 내 단백다당을 제거 한 후, 2% sucrose와 maltose를 첨가하였다. 분리 균주는 37°C에서 24시간, 30°C에서 7시간 배양 후, 8,000 rpm에서 10분 동안 원심분리(6200, Kubota, Tokyo, Japan) 하여 상등액을 TLC 스크리닝 시료로 사용하였다.
- MRS 액체배지에 균을 접종하여 37°C에서 24시간 배양한 후 배양액을 인공위액에 넣고, 진탕배양(37°C, 2 hr) 후 생균수를 측정하여 생존율(%)로 나타내었다.
- 추출된 genomic DNA, EPS 생합성 관련 유전자 primer 및 Amfieco PCR premix(GenDEPOT, Barker, Houston, TX, USA)로 Bio-Rad C1000 thermal cycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 Table 1의 조건으로 분석하였다. PCR 산물을 1.5% agarose gel 로 전기영동 하여 유전자 발현 여부를 확인하였다.
- 전 배양된 균체를 원심분리(8,000 rpm, 10분) 한 후, 멸균증류수로 잔여 배지성분을 씻어내었다. Total genomic DNA는 QIAamp DNA mini kit(Qiagen, Hilden, Germany) 권장 매뉴얼에 따라 추출하였다. 추출된 genomic DNA, EPS 생합성 관련 유전자 primer 및 Amfieco PCR premix(GenDEPOT, Barker, Houston, TX, USA)로 Bio-Rad C1000 thermal cycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 Table 1의 조건으로 분석하였다.
- 5% naphtal, 5% H2SO4 in ethanol)로 발색시킨 후, 105°C 오븐에 3분 굽고 spot을 확인하였다. 다당 생성 농도를 정량적 스크리닝 하기 위해 배양액의 spot 농도는 multi gauge(Fuji film, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 균을 배양하지 않은 배지 spot(control)의 농도와 균배양액의 spot의 농도를 비교하여 180% 이상 차이를 보인 균주를 EPS 우수생성 균주로 선발하였다(Fig.
- at 660 nm)를 측정하였다. 또한 TLC 분석을 통해 배양액의 AOS 소비패턴을 확인하였다.
- 배양액 1 μL 4회 점적하고 전개용매(ACN : water=85:15)로 4회 전개하였으며, 발색용매(0.5% naphtal, 5% H2SO4 in ethanol)로 발색시킨 후, 105°C 오븐에 3분 굽고 spot을 확인하였다.
- 분리 균주의 synbiotics 능력 평가를 위한 prebiotics로 arabino-oligosaccharide(AOS) 이용 평가를 실시하였다. Glucose 무첨가 MRS에 3% AOS를 첨가한 배지를 제조하여 균주 배양액을 접종한 후 배양(37°C, 48 hr) 중 일정 시간 간격으로 흡광도(Abs.
- 분리 균주의 체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 인공위액 내성실험을 실시하여 확인하였다. 인공 위액 내성 실험은 Kobayashi의 방법(15)을 변형하여 1 N HCl로 pH 2.
- 선발 균주는 16S rDNA 서열분석을 통하여 동정하였다. DNA 유전자 염기서열 분석은 (주)제노텍(Daejeon, Korea) 에 의뢰하여 분석하였으며, 사용된 primer는 518F(5'- CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3')와 800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3’)을 사용하였다.
- 선발 균주의 EPS 생성 관련 유전자 확인을 위해 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다. 전 배양된 균체를 원심분리(8,000 rpm, 10분) 한 후, 멸균증류수로 잔여 배지성분을 씻어내었다.
- 유해 균주 배양액을 optical density(660 nm)를 0.5가 되도록 일정농도의 균수로 조절하여 0.7% NA soft agar(Difco)에 0.3%의 농도로 접종하여 혼합한 뒤 NA 평판배지에 5 mL 분주하여 굳힌 후, 1 mm의 구멍을 내고 전 배양된 분리 균주를 5 μL씩 접종하여 배양하여 저해환(clear zone)을 확인하였다.
- 인공 담즙에 대한 저항성은 Paik의 방법(16)을 변형하여 멸균된 10% oxgall을 1% 첨가하여 인공담즙을 제조하였다. MRS 액체배지에 균을 접종하여 37°C에서 24시간 배양한 후 배양액을 인공위액에 넣고, 진탕배양(37°C, 2 hr) 후 생균수를 측정하여 생존율(%)로 나타내었다.
- 인공 위액 내성 실험은 Kobayashi의 방법(15)을 변형하여 1 N HCl로 pH 2.5로 조정한 MRS 액체배지(Difco)에 0.22 μm membrane filtration(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)한 1% pepsin(Sigma-Aldrich Co.)을 첨가하여 인공 위액을 제조하였다.
- 장류유래 유산 균주의 세포 외 다당 및 올리고당 생산을 스크리닝 하기 위하여 균주 배양액을 thin layer chromatography(TLC) 분석으로 확인하였다. Homo-EPS 생성 확인을 위하여 MRS 배지를 5 kDa cutoff ultrafiltration(Pall, Port Washington, NY, USA)하여 배지 내 단백다당을 제거 한 후, 2% sucrose와 maltose를 첨가하였다.
- 전통 장류에서 유산균 성상을 보이는 균주를 분리하여, TLC와 PCR을 통하여 HoPS를 우수하게 생성하는 균주 HSB15, JSA22, JSA57, JSB22, JSB66 및 JSB89를 선발하였다. 선발된 6균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과 HSB15는 L.
- Total genomic DNA는 QIAamp DNA mini kit(Qiagen, Hilden, Germany) 권장 매뉴얼에 따라 추출하였다. 추출된 genomic DNA, EPS 생합성 관련 유전자 primer 및 Amfieco PCR premix(GenDEPOT, Barker, Houston, TX, USA)로 Bio-Rad C1000 thermal cycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 Table 1의 조건으로 분석하였다. PCR 산물을 1.
대상 데이터
- DNA 유전자 염기서열 분석은 (주)제노텍(Daejeon, Korea) 에 의뢰하여 분석하였으며, 사용된 primer는 518F(5'- CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3')와 800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3’)을 사용하였다.
- 다당 생성 농도를 정량적 스크리닝 하기 위해 배양액의 spot 농도는 multi gauge(Fuji film, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 균을 배양하지 않은 배지 spot(control)의 농도와 균배양액의 spot의 농도를 비교하여 180% 이상 차이를 보인 균주를 EPS 우수생성 균주로 선발하였다(Fig. 1).
- 본 실험에서 사용한 장류는 전국 각지에서 12종을 수집하였다. 균주 Listeria monocytogenes LMG 13305, Staphylococcus aureus DSM 346, Bacillus cereus ATCC 27348, Escherichia coli DSM 30083, Salmonella enterica IFO 3313을 사용하였다. 분석에 사용한 시약은 Sigma-Aldrich Co.
- 분리 균주의 항균 활성은 agar-well diffusion assay를 사용하여 분석하였다(14). 대상세균으로는 식중독 감염의 원인균으로 보고된 그람양성 세균인 Listeria monocytogenes LMG 13305, Staphylococcus aureus DSM 346, Bacillus cereus ATCC 27348, 그람음성 세균인 Escherichia coli DSM 30083, Salmonella enterica IFO 3313을 사용하였다. 유해 균주 배양액을 optical density(660 nm)를 0.
- MRS 액체배지에 균을 접종하여 37°C 에서 24시간 동안 200 rpm의 조건에서 배양(VS-8480SF, Vision, Bucheon, Korea)한 후, 배양액 1 mL를 50 mL의 인공위액을 가하여 배양(37°C, 2 hr, 200 rpm)하고 생균수를 계수하여 생존율(%) [(실험구의 Log 지수값/대조구의 Log 지수값)×100]로 나타내었다. 대조구는 pepsin을 첨가하지 않고 pH 조절하지 않은 MRS 액체배지를 사용하였다.
- MRS 액체배지에 균을 접종하여 37°C에서 24시간 배양한 후 배양액을 인공위액에 넣고, 진탕배양(37°C, 2 hr) 후 생균수를 측정하여 생존율(%)로 나타내었다. 대조군은 10% oxgall을 첨가하지 않은 MRS 액체배지를 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 장류는 전국 각지에서 12종을 수집하였다. 균주 Listeria monocytogenes LMG 13305, Staphylococcus aureus DSM 346, Bacillus cereus ATCC 27348, Escherichia coli DSM 30083, Salmonella enterica IFO 3313을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 수행하였으며, SPSS 12.0(Statistical Package for the Social Science, IBM, Armonk, NY, USA)을 이용하여 일원배치분산분석(ANOVA)을 실시하였으며, 사후검정은 Duncan's multiple range test에 의하여 실행하였다.
이론/모형
- 16S rDNA 유전자의 염기서열 분석 후, NCBI의 database를 통하여 유사균주들과 비교하였다. 또한 염기서열을 Clustal X program을 이용하여 정렬한 후, neighbor-joining method(13)에 의거 하여 분리 균주의 계통분류학적 위치를 조사하였다.
- 분리 균주의 항균 활성은 agar-well diffusion assay를 사용하여 분석하였다(14). 대상세균으로는 식중독 감염의 원인균으로 보고된 그람양성 세균인 Listeria monocytogenes LMG 13305, Staphylococcus aureus DSM 346, Bacillus cereus ATCC 27348, 그람음성 세균인 Escherichia coli DSM 30083, Salmonella enterica IFO 3313을 사용하였다.
성능/효과
- Parabrevis와 98~100%의 상동성을 보였다(Table 3). 16S rDNA 유전자의 구조에 근거하여 기존 젖산균과의 분자 계통학적 유연관계를 파악하기 위하여 phylogenetic tree 를 작성한 결과, 각 분리 균주들은 위에서 언급한 유산균을 포함하는 계통학적 그룹에 포함됨을 알 수 있었다(Fig. 2).
- 4). 6균주 모두 AOS를 첨가하지 않은 MRS 액체배지에서보다 AOS를 첨가한 MRS 액체배지에서 선택적으로 높은 성장율을 나타내었다(data not shown). 따라서 probiotic 특성을 나타내는 분리 균주가 prebiotics로써 AOS를 선택적으로 이용함으로써 AOS의 새로운 prebiotics로써의 가능성을 확인하였다.
- 3%)보다 고농도의 oxgall이 함유된 배지에서 생육할 수 있어야 한다(16). HoPS를 생성하는 분리 균주의 인공위액과 인공담즙에 대한 내성을 조사한 결과, HSB15, JSA22와 JSA57은 70% 이상의 높은 인공위액에 대한 내성을 나타내었고, JSB22는 63.31%, JSB66과 JSB 89는 각각 36.49%, 44.26%의 인공위액내성을 나타내었다 (Fig. 3). 이러한 균주는 주재료인 콩과 함께 채소류를 부재료로 하여 발효시킨 별미장에서 유래하였으며, 채소발효에 의해 김치와 유사한 젖산발효가 일어난 pH가 낮은 조건에서 생육하였기 때문에 내산성을 가지는 것으로 사료된다.
- 장류로부터 유산균 성상을 보이는 458개의 균주 중, TLC 분석으로 HoPS를 생성하는 6개의 분리 균주의 다당 생성 유전자(Dsr1, Gtf, FTF2, Lev)를 확인한 결과는 Table 2와 같다. JSA57과 JSB22에서 Dsr1과 FTF2 유전자가 존재하는 것을 확인하였다. 생성된 다당은 세포 외로 분비되거나 세포벽(cell wall)에 부착된 상태로 host 장내상피세포의 adhesion 및 invasion에 관여하는 중요한 역할을 할 것으로 판단된다.
- Probiotic 특성을 지닌 분리 균주의 prebiotics로써 AOS를 이용한 시간에 따른 성장율을 관찰한 결과, AOS를 탄소원으로 균체 증식에 소모되는 것과 균주별 소비 패턴이 다르다는 것을 확인하였다. 특히 JSB22가 AOS를 이용한 성장율이 가장 우수하였으며, JSB66와 JSB89도 높은 성장율을 보였다(Fig.
- 36%)를 제외한 분리 균주 모두 80%이상의 높은 내담즙성을 가지고 있었다. Probiotics로 알려져 있는 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)와 비교했을 때 인공위액과 담즙액에서 내성이 떨어지지 않는 것을 관찰하였다. 한편 산양유로부터 분리된 Streptococcus salivarius와 Lactobacillus lactis는 pH 3.
- TLC와 PCR 분석을 통해 선발된 HoPS 생산 6균주의 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, HSB15, JSA22, JSA57, JSB22, JSB66, JSB89는 Lb. alimentarius, Lb.
- 항균 활성은 6균주 중에서 JSA22가 4개의 병원성균에 대한 항균을 나타내어항균 활성이 가장 우수하게 나타났고, 인공위액 저항성은 HSB15, JSA22와 JSA57 균주가 70% 이상의 높은 인공위액 저항성으로 가장 우수했으며, 인공담즙 저항성은 HSB15를 제외한 5균주에서 80% 이상의 생존율을 나타내며 담즙액 저항성이 우수하게 나타났다. 또한 probiotic 특성을 지닌 분리 균주의 prebiotics로써 AOS를 이용한 성장율을 관찰한 결과, 모든 분리 균주가 AOS를 선택적으로 이용하며 성장하는 것을 관찰하였고 특히 JSB22가 AOS 이용 성장율이 가장 우수한 것으로 확인되었다. 본 연구를 통해 장류유래 probiotics를 선발하였고 AOS의 새로운 prebiotics로 활용을 검토한 바, synbiotics로 이용할 수 있는 가치가 있다고 판단되었다.
- 또한 probiotic 특성을 지닌 분리 균주의 prebiotics로써 AOS를 이용한 성장율을 관찰한 결과, 모든 분리 균주가 AOS를 선택적으로 이용하며 성장하는 것을 관찰하였고 특히 JSB22가 AOS 이용 성장율이 가장 우수한 것으로 확인되었다. 본 연구를 통해 장류유래 probiotics를 선발하였고 AOS의 새로운 prebiotics로 활용을 검토한 바, synbiotics로 이용할 수 있는 가치가 있다고 판단되었다.
- 분리 균주의 항균 활성을 측정하기 위하여 분변오염의 지표가 되는 E. coli, 식중독 원인균인 Listeria, Staphylococcus, Salmonella, B. cereus에서 항균 활성을 측정한 결과, JSA22가 4개의 병원성 균에 대해 가장 우수한 항균력을 나타내었고, JSB22가 3개의 병원성 균에 대한 항균력을 나타내었다. 그리고 HSB15, JSA57과 JSB66은 각각 1개의 병원성 균에 대한 항균력을 나타내었다(Table 4).
- 전통 장류에서 유산균 성상을 보이는 균주를 분리하여, TLC와 PCR을 통하여 HoPS를 우수하게 생성하는 균주 HSB15, JSA22, JSA57, JSB22, JSB66 및 JSB89를 선발하였다. 선발된 6균주의 16S rDNA의 염기서열을 분석한 결과 HSB15는 L. alimentarius, JSA22는 L. plantarum, JSA57은 L. pentosus, JSB22는 L. brevis, JSB66는 L. alimentarius, JSB89는 L. parabrevis로 동정되었다. 항균 활성은 6균주 중에서 JSA22가 4개의 병원성균에 대한 항균을 나타내어항균 활성이 가장 우수하게 나타났고, 인공위액 저항성은 HSB15, JSA22와 JSA57 균주가 70% 이상의 높은 인공위액 저항성으로 가장 우수했으며, 인공담즙 저항성은 HSB15를 제외한 5균주에서 80% 이상의 생존율을 나타내며 담즙액 저항성이 우수하게 나타났다.
- Probiotic 특성을 지닌 분리 균주의 prebiotics로써 AOS를 이용한 시간에 따른 성장율을 관찰한 결과, AOS를 탄소원으로 균체 증식에 소모되는 것과 균주별 소비 패턴이 다르다는 것을 확인하였다. 특히 JSB22가 AOS를 이용한 성장율이 가장 우수하였으며, JSB66와 JSB89도 높은 성장율을 보였다(Fig. 4). 6균주 모두 AOS를 첨가하지 않은 MRS 액체배지에서보다 AOS를 첨가한 MRS 액체배지에서 선택적으로 높은 성장율을 나타내었다(data not shown).
- parabrevis로 동정되었다. 항균 활성은 6균주 중에서 JSA22가 4개의 병원성균에 대한 항균을 나타내어항균 활성이 가장 우수하게 나타났고, 인공위액 저항성은 HSB15, JSA22와 JSA57 균주가 70% 이상의 높은 인공위액 저항성으로 가장 우수했으며, 인공담즙 저항성은 HSB15를 제외한 5균주에서 80% 이상의 생존율을 나타내며 담즙액 저항성이 우수하게 나타났다. 또한 probiotic 특성을 지닌 분리 균주의 prebiotics로써 AOS를 이용한 성장율을 관찰한 결과, 모든 분리 균주가 AOS를 선택적으로 이용하며 성장하는 것을 관찰하였고 특히 JSB22가 AOS 이용 성장율이 가장 우수한 것으로 확인되었다.
후속연구
- 또한 Kim 등의 연구에서 위액과 담즙에서의 높은 저항성은 분리 균주의 EPS 생성으로 인한 균체 보호막 작용에 의한 결과라고 보고하였다(20). 따라서 EPS를 생성하는 분리 균주들을 우수한 위액내성과 담즙내성을 나타내어 장내 환경에서도 생존 가능한 probiotics로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 유산균은 lactic acid를 생성하여 산도를 낮춤으로써 병원성 세균의 생육을 억제하는 것으로 알려져 있으며, bacteriocin 등의 항균성 펩티드를 생성하여 항균작용을 나타낸다(17). 따라서 항균 활성이 우수한 분리 균주 JSA22와 JSB22는 장에 머물면서 유해 균주 증식을 억제하여 장내균총을 개선시키는 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.
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