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문제 정의
- 본 연구에서는 꾸지뽕잎으로 제조한 덖음차와 발효차의 항당뇨 효고}를 비교하기 위하여 ethanol 추출물의 a잉ucosidxe 저해 활성과 streptozotocin 으로 유발한 당뇨쥐를 이용한 내 당 능과 혈당 감소 및 혈청지질 함량에 미치는 영향을 조사하였다.
가설 설정
- 2) Values are mean±SD of 7 rats. Different superscripts within a column(a, b) indicate significant differences(p<0.
- 2) Feed efficiency ratio; daily weight gain/daily feed intake. 3)Values are mean±SD of 7 rats. Different superscripts within a co- lumn(a~'C)indicate significant differences0?<O.
- 4) Values are means士SD of 7 rats. Different superscripts within a row(a ~ c) indicate significant differences(p<0.
제안 방법
- 경구 내당능 검사는 5주령의 평균 체중이 140±10 g인 Spra- gue-Dawly계 male rats(Orient Ltd., Sungnamsi, Korea)를 1 주일 간 환경에 적응시킨 후 당뇨대조군(50% glucose 용액 투여군), DM-P군(50% glucose 용액과 덖음 꾸지뽕잎의 70% ethanol 추출물 투여), DM-F군(50% glucose 용액과 발효 꾸지뽕잎의 70% ethanol 추출물 투여)의 3군으로 나누었으며, DM 군은 50% glucose 용액을 체중 100 g당 0.2 으에 해당하는 양을 경구 투여하고, DM-P군 및 DM-F군은 체중 100 g당 0.2 g에 해당하는 각 추출물 투여 30분 후에 50% 이ucose 용액을 경구투여 투여하였다. 혈당은 포도당 경구투여 전 30분 및 투여 후 30, 60, 120, 180, 240, 360분 후에 꼬리 부위 혈관에서 란셋으로 채혈하여 Gluco-Tester(Life Scan Inc.
- 꾸지 뽕잎으로 제 조한 덖 음차(PM)와 발효차(FM)의 a-glucosidase 저해활성과 경구 내당성 및 stereptozotocin(STZ)으로 유발한 고혈당 쥐의 혈당, fructosamine 및 혈청 지질 함량에 미치는 영향을 조사하였다. 70% ethanol 추출물(20 mg/ mL)의 a-glucosidase 저 해 활성 은 FM 92.
- 뽕잎 에 함유된 deoxynojirimycine a-glucosidase의 활성을 저해시킴으로써 혈당 강하 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Chae et al 2003, Kim et al 1999). 꾸지 뽕잎차에서도 tfglucosidase 저해활성이 나타나는지를 조사하기 위하여 건조한 생꾸지뽕잎과 덖음 꾸지뽕잎차 및 발효 꼬지뽕잎차의 ethanol 추출물에 대한 저해 활성을 조사하였다(Fig. 1). a-Glucosidase 저해 활성은 모든 시료의 70% ethanol 추출물에서 비교적 높은 저해 활성이 나타났으며, 첨가 농도가 높아질 수록저해 활성도 병행하여 높아지는 경향을 나타내었다.
- 꾸지뽕잎차의 식이가 당뇨 유발 흰쥐의 체중 증가량, 식이 섭취량, 식이효율 및 음용수 섭취량에 미치는 영향을 조사 하기 위하여 NC, DM, DM-P 및 DM-F 군으로 구분하여 5주간 사육한 결과는 Table 2와 같다. DM-P 및 DM-F군의 1일 체중 증가량은 NC군에는 미치지 못하나, DM군에 비하여는 유의적으로 높았으며, 식이 섭취량과 음용수 섭취량도 DM 군에 비하여 감소하였고, 식이효율도 DM군에 비하여 다소 개선되는 경향을 보였다.
- 덖음 꾸지 뽕잎 차의 제조는 덖음녹차 제조공정(Park et al 2006) 에준하여 생잎 2 kg을 차온계(TA-0510F, Minolta Co, Japan)로 230℃로 조정한 무쇠솥(이 64x28 cm)에 넣어 230℃ — 150 ℃ — 110℃ — 100℃ ■— 80℃로 온도를 변화시키면서 5회 덖음 하였다. 덖음 중 비빔시간은 10분으로 조정하였다.
- 96%였다. 실험 동물은 5주령의 평균 체중이 140±10 g인 Sprague-Dawly계 SPF/VAF outbred rats(Orient Ltd., Sung- namsi, Korea)를 1 주일간 환경에 적응시킨 후 정상대조군 (NC), 당뇨대조군(DM), 당뇨유발 후 덖음 꾸지뽕잎 분말을 3% 되게 첨가한 식이군(DM-P), 당뇨 유발 후 발효 꾸지 뽕잎 분말을 3% 되게 첨가한 식이군(DM-F) 등 4군으로 나누어 각각 7마리씩으로 하여 당뇨를 유발시킨 후 실험식이로 5주간 사육하였다. 사육장은 stainless steel cage를 사용하고, 온도 및 습도는 23±2℃, 60±5%로 조정하고, 명암주기는 12시간 간격으로 설정하고, 물과 사료의 섭취는 자유 섭취시켰다.
- 실험식이로 5주간 사육한 흰쥐를 물만 주고 12시간 동안 절식시킨 후 ether 마취 하에서 복부 대동맥으로부터 채혈한 다음, 빙냉의 생리식염수로 간을 관류하고 장기를 적출한 후습기를 제거하여 무게를 측정하였다. 채취한 혈액은 실온에서 응고시킨 다음 3, 000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후 -70 ℃ 에 두면서 분석용 시료로 사용하였다.
- 체중, 식이 및 음용수 섭취량은 전 실험 기간을 통하여 매일 일정한 시간에 즉정하였다. 식 이효율(feed efficiency ratio, FER)은 같은 기간 동안의 증체량을 동일 기간의 식이 섭취량으로 나눈 값으로 하였다.
- 혈당은 Gluco-TesteifLife Scan Inc., USA)로 매일 오전 10~ 12시에 측정하였으며, 공복 시의 꼬리 부위 혈관에서 란셋으로 채혈하였다.
- 2 g에 해당하는 각 추출물 투여 30분 후에 50% 이ucose 용액을 경구투여 투여하였다. 혈당은 포도당 경구투여 전 30분 및 투여 후 30, 60, 120, 180, 240, 360분 후에 꼬리 부위 혈관에서 란셋으로 채혈하여 Gluco-Tester(Life Scan Inc., USA) 로측정하였다.
대상 데이터
- 꾸지뽕잎차는 덖음과 발효로 구분하여 제조하였다. 덖음 꾸지 뽕잎 차의 제조는 덖음녹차 제조공정(Park et al 2006) 에준하여 생잎 2 kg을 차온계(TA-0510F, Minolta Co, Japan)로 230℃로 조정한 무쇠솥(이 64x28 cm)에 넣어 230℃ — 150 ℃ — 110℃ — 100℃ ■— 80℃로 온도를 변화시키면서 5회 덖음 하였다.
- 실험에 사용한 꾸지뽕(Cudrcmia tricuspidatd) 잎은 대전광역시 서구 괴곡동에서 재배한 것으로 2007년 4월에 첫 번째로 채취한 잎을 (주)해인우리에서 공급받아 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 분석은 3회 반복으로 행하였으며, 실험 동물 7마리에 대한평균치와 표준편차로 나타내었다. 유의성 검증은 SPSS (Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc.
- 표준편차로 나타내었다. 유의성 검증은 SPSS (Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, Ⅱ., USA) software package progranr을 이용하여 Duncan's multiple range test를 행하였다.
이론/모형
- tf-Glucosidase 저해 활성 측정은 Xu 등(2007)의 방법에 준하여 67 mM KP buffer(pH 6.8) 0.69 mL에 70% ethanc>l로 추출한 꾸지뽕잎차 추출액 25 유L 및 ff-glucosidase(0.1 unit/ mL, Sigma Chem. Co. Mo, USA) 20 /zL를 가하고 37℃에서 3 분간 preincubation한 다음 10 mM p-nitrophenyl- a -D-glu- copyranoside 65 유 L를 가하여 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후 0.
- 실험 식이는 AIN-76 diet(Teklad, USA)를 기본으로 하여 조제하였다. 실험군에 따른 식이 조성은 Table 1과 같다.
- 혈청의 단백질 함량은 bovine serum albumin(BSA)을 표준용액으로 하여 Lowry법(Lowory et al 1951)으로 측정하였다.
성능/효과
- 1) Abbreviations: NC; normal control, DM; diabetic control, DM-P; diet with 3% pan-fired leaves tea after diataic induction, DM-F; diet with 3% fbmiented leaves tea after diabetic induction. 2) Feed efficiency ratio; daily weight gain/daily feed intake.
- 1)Abbreviations: NC; normal control, DM; diabetic control, DM-P; diet with 3% pan-fired leaves tea after diabetic induction, DM-F; diet with 3% fermented leaves tea after diabetic induction.
- 위하여 NC, DM, DM-P 및 DM-F 군으로 구분하여 5주간 사육한 결과는 Table 2와 같다. DM-P 및 DM-F군의 1일 체중 증가량은 NC군에는 미치지 못하나, DM군에 비하여는 유의적으로 높았으며, 식이 섭취량과 음용수 섭취량도 DM 군에 비하여 감소하였고, 식이효율도 DM군에 비하여 다소 개선되는 경향을 보였다. STZ는 췌장 내 日-세포를 선택적으로 파괴함으로써 insulin의 합성이 저하되며, 이로 인해 초래되는 당 대사의 불균형, 체지방의 과잉 분해 및 체단백의 지속적인 소실은 체중 감소(Odaka & Matsuo 1992)와 당뇨의 대표적인 현상인 다식, 다음, 다뇨의 3다 현상이 나타난다 (Park et al 2002).
- 4%가 감소하였다. HDL-cholesterol 함량은 DM군이 52.54 mg/dL로 NC군의 77.75 mg/dL에 비해 유의적으로 감소하였으며, DM-P 및 DM-F군은 각각 63.33 및 65.59 mg/dL로 NC군에 수준에 미치지는 못하나, DM군에 비해 각각 20.54 및 24.84%가 증가하였다. LDL-cholesterol 함량은 HDL-cholesterol 함량과 반대로 DM군이 89.
- 84%가 증가하였다. LDL-cholesterol 함량은 HDL-cholesterol 함량과 반대로 DM군이 89.80 mg/dL로 NC 군의 39.16 mg/dL에 비해 유의적으로 증가하였으나, DM-P군 59.41 mg/dL, DM-F군 55.28 mg/dL로 DM군에 비해 각각 33.8 및 38.4% 감소하였다. 동맥경화지수는 DM-P와 DM-F 군에서 유의적으로 낮았으나, DM-P와 DM-F간의 유의차는 없었다.
- 14%가 감소하였다. Total cholesterol 함량은 DM군이 176.25 mg/dL로 NC군의 133.04 mg/dL에 비해 유의적으로 증가하였으나, DM-P군은 148.22 mg/dL, DM-F군은 145.58 mg/mL로 DM군에 비해각각 15.9 및 17.4%가 감소하였다. HDL-cholesterol 함량은 DM군이 52.
- 조사한 결과는 Table 4와 같다. Triglyceride 함량은 DM 군이 169.56 mg/dL로 NC군의 80.59 mg/dL에 비해 약 2.1 배 증가하였으나 DM-P 및 DM-F군은 127.40 mg/dL와 123.55 mg/dL로 DM군에 비해 각각 24.86%와 27.14%가 감소하였다. Total cholesterol 함량은 DM군이 176.
- 1). a-Glucosidase 저해 활성은 모든 시료의 70% ethanol 추출물에서 비교적 높은 저해 활성이 나타났으며, 첨가 농도가 높아질 수록저해 활성도 병행하여 높아지는 경향을 나타내었다. 추출물의 농도가 20 mg/mL일 때의 저해 활성은 RT 69.
- 당뇨 유발 후 실험식이로 5주간 사육한 흰쥐의 체중 100 유당의 장기중량을 비교해 본 결과(Table 3), 당뇨유발군(DM, DM-P, DM- F)은 NC군에 비해 간장, 신장 및 심장의 중량이 유의적으로 증가하였다. 각 당뇨군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았으나, DM군에 비하여 DM-P 및 DM-F군은 모든 장기의 중량이 낮은 값을 나타내어 당뇨로 인한 장기의 비대현상이 다소 완화되었다.
- 1%였다. 경구 내당성을 조사한 결과, 고혈당 대조군은 360분까지 혈당의 감소가 없었으나 PM 및 FM을 투여한 군에서는 투여 후 60분부터 감소하여 120분 후에는 정상군 수준으로 회복되었다. 당뇨 유발 후 동결 건조한 차분말을 3% 혼합한 식이로 5주간 사육한 결과, PM 및 FM 투여군은 고혈당 대조군에 비하여 다음과 같은 효과가 있었다.
- Heaton KW 1973, Seyer-Hansen K 1973). 당뇨 유발 후 실험식이로 5주간 사육한 흰쥐의 체중 100 유당의 장기중량을 비교해 본 결과(Table 3), 당뇨유발군(DM, DM-P, DM- F)은 NC군에 비해 간장, 신장 및 심장의 중량이 유의적으로 증가하였다. 각 당뇨군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았으나, DM군에 비하여 DM-P 및 DM-F군은 모든 장기의 중량이 낮은 값을 나타내어 당뇨로 인한 장기의 비대현상이 다소 완화되었다.
- 그러나 혈중 glycohemoglobin의 수준을 평가하는 것은 hemoglo- bin의 life cycle이 약 3개월 정도가 되므로 6주 이전의 혈당조절을 반영(Demetrious JA 1978)하는 반면 혈청 fructosamine 은 2~3주의 혈당 조절 정도를 반영한다(Kaplan et al 1988, Jones et al 1983). 본 실험의 식이기간이 5주인 점을 고려하여 혈청 fructosamine을 측정하였을 때 꾸지뽕 추출물 투여군 모두에서 혈당 감소와 유사하게 나타나고 있어 항당뇨 효과에기인된 것으로 생각되나, 꾸지뽕 추출물이 당화 단백질의 생성을 직접적으로 저해하여 나타난 가능성을 배재할 수 없다.
- 이러한 결과는 Hong 등(2002)이 당뇨쥐의 혈청 지질조성에 미치는 YK-209 뽕잎의 영향을 조사한 결과와 Kim 등 (1998b)이 고콜레스테롤 식이를 급여한 흰쥐의 혈청 지질 조성에 미치는 뽕잎 methanol 추출물의 영향을 조사한 결과와 유사하다. 이상의 결과들로 미루어 볼 때, 꾸지뽕잎차의 식이가 STZ로 유발한 당뇨쥐의 혈청 지질 조성을 개선하는 효과 있는 것으로 생각되며, 이는 뽕잎에 함유된 quercetin, kaempferol, chlorogenic acid, arthocarpesin, caffeic acid 등 polyph- nol계 화합물(Kim et al 1998a)과 관련이 있는 것으로 생각된다.
- 당뇨 유발 후 동결 건조한 차분말을 3% 혼합한 식이로 5주간 사육한 결과, PM 및 FM 투여군은 고혈당 대조군에 비하여 다음과 같은 효과가 있었다. 체중 증가량, 식이효율은 유의적으로 높았으며, 식이 및 음용수 섭취량은 각각 12.9-16.9% 및 6.8~10.1%가 감소하였다. 혈당과 fructosamine 함량은 각각 27.
- a-Glucosidase 저해 활성은 모든 시료의 70% ethanol 추출물에서 비교적 높은 저해 활성이 나타났으며, 첨가 농도가 높아질 수록저해 활성도 병행하여 높아지는 경향을 나타내었다. 추출물의 농도가 20 mg/mL일 때의 저해 활성은 RT 69.1%, PT 54.6 %, FT 92.5%로 발효차가 생 잎이나 덖음차보다 높았으며 덖음차는 생잎보다 낮은 저해활성을 나타내었다.
- 한편, 꾸지뽕잎차의 70% ethanol 추출물이 나당능에 미치는 영향을 조사한 결과(Fig. 1), DM군에서는 360분까지 혈당이 400 mg/dL이상으로 당 부하가 지속되었으나, DM-P 및 DM-F군에서는 60분 이후부터 혈당이 감소하기 시작하여 180 분 후에는 투여 전의 수준으로 감소하였다. 내당능은 췌장의 내분비 기능을 진단하는 한 방법(Kim et al 1999)으로 당을부하시킨 후 일정시간 동안에 정상혈당을 회복하는 능력을 확인하는 것으로 덖음차와 발효차 모두 내당능이 높음을 나타내며, 발효차가 덖음차에 비하여 다소 높은 내당능을 나타내었다.
- 이러한 결과는 Yoo와 Rhee(2002)의 당뇨 쥐에 YK-209 뽕잎 분말을 첨가한 식이로 3주간 급여하였을 때의 혈당 감소율 22~25%와 비교하여 대등하거나 다소 높은 혈당 감소율을 나타내었다. 혈청 fructosamine 함량(스OD/ mL of serum)도 NC군에서는 0.07이었으나, DM군에서는 0.15로 크게 증가한 반면, DM-P 및 DM-F군에서는 각각 0.14 및 0.12로 DM군에 비해 6.7 및 20.0%가 감소하였다.
- 0%가 감소하였다. 혈청중성지질, total cholesterol 및 LDL- cholesterol 함량은 각각 24.9-27.1%, 15.9-17.4% 및 33.8- 38.4% 감소하였다. HDL-cholesterol함량은 20.
후속연구
- 이러한 효과는 PM보다 FM이 다소 양호하였다. 이 상의 결과, 꾸지 뽕잎차의 항당뇨 효과는 a-glucosidase 저해 활성과 더불어 고혈당에 기인된 혈청 지질의 변화를 저해함으로써 나타난 것으로 생각되나 보다 구체적인 mechanism 에 대하여 앞으로의 연구가 요망된다.
- 이상의 모든 실험 결과들을 종합해 볼 때, 발효 꾸지 뽕잎 차와 덖음 꾸지뽕잎차의 첨가 식이에 의해 STZ로 유발시킨당뇨흰쥐에서의 혈당 감소의 정확한 기전은 알 수가 없으나, 발효 꾸지뽕잎차와 덖음 꾸지뽕잎차에 함유된 항 당뇨 성분 및 항산화 성분에 의해 혈당 저하와 더불어 당화 단백의 생성감소 혹은 억제를 통하여 고혈당에 의해 나타날 수 있는 합병증 관련 조직 손상의 경감 혹은 예방을 위한 새로운 항당뇨 건강 기능성 식품 및 의약품 개발을 위한 기초 자료를 제시할 수 있을 것으로 생각되며, 항당뇨 및 항산화 성분과 기전 구명을 위한 계속적인 연구를 계획하고 있다.
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