[국내논문]Endothelin-1 생성 저해와 멜라닌생성 저해에 의한 신선초 추출물의 미백 효과 Whitening Effect of Angelica keiskei Koidzumi Extract by Inhibition of Endothelin-1 Production and Melanogenesis원문보기
신선초 추출물 및 그의 분획물의 미백 효과를 알아보기 위하여, B16 멜라노마와 정상 사람 표피 세포를 이용하여 멜라닌 생성에 관련된 다양한 실험을 실시하였다. 70% ethanol 용매로 추출한 신선초 추출물을 연속적으로 분획하여 hexane, ethyl acetate, n-butanol, 물 분획물을 얻었다. 버섯 티로시나제 활성 실험에서 신선초 추출물 및 그의 분획물은 저해 효과를 보이지 않았으나, B16 멜라노마를 이용한 멜라닌 생성 실험에서는 hexane 분획물과 ethyl acetate 분획물에서 억제 효과를 보였다. 세포내 멜라닌 생성의 초기 단계에 작용하는 티로시나제 단백질의 활성을 조사한 결과, hexane 분획($IC_{50}$ < $25{\mu}g/mL$)과 ethyl acetate분획($IC_{50}$ < $5{\mu}g/mL$)은 알부틴($IC_{50}{\leq}250{\mu}g/mL$)과 비교 시 더 낮은 농도에서 현저하게 티로시나제 활성을 저해시켰다. 따라서 신선초 추출물의 미백 작용 기전을 규명하기 위하여, 멜라노 사이트의 mitogen으로 작용하는 endothelin-1(ET-1)과 UVB에 의해 생성되어 염증을 매개하는 interleukin-$1{\alpha}$(IL-$1{\alpha})$의 생성량을 측정하였다. Hexane 및 ethyl acetate 분획물은 IL-$1{\alpha}$의 생성에 영향을 끼치지 못했으나, 표피세포에서 UVB에 의해 생성된 ET-1을 농도에 따라 감소시킴으로써 멜라노사이트의 melanogenesis를 저해하는 것으로 확인되었다. 따라서 신선초 추출물은 미백 효능을 갖는 화장품 소재로써 사용 가능하리라 판단된다.
신선초 추출물 및 그의 분획물의 미백 효과를 알아보기 위하여, B16 멜라노마와 정상 사람 표피 세포를 이용하여 멜라닌 생성에 관련된 다양한 실험을 실시하였다. 70% ethanol 용매로 추출한 신선초 추출물을 연속적으로 분획하여 hexane, ethyl acetate, n-butanol, 물 분획물을 얻었다. 버섯 티로시나제 활성 실험에서 신선초 추출물 및 그의 분획물은 저해 효과를 보이지 않았으나, B16 멜라노마를 이용한 멜라닌 생성 실험에서는 hexane 분획물과 ethyl acetate 분획물에서 억제 효과를 보였다. 세포내 멜라닌 생성의 초기 단계에 작용하는 티로시나제 단백질의 활성을 조사한 결과, hexane 분획($IC_{50}$ < $25{\mu}g/mL$)과 ethyl acetate분획($IC_{50}$ < $5{\mu}g/mL$)은 알부틴($IC_{50}{\leq}250{\mu}g/mL$)과 비교 시 더 낮은 농도에서 현저하게 티로시나제 활성을 저해시켰다. 따라서 신선초 추출물의 미백 작용 기전을 규명하기 위하여, 멜라노 사이트의 mitogen으로 작용하는 endothelin-1(ET-1)과 UVB에 의해 생성되어 염증을 매개하는 interleukin-$1{\alpha}$(IL-$1{\alpha})$의 생성량을 측정하였다. Hexane 및 ethyl acetate 분획물은 IL-$1{\alpha}$의 생성에 영향을 끼치지 못했으나, 표피세포에서 UVB에 의해 생성된 ET-1을 농도에 따라 감소시킴으로써 멜라노사이트의 melanogenesis를 저해하는 것으로 확인되었다. 따라서 신선초 추출물은 미백 효능을 갖는 화장품 소재로써 사용 가능하리라 판단된다.
In order to investigate the potential of a Angelica keiskei Koidzumi extract and its fractions as an active ingredient for whitening cosmetics, we prepared Angelica keiskei Koidzumi extract(70% ethanol), and the aqueous suspension was successively extracted with hexane, ethyl acetate(EA), and n-buta...
In order to investigate the potential of a Angelica keiskei Koidzumi extract and its fractions as an active ingredient for whitening cosmetics, we prepared Angelica keiskei Koidzumi extract(70% ethanol), and the aqueous suspension was successively extracted with hexane, ethyl acetate(EA), and n-butanol fraction. We measured their inhibitory effects on mushroom tyrosinase and melanin synthesis in B16 melanoma cells and normal human kerationocytes in vitro. They did not show inhibitory activity against mushroom tyrosinase and the melanin synthesis except hexane and EA fractions. Hexane and EA fractions markedly inhibited cellular tyrosinase activity at a lower concentration(25 and 5 ${\mu}g/mL$, respectively) than arbutin(250 ${\mu}g/mL$). We also quantified the released amount of endothelin-1(ET-1), a mitogen of melanocyte, and interleukin-$1{\alpha}$(IL-$1{\alpha})$, a mediator of UVB-induced inflammation. Hexane and EA fractions did not affect IL-$1{\alpha}$ production, but they decreased UVB-induced ET-1 production in normal human keratinocytes in a dose dependant manner. As a result, hexane and EA fractions could inhibit the melanogenesis through the inhibition of UVB-induced ET-1 production in normal human keratinocytes. This result suggests that hexane and EA fractions of Angelica keiskei Koidzumi extract could be used as an active ingredient for cosmetics.
In order to investigate the potential of a Angelica keiskei Koidzumi extract and its fractions as an active ingredient for whitening cosmetics, we prepared Angelica keiskei Koidzumi extract(70% ethanol), and the aqueous suspension was successively extracted with hexane, ethyl acetate(EA), and n-butanol fraction. We measured their inhibitory effects on mushroom tyrosinase and melanin synthesis in B16 melanoma cells and normal human kerationocytes in vitro. They did not show inhibitory activity against mushroom tyrosinase and the melanin synthesis except hexane and EA fractions. Hexane and EA fractions markedly inhibited cellular tyrosinase activity at a lower concentration(25 and 5 ${\mu}g/mL$, respectively) than arbutin(250 ${\mu}g/mL$). We also quantified the released amount of endothelin-1(ET-1), a mitogen of melanocyte, and interleukin-$1{\alpha}$(IL-$1{\alpha})$, a mediator of UVB-induced inflammation. Hexane and EA fractions did not affect IL-$1{\alpha}$ production, but they decreased UVB-induced ET-1 production in normal human keratinocytes in a dose dependant manner. As a result, hexane and EA fractions could inhibit the melanogenesis through the inhibition of UVB-induced ET-1 production in normal human keratinocytes. This result suggests that hexane and EA fractions of Angelica keiskei Koidzumi extract could be used as an active ingredient for cosmetics.
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문제 정의
이러한 일련의 과정 중에 신선초 추출물이 버섯 티로시나제를 저해하지 않으면서, B16-멜라노마 세포에서는 멜라닌 생성을 저해하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 연구에서는 신선초 추출물이 UVB에 의해 피부 표피 세포에서 분비되는 멜라노사이트의 성장인자 및 멜라닌 생성 촉진 인자를 감소시킴으로써 피부 미백 효과를 나타낼 수 있을 것이라 가정하여 미백에 관련된 일련의 실험을 진행하고 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
48 h 동안 배양 후 배지를 수거하여 IL-1α 및 ET-1의 분비량 측정 실험에 사용하였다.
B16 멜라노마를 100 mm dish에 5 × 105 cell/well로 분주하여 1일 후 10 % FBS가 함유된 DMEM으로 갈아주면서 시료를 농도별로 첨가하였다.
B16 멜라노마를 이용한 멜라닌생합성저해 효과는 Maeda와 Fukuda[21]의 방법을 변형하여 측정하였다. 멜라닌 생성량과 세포수를 동시에 측정하기 위하여 두세트를 준비하였으며 모든 농도에 따른 웰 수는 3배수로 준비하였다.
Endogen사의 사람 IL-1α ELISA 키트와 IBL (Immuno-Biological Laboratories, Japan)사의 ET-1 키트를 사용하였으며, 방법은 키트의 매뉴얼에 따라 실시하여 ELISA reader로450 nm에서 측정하였다.
B16 멜라노마 세포는 10 % FBS와 1 %의 항생제를 첨가한 DMEM에 1 × 105의 밀도로 분주하고 하루 동안 5 % CO2, 37℃에서 배양하였다. 그 후 10 % FBS가 첨가된 DMEM으로 갈아준 후 신선초 70 % ethanol 추출물 및 분획물들을 농도별로 배양판에 처리하여 3일 동안 배양하였고. 3일 후 멜라닌 양을 측정할 세트는 1 N NaOH 450 µL를 처리하여 10 min 동안 sonication하였다.
, 37 ℃에서 배양하였다. 그후 Ca2+ 및 Mg2+이 포함되어 있지 않은 HBSS로 두 번헹군 후 HBSS 1 mL 처리 후 UVB 50 mJ/cm2를 조사하였다. UVB 조사 후 HBSS를 버리고 새 배지로 교체하고 시료를 농도별로 처리한 다음 5 % CO2, 37 ℃에서 배양하였다.
멜라닌이 완전히 용해되면 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 수 측정용 세트는 배지를 제거하고 0.25 mg/mL의 3-[4,5-dimethylthiazole- 2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, M5655, Sigma, USA)를 1 mL 처리하여 37 ℃에서 4 h 동안 반응시키고, 그 후 MTT를 제거한 후 dimethylsulfoxide (DMSO)를 2 mL 첨가하여 발색정도를 ELISA reader (Sunrise Tecan, Austria)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
신선초의 hexane 및 EA 분획물의 정상 사람 표피 세포에 대한 세포 독성을 측정하여(Figure. 3) 독성이 없는 범위에서 ET-1 mRNA 발현량, IL-1α 그리고 ET-1 분비량을 RT-PCR 및 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다.
신선초의 분획물이 표피 세포에서 UVB에 의해 유도된 ET-1의 발현을 감소시켜 궁극적으로 멜라노사이트의 멜라닌 생성을 억제시키는 지 알아보기 위해 정상 사람 표피 세포에 UVB 50 mJ/cm2 를 조사하여 RT-PCR 방법으로 ET-1 mRNA 양과 배지로 분비된 ET-1의 양을 측정하였다. Negative control로 사용된 phosphoramidon은 big-ET를 ET로 전환시키는 효소를 저해하는 물질로 세포 배지 내 ET-1 생성량을 줄어들게 하며, 따라서 ET-1 mRNA 발현량에는 영향을 끼치지 않는다.
자외선검출기를 이용하여 260 nm에서 RNA 양을 정량한 후, 역전사 중합 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 실시하였다. 역전사 중합 반응은 올인원 역전사 중합 반응 키트(all-in-one RT-PCR kit; Superbio, Korea)를 사용하였고, 프라이머와 반응 조건은 아래와 같고, 올인원 역전사 중합 반응 키트의 메뉴얼에 따라 실험을 진행하였다.
ET-1 mRNA 발현량을 조사하기 위해 배지 수거 후 세포에 Trizol (Invitrogen, USA) 1 mL을 첨가하여 Invitrogen 사의 RNA 분리법에 따라 RNA를 분리하였다. 자외선검출기를 이용하여 260 nm에서 RNA 양을 정량한 후, 역전사 중합 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 실시하였다. 역전사 중합 반응은 올인원 역전사 중합 반응 키트(all-in-one RT-PCR kit; Superbio, Korea)를 사용하였고, 프라이머와 반응 조건은 아래와 같고, 올인원 역전사 중합 반응 키트의 메뉴얼에 따라 실험을 진행하였다.
쥐 유래의 암세포주인 B16 멜라노마를 이용한 멜라닌 생합성량을 Maeda와 Fukuda[21]의 방법을 변형하여 측정하였다. 신선초 추출물 및 각 분획물 중에서 hexane 및 EA 분획물을 제외한 나머지, 즉 신선초 추출물, n-butanol 그리고 물 분획물은 멜라닌 생합성량에 영향을 주지 못했다(데이타 생략).
대상 데이터
Hank’s balanced salt solution (HBSS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, high glucose), keratinocyte-serum free medium (K-SFM), fetal bovine serum (FBS)과 trypsin-EDTA 용액은 GIBCO (USA)의 것을 사용하였다.
Hank’s balanced salt solution (HBSS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, high glucose), keratinocyte-serum free medium (K-SFM), fetal bovine serum (FBS)과 trypsin-EDTA 용액은 GIBCO (USA)의 것을 사용하였다. 그 외의 시약은 모두 특급으로 사용하였으며 활성실험에 사용된 시약들은 Sigma-Aldrich (USA)사의 것을 구입하여 사용하였다.
신선초는 국내산(경동시장)을 사용하였고, B16 멜라노마는 ATCC (American type cell collection, USA)에서 구입하였다. 정상 사람 표피 세포는 연구용으로 사용에 대한 부모의 동의를 받은 신생아의 표피로부터 분리하였으며, 4번의 계대를 거친 세포를 실험에 사용하였다.
이론/모형
단백질은 BCA 방법(Sigma, USA)에 따라 562 nm에서 흡광도로 정량하였다. ET-1 mRNA 발현량을 조사하기 위해 배지 수거 후 세포에 Trizol (Invitrogen, USA) 1 mL을 첨가하여 Invitrogen 사의 RNA 분리법에 따라 RNA를 분리하였다. 자외선검출기를 이용하여 260 nm에서 RNA 양을 정량한 후, 역전사 중합 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 실시하였다.
3 mL을 첨가하여 37 ℃에서 1 h 동안 반응시켜 ELISA reader로 470 nm에서 흡광도를 측정하였다[22]. 단백질은 BCA 방법(Sigma, USA)에 따라 562 nm에서 흡광도로 정량하였다.
티로시나제의 저해활성은 일반적으로 분광학적인 방법으로 측정되어지며 본 실험에서는 A. Vanni and D. Gastaldi의 방법에 따라 측정하였다[20]. 0.
성능/효과
두 분획물 모두 알부틴보다 낮은 농도에서 즉, hexane 분획물은 75 µg/mL에서, EA 분획물은 30 µg/mL에서 IC50을 넘었으며, 특히 EA 분획물의 효과가 뛰어나다.
따라서, 신선초 hexane 분획과 EA 분획은 멜라닌 생합성 과정의 upstream에 작용하는 티로시나제 단백질의 활성을 저해함으로써, downstream으로의 진행을 저지하여 B16 멜라노마의 멜라닌 합성 억제 효과에 직접적으로 관여하는 것으로 사료된다.
신선초 추출물 및 각 분획물의 버섯 티로시나제 활성저해 효과를 측정한 결과, 최고 농도 400 µg/mL에서 저해 효과를 보이지 않았다(데이타 생략).
이 결과로 신선초 추출물의 hexane 및 EA 분획물에 의한 ET-1 생성량의 감소 효과가 IL-1α 생성량 감소에 의한 것이 아니라, 또 다른 경로 차단에 의한 효과임을 알 수 있다.
본 연구진은 제주도의 천연자원으로부터 기능성 화장품 소재로써 사용가능한 새로운 원료를 개발하기 위하여 천연식물을 대상으로 in vitro 실험으로 검색을 수행하여 왔고 그 결과를 일부 보고한 바 있다[19]. 이러한 일련의 과정 중에 신선초 추출물이 버섯 티로시나제를 저해하지 않으면서, B16-멜라노마 세포에서는 멜라닌 생성을 저해하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 연구에서는 신선초 추출물이 UVB에 의해 피부 표피 세포에서 분비되는 멜라노사이트의 성장인자 및 멜라닌 생성 촉진 인자를 감소시킴으로써 피부 미백 효과를 나타낼 수 있을 것이라 가정하여 미백에 관련된 일련의 실험을 진행하고 그 결과를 보고하고자 한다.
정상 사람 표피 세포에서 UVB에 의해 유도된 ET-1유전자 발현과 ET-1 및 IL-1α의 단백질 생성량에 대한 신선초 추출물의 hexane 및 EA 분획물의 영향을 조사한 결과, hexane 및 EA 분획물은 IL-1α의 생성량은 감소시키지 못했으나, ET-1 유전자 발현 및 단백질 생성량을 감소시킴을 알 수 있었다.
후속연구
이상의 결과에서 신선초 추출물은 색소침착의 방지와 개선에 효과 있는 원료로써 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 본 연구에서 구명하지 못했던 hexane 및 EA 분획물의 유효 성분에 대한 분리가 진행되어야 하며, 분리된 유효성분들의 작용 기작을 밝혀내기 위하여 유전자 수준에서의 연구가 필요하다.
이상의 결과에서 신선초 추출물은 색소침착의 방지와 개선에 효과 있는 원료로써 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 본 연구에서 구명하지 못했던 hexane 및 EA 분획물의 유효 성분에 대한 분리가 진행되어야 하며, 분리된 유효성분들의 작용 기작을 밝혀내기 위하여 유전자 수준에서의 연구가 필요하다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
우리나라에서 신선초는 어떤 효능이 있다고 알려졌는가?
5 ∼ 1 m의 다년생초로 일본의 팔장도에서 자생하는 것으로 아시다바(Ashidaba, 명일엽)라고 불린다[1]. 우리나라에서는 선남초, 신립초로도 불리며 고혈압, 간장병, 신경통 등 각종 성인병에 효과가 있다고 하며, 녹즙으로 많이 음용되고 있다[2,3]. 신선초의 영양 성분을 보면, 플라보노이드, 쿠마린, 사포닌, 각종 유기산 및 무기질 등이 함유되어 있으며, 불포화 지방산과 비타민의 함량이 높다.
신선초는 무엇인가?
신선초(Angelica keiskei Koidzumi)는 미나리과에 속하는 높이 0.5 ∼ 1 m의 다년생초로 일본의 팔장도에서 자생하는 것으로 아시다바(Ashidaba, 명일엽)라고 불린다[1]. 우리나라에서는 선남초, 신립초로도 불리며 고혈압, 간장병, 신경통 등 각종 성인병에 효과가 있다고 하며, 녹즙으로 많이 음용되고 있다[2,3].
연구를 통해 분리된 신선초 뿌리의 생리활성 물질에는 어떤 것들이 있는가?
신선초 뿌리에서 분리된 생리 활성 물질들로는, angular furanocoumarin의 일종인 archangelicin과 8(S), 9(R)-9-angeloyloxy-8,9-dihydrooroselol이, linear furanocoumarin으로는 psoralen, bergapten, 그리고 xanthotoxin이, chalcone으로는 4-hydroxyderricin, xanthoangelol, 그리고 ashitaba-chalcone이 있다[6]. 이들 중 4-hydroxyderricin과 xanthoangelol은 쥐에 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)와 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)로 피부암을 유도했을 때, 종양 형성을 저해하는 효과를 보였으며[6], 그램 양성 박테리아에 대한 성장 억제 효과를 나타냈다[7].
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