본 연구에서는 구절초의 항염증 효과를 탐색하기 위해 NO의 함량과 iNOS의 발현 및 PGE2와 COX-2의 발현을 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 macrophage cell을 이용하여 실험하였다. 연구 결과 구절초 꽃 추출물은 NO 함량을 농도 의존적으로 감소시키는 경향을 나타냈으며 유의한 차이를 보였다. 또한 세포독성은 꽃 추출물(5～50 μg/mL)은 최고 농도인 50 μg/mL에서 약 20%의 독성을 나타냈으며 그 이하의 농도에서는 독성을 나타내지 않았다. NO 생성의 억제는 iNOS의 단백질과 mRNA의 발현을 농도 의존적으로 저해하였으며 유의성 있는 차이를 나타내었다. 이 결과로 구절초 꽃 추출물이 전사단계에서 저해 활성을 나타낸다는 것을 보여주었다. 그러나 PGE2와 COX-2의 발현 억제 효과는 나타나지 않았으며, 이 결과 구절초 꽃 추출물에 의한 COX-2 단백질의 발현 억제와 PGE2 생성 억제는 유의성이 없는 것으로 나타났다. 본 연구 결과, 구절초 추출물은 염증을 일으키는 중요 인자인 NO를 저해하였고, iNOS의 발현, iNOS의 mRNA 발현 등 항염증에 우수한 효과를 보였으며, 항염증 연구의 기초 자료로 활용될 것으로 예상된다. 또한 추후 산업적 응용도 가능하므로 지속적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 구절초의 항염증 효과를 탐색하기 위해 NO의 함량과 iNOS의 발현 및 PGE2와 COX-2의 발현을 LPS로 염증을 유도한 RAW 264.7 macrophage cell을 이용하여 실험하였다. 연구 결과 구절초 꽃 추출물은 NO 함량을 농도 의존적으로 감소시키는 경향을 나타냈으며 유의한 차이를 보였다. 또한 세포독성은 꽃 추출물(5～50 μg/mL)은 최고 농도인 50 μg/mL에서 약 20%의 독성을 나타냈으며 그 이하의 농도에서는 독성을 나타내지 않았다. NO 생성의 억제는 iNOS의 단백질과 mRNA의 발현을 농도 의존적으로 저해하였으며 유의성 있는 차이를 나타내었다. 이 결과로 구절초 꽃 추출물이 전사단계에서 저해 활성을 나타낸다는 것을 보여주었다. 그러나 PGE2와 COX-2의 발현 억제 효과는 나타나지 않았으며, 이 결과 구절초 꽃 추출물에 의한 COX-2 단백질의 발현 억제와 PGE2 생성 억제는 유의성이 없는 것으로 나타났다. 본 연구 결과, 구절초 추출물은 염증을 일으키는 중요 인자인 NO를 저해하였고, iNOS의 발현, iNOS의 mRNA 발현 등 항염증에 우수한 효과를 보였으며, 항염증 연구의 기초 자료로 활용될 것으로 예상된다. 또한 추후 산업적 응용도 가능하므로 지속적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
In this study, we investigated the effect of C. zawadskii extract on nitric oxide (NO) production, prostaglandin E2 (PGE2) production, protein and mRNA expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in LPS-induced RAW 264.7 macrophage cells. C. zawadskii extract (5~50 μg/mL) significantly inhi...
In this study, we investigated the effect of C. zawadskii extract on nitric oxide (NO) production, prostaglandin E2 (PGE2) production, protein and mRNA expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in LPS-induced RAW 264.7 macrophage cells. C. zawadskii extract (5~50 μg/mL) significantly inhibited LPS-induced NO production in a concentration-dependent manner ranging from 23.3% to 100%. Consistent with the inhibitory effect on NO production, C. zawadskii extract inhibited the protein expression and mRNA expression of iNOS. Although flower extracts of C. zawadskii was not effective on the expression of PGE2 and COX-2, flower extracts of C. zawadskii, however, showed a strong anti-inflammatory activity through inhibition of NO production and iNOS expression. The present results suggest that C. zawadskii extract has an inhibitory effect on NO production, and thus can be used as an anti-inflammatory agent.
In this study, we investigated the effect of C. zawadskii extract on nitric oxide (NO) production, prostaglandin E2 (PGE2) production, protein and mRNA expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in LPS-induced RAW 264.7 macrophage cells. C. zawadskii extract (5~50 μg/mL) significantly inhibited LPS-induced NO production in a concentration-dependent manner ranging from 23.3% to 100%. Consistent with the inhibitory effect on NO production, C. zawadskii extract inhibited the protein expression and mRNA expression of iNOS. Although flower extracts of C. zawadskii was not effective on the expression of PGE2 and COX-2, flower extracts of C. zawadskii, however, showed a strong anti-inflammatory activity through inhibition of NO production and iNOS expression. The present results suggest that C. zawadskii extract has an inhibitory effect on NO production, and thus can be used as an anti-inflammatory agent.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 PGE2의 억제 활성을 측정하였다. 배양액 중에 유리된 PGE2를 측정한 결과는 Fig.
예로부터 구절초의 전초와 꽃이삭은 폐렴, 기관지염 등의 호흡기 질환성 염증, 방광질환, 부인병, 위장병 및 고혈압 등에 사용해 왔다(14-16). 따라서 본 연구에서는 구절초 꽃 추출물의 염증억제 효과를 알아보기 위하여 lipopolysaccharide(LPS)로 염증을 유도한 RAW 264.7 macrophage cell에서 염증 반응의 중요 매개 인자인 NO와 prostaglandin E2(PGE2) 생성에 미치는 영향과 iNOS 와 COX 의 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보았고 또한 iNOS 의 mRNA 의 발현을 연구하여 항염증 효과를 탐색하고 작용기작을 규명하고자 하였다.
제안 방법
일정 량의 상등액을 취해 PGE2 kit(R&D, Minneupolis, MN, USA)를 사용하여 PGE2를 측정하였다(19). Goat anti-mouse Ig가 부착되어 있는 96 well plate에 PGE2 표준액과 구절초 추출물이 처리된 상등액을 가한 후 PGE2-perox-idase conjugate와 mouse anti-PGE2를 각각 50 uL씩 가하고 실온에서 1시간 반응시킨 후 phosphate buffered sal-ine(PBS)로 항체와 결합하지 않은 PGE2 또는 PGE2-per-oxidase conjugate를 제거하였다. 항원-항체 복합체에 TMB (3, 3'-, 5, 5'-tetramethlybenzidine) 용액을 150 uL를 가하고 실온에서 30분 발색시킨 후 1 M H2SO4 100 uL를 가하여 반응을 중단시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
LPS 처리에 의해 활성화되고 신경소교세포에서 생성되어 배양액 중으로 유리된 NO 의 농도를 NO2-의 형태로 Griess 시약을 사용하여 정량하였다. NO2-의 형태로 NO를 측정하는 이유는 NO 는 매우 불안정하여 NO2-의 형태로 바로 전환되기 때문이다(22).
assay를 이용하여 측정하였다(18). RAW 264.7 macrophage 세포를 1.5 x105 cells/well의 농도로 96 well plate 에 분주하고 6시간 후 구절초 꽃 추출물을 농도별(5, 10, 25, 50 ug/mL)로 처리하고 30분 후 LPS 1 ug/mL의 농도로 첨가하여 18시간 배양하였다. 배양 후 MTT 시약을 각 well에 20 yL씩 첨가하고 4시간 동안 37oC incubator에서 반응시 킨 후 MTT 시약이 함유된 배지를 제거하였다.
RAW 264.7 macrophage 세포를 1.5 x105 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하고, 6시간 후 구절초 꽃 추출물을 농도별(5, 10, 25, 50 ug/mL)로 처 리하고 30분 후 LPS(1 ug/ mL)를 첨가하고 18시간 배양하여 NO를 측정하였다. 세포배 양액 100 uL와 Griess시 약 100 uL 동량을 혼합하여 37oC 에서 10분 방치하여 ELISA reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, sodium nitrate로 표준곡선을 작성하여 NO 의 함량을 산출하였다 (17).
RAW 264.7 macrophage 세포를 1.5 x105 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하여 6시간 후 실험에 사용된 구절초 꽃 추출물을 농도별(5, 10, 25, 50 ug/mL)로 처리하고 30 분 후 LPS(1 ug/mL) 로 염증을 유도하고 18시간 배양하였다. 일정 량의 상등액을 취해 PGE2 kit(R&D, Minneupolis, MN, USA)를 사용하여 PGE2를 측정하였다(19).
18시간 배양 후 세포를 PBS 로 cell 을 washing 한 후 pellet 을 얻어 RNeasy mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 얻어진 RNA를 total RNA kit(Invitrogen, Carlsbad, USA)로 정량하였다. RNA(1 冷)을 SuperScript ffl(Invi-trogen)로 cDNA를 합성하여 iQ5 Real-Time PCR(Bio-Rad, Hercules, USA)을 사용해 iNOS의 발현량을 측정하였으며(21), contr이로는 GAPDH를 사용하였다. 사용된 iNOS 의 primer는 sense 5'-accatggagcatcccaagta-3', antisense 5'-ccatgtaccaaccattgaagg-3'이었으며 56oC 에서 annealing 하였고 GAPDH의 primer는 sense 5'-aatgtatccgttgtggatctga-3', antisense 5'-gcttcaccaccttcttgatgt-3'이었으며 56oC 에서 annealing 하였다.
구절초 꽃 추출물이 iNOS 단백질의 생합성을 억제하였으므로 전사단계에 미치는 영향을 알아보기 위하여 real-time PCR를 실행하였다(Fig. 5). LPS를 자극하지 않은 안정한 상태에서의 RAW 264.
또한 Hseu 등(19)의 연구에 의하면 Antrodia camphorata는 100 ug/mL의 농도에서 20% 이상의 세포독성을 나타내었으나 모든 실험에 100 ug/mL의 농도를 사용하였으며, Bae 등(17)의 연구결과 braziline 약 15%의 세포 독성을 보였으며 세포독성이 없다고 판단하였다. 따라서 본 실험에서 구절초 꽃 추출물의 세포 실험에서 약 20%의 세포독성은 유효하다고 생각되어 다음 실험을 진행하였다.
5 x105 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하고, 6시간 후 구절초 꽃 추출물을 농도별(5, 10, 25, 50 ug/mL)로 처 리하고 30분 후 LPS(1 ug/ mL)를 첨가하고 18시간 배양하여 NO를 측정하였다. 세포배 양액 100 uL와 Griess시 약 100 uL 동량을 혼합하여 37oC 에서 10분 방치하여 ELISA reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, sodium nitrate로 표준곡선을 작성하여 NO 의 함량을 산출하였다 (17).
5 x105 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주하여 6시간 후 실험에 사용된 구절초 꽃 추출물을 농도별(5, 10, 25, 50 ug/mL)로 처리하고 30 분 후 LPS(1 ug/mL) 로 염증을 유도하고 18시간 배양하였다. 일정 량의 상등액을 취해 PGE2 kit(R&D, Minneupolis, MN, USA)를 사용하여 PGE2를 측정하였다(19). Goat anti-mouse Ig가 부착되어 있는 96 well plate에 PGE2 표준액과 구절초 추출물이 처리된 상등액을 가한 후 PGE2-perox-idase conjugate와 mouse anti-PGE2를 각각 50 uL씩 가하고 실온에서 1시간 반응시킨 후 phosphate buffered sal-ine(PBS)로 항체와 결합하지 않은 PGE2 또는 PGE2-per-oxidase conjugate를 제거하였다.
대상 데이터
사용하였다. DMEM 배지①ulbecco's modified Eagle's medium)는 Gibco-Life Technologies(Rockville, MD, USA), FBS(fetal bovine serum)는 Hyclone(Logan, UT, USA)에서 구입하였으며, 실험에 사용된 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA) 에서 구입하여 사용하였다.
본 실험에 사용된 구절초는 2008년 충북지역 농가에서 구입하여 사용하였다. DMEM 배지①ulbecco's modified Eagle's medium)는 Gibco-Life Technologies(Rockville, MD, USA), FBS(fetal bovine serum)는 Hyclone(Logan, UT, USA)에서 구입하였으며, 실험에 사용된 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.
실험에 사용된 세포주 RAW 264.7 mouse macrophage는 한국세포주은행 (KCLB, Korean Cell Line Bank)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.
데이터처리
대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석 (ANOVA) 을 행한 후 p<0.01 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였으며, 그 결과는 평균 士 표준편차로 표시하였다.
이론/모형
구절초 꽃 추출물의 세포 독성을 알아보기 위하여 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-ly)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide) assay를 이용하여 측정하였다(18). RAW 264.
초래한다(26). 따라서 과량의 NO를 생성하는 효소인 iNOS 의 생성에 대한 구절초 꽃 추출물의 영향을 확인하기 위하여 western blot을 실행하였다(Fig. 3).
물질이다(29). 따라서 과량의 PGE2를 생성하는 효소인 COX-2 의 생성에 대한 구절초 추출물의 영향을 확인하기 위하여 western blot을 실행하였다(Fig. 4).
성능/효과
NO2-의 형태로 NO를 측정하는 이유는 NO 는 매우 불안정하여 NO2-의 형태로 바로 전환되기 때문이다(22). LPS로 활성화된 NO는 21.9 uM 수준으로 증가하였으며 실험에 사용된 구절초 꽃 추출물을 5, 10, 25, 50 ug/mL 농도에서 농도 의존적인 감소 경향을 나타냈으며 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 구절초 꽃 추출물의 경우 농도별로 16.
Jung 등(21)은 Citrus reticulata 추출물을 real-time PCR을 실시하여 iNOS의 mRNA 양을 측정하였으며, LPS 자극으로 발현량이 증가하였고 추출물이 농도 의존적으로 mRNA 발현량을 감소시키는 경향을 나타내어 본 연구와 비슷한 결과를 나타내었다. Real-time PCR의 실험 결과는 NO 생성 억제와 iNOS 단백질의 발현저해 효과와 마찬가지로 유사한 경향을 나타났으며, 이 결과로 구절초 꽃 추출물이 iNOS 의 전사단계에서 저해 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
증가한 iNOS 단백질의 생합성은 구절초 꽃 추출물의 처리에 의하여 농도 의존적으로 감소하였으며, 특히 꽃 추출물 50 ug/mL에서의 iNOS의 발현은 LPS 를 처리하지 않은 그룹과 비슷한 수준으로 회복되었다. 구절초 꽃 추출물에 의한 iNOS 단백질의 생합성은 5 ug/mL에서 31.6%, 10 ug/mL에서 36.4%, 25 ug/mL에서 85.8% 그리고 50 ug/mL에서는 96.0%의 억제 효과를 나타내었다. Lee 등(27)과 Kang 등(28)의 연구결과에 의하면 NO 저해 활성을 높게 나타낸 2'-hydrozycinnamaldehyde와 Angelica dahuricae radix 추출물은 iNOS 단백질 발현 억 제도 효과적으로 저해한다는 것을 나타내었다.
증가한 COX-2는 구절초 꽃 추출물을 처리하여도 감소 효과가 나타나지 않았으며, Lee 등(30)의 연구결과에 의하면 참깨과의 리그난 화합물은 iNOS 단백질의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰으나 COX-2의 발현에 대해서는 감소 경향을 나타내지 않았다고 하였다. 본 결과 Lee 등(30)과 유사하게 구절초 꽃 추출물에 의한 COX-2 단백질의 발현 억제는 유의성이 없는 것으로 확인되었다.
이 결과로 구절초 꽃 추출물은 PGE2 생성에는 영향을 주지 않는 것으로 사료된다, Pacheco-Sanchez 등(25)의 연구결과에 의하면 Collybia dryophila polysaccharide(CDP) 는 NO 의 생성을 효과적으로 감소시켰으나 PGE2의 경우 오히려 증가시키는 경향을 보이거나 효과를 나타내지 않았다고 보고하였다. 본 연구에서는 NO 함량은 감소되었으나 PGE2 저해 효과에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
7 세포에서 iNOS mRNA 발현은 거의 확인되지 않았지만 LPS 의 자극에 의하여 발현이 현저하게 증가하였다. 증가한 iNOS mRNA는 LPS로 자극을 주어 발현량을 증가시킨 군과 비교하여 LPS 만 처리한 그룹에 대한비율로 나타냈으며 구절초 꽃 추출물은 농도 의존적으로 iNOS mRNA의 발현량의 감소 경향을 보였다. 구절초 꽃 추출물은 5, 10, 25, 50 ug/mL에서 53.
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