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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 폐기되는 대두박으로 분리한 사포닌의 항비만 작용을 구명하고자 고지방식이로 비만을 유도한 C57BL/6 마우스에게 대두박 사포닌을 수준별로 급여한 후 양성대조물질인 가르시니아 캄보시아의 효과와 비교 · 분석하였다.
- 본 연구는 폐기되는 대두박으로부터 분리한 사포닌이 고지방식이로 유도한 비만마우스의 체중, 지질 함량, 지질대사 및 내당능에 미치는 영향을 살펴보았다. 4주령의 C57BL/6 마우스(n=48)를 1주일간 적응시킨 후 정상식이를 급여한 정상군, 고지방을 급여한 고지방대조군, 고지방식이에 대두박 사포닌을 수준별(0.
가설 설정
- 2)Means in the column not sharing a common letter are significantly different between groups (p<0.05).
- 2)Means in the row not sharing a common letter are significantly different between groups (p<0.05).
- 4)Means in the column not sharing a common letter are significantly different between groups (p<0.05).
제안 방법
- β-oxidation은 Lazarow(29) 방법을 수정 · 보완하여 측정하였다.
- 본 연구는 폐기되는 대두박으로부터 분리한 사포닌이 고지방식이로 유도한 비만마우스의 체중, 지질 함량, 지질대사 및 내당능에 미치는 영향을 살펴보았다. 4주령의 C57BL/6 마우스(n=48)를 1주일간 적응시킨 후 정상식이를 급여한 정상군, 고지방을 급여한 고지방대조군, 고지방식이에 대두박 사포닌을 수준별(0.5%, 1.0%, 1.5%, w/w)로 급여한 군들과 양성대조물질인 가르시니아 캄보지아(1.0%, w/w)를 급여한 군으로 나누어 9주간 사육하였다. 체중증가량과 내장지방(부고환 지방과 신장주변 지방) 무게는 고지방대조군에 비하여 대두박 사포닌 급여 수준에 의존적으로 낮아졌다.
- FAS 활성도는 Carl 등(28)이 실시한 방법을 수정 · 보완하여 측정하였다.
- 대두박 100 g을 70% 식용에탄올로 80°C에서 3회 반복 환류 추출한 후 감압 농축하여 에탄올을 전부 제거한 다음 일정량의 증류수를 첨가하여 Diaion HP-20 수지에 흡착시킨 후 증류수로 세척하고, 20% 식용에탄올로 정제한 다음 100% 식용에탄올로 용출 · 농축하여 조사포닌 시료(21,22)로 사용하였다.
- 대두박 사포닌이 체내 지방조직 축적에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 내장지방의 대표적 지표로 사용되는 부고환지방과 신장주변의 백색지방 무게와 부고환 지방세포의 면적을 측정하여 Table 3과 Fig. 2에 나타내었다.
- 동물 사육실의 환경은 항온(22±2°C), 항습(50±5%), 12시간 간격(08:00～20:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하고 동물들은 polycarbonate cage에 두 마리씩 분리하여 사육하였다.
- 실험동물은 4주령의 수컷 C57BL/6N 마우스 48마리를 바이오제노믹스(Biogenomics, Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 마우스는 1주간 고형식이로 적응시킨 후 난괴법에 의하여 정상군(NC), 고지방대조군(HF), 고지방-0.5% 대두박 사포닌 보충군(HF-0.5S), 고지방-1.0% 대두박 사포닌 보충군(HF-1.0S), 고지방-1.5% 대두박 사포닌 보충군(HF-1.5S)과 양성대조군인 고지방-1.0% 가르시니아 캄보지아(Garcinia cambogia) 보충군(HF-1.0G)으로 나누어 9주간 사육하였다. 가르시니아 캄보지아는 Newtree사(미국)를 통해 수입하여 사용하였다.
- 적출한 지방조직은 10% formaldehyde 용액에 고정시킨 후, 파라핀 포매 과정을 거쳐 슬라이드에 4 um 두께의 절편을 제작하여 hematoxylin & eosin 염색을 하였다. 염색된 지방세포는 광학현미경위에서 무작위로 50개를 선택하여 SPOT INSIGHTTM software program(version 4.0 diagonostic instrument)을 이용하여 면적을 측정하였다.
- 이를 10,000×g(4°C)에서 20분간 원심분리 하여 미토콘드리아 분획을 취했으며, 분리된 상층액을 100,000×g(4°C)에서 1시간 초원심분리 하여 시토졸 분획을 얻었다.
- 즉 47 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.2 mM NAD, 1 mM dithiothreitol, albumin(1.5 g/100 mL), 2% Triton X-100, 0.1 mM CoA, 100 μM FAD, 1 mM KCN 및 일정량의 효소원을 순서대로 첨가한 후 100 μM palmitoyl-CoA를 첨가하여 5분 동안 340 nm(37℃)에서 NAD의 흡광도 변화를 측정하였다.
- 즉, 125 mM potassium phosphate 완충액(pH 7.0), 1 mM EDTA, 16.5 μM acetyl-CoA, 50 μM ma-lonyl-CoA, 50 μM NADPH, 1 mM β-mercaptoethanol 및 일정량의 효소원을 섞어 30°C에서 10분간 반응시킨 후 흡광도의 변화를 분석하였다.
- 체중은 매주 1회 일정시각에 측정하였으며, 식이섭취량은 매일 일정시각에 측정한 후 급여량에서 잔량을 감하여 계산하였다.
- 혈당은 실험 9주째 마우스를 6시간 절식시킨 후 꼬리정맥에서 채혈한 다음 glucometer(Gluco Dr. Medicus, Korea)를 이용하여 측정하였으며, 내당능은 절식 후 포도당 용액을 체중 kg당 1 g씩 복강 내로 투여하고 각각 0, 30, 60, 120분 경과 후에 혈당을 측정하였다.
- 혈장 leptin 함량은 mouse leptin ELISA kit(R&D sys-tems, USA)를 사용하여 immunoassay로 측정하였다.
대상 데이터
- 0G)으로 나누어 9주간 사육하였다. 가르시니아 캄보지아는 Newtree사(미국)를 통해 수입하여 사용하였다. 동물 사육실의 환경은 항온(22±2°C), 항습(50±5%), 12시간 간격(08:00～20:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하고 동물들은 polycarbonate cage에 두 마리씩 분리하여 사육하였다.
- 미토콘드리아 분획은 fatty acid β-oxidation(β-oxidation) 활성 측정에 사용하였고 시토졸 분획은 fatty acid synthase(FAS) 활성 측정에 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 대두박은 (주)신동방유량에서 식용 유지를 추출하고 남은 대두박을 제공받아 사용하였다. 대두박 100 g을 70% 식용에탄올로 80°C에서 3회 반복 환류 추출한 후 감압 농축하여 에탄올을 전부 제거한 다음 일정량의 증류수를 첨가하여 Diaion HP-20 수지에 흡착시킨 후 증류수로 세척하고, 20% 식용에탄올로 정제한 다음 100% 식용에탄올로 용출 · 농축하여 조사포닌 시료(21,22)로 사용하였다.
- 식이성 비만 유도는 총 열량의 37%를 지방(3% 옥수수기름과 18% 쇠기름)으로 공급하였다. 쇠기름은 Wako(일본)로부터 수입하여 사용하였다. 식이와 식수는 자유롭게 섭취(ad libitum)하도록 하였고, 모든 실험 식이는 사육기간 동안 냉장 보관하였다.
- 실험동물은 4주령의 수컷 C57BL/6N 마우스 48마리를 바이오제노믹스(Biogenomics, Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 마우스는 1주간 고형식이로 적응시킨 후 난괴법에 의하여 정상군(NC), 고지방대조군(HF), 고지방-0.
데이터처리
- 간조직 중의 FAS와 β-oxidation의 상관관계는 Pearson's correlation을 적용하여 분석하였다.
- 실험결과는 SPSS package 프로그램을 이용하여 실험군당 평균±표준오차로 표시하였고 각 군 간의 평균치의 통계적 유의성 검정은 one-way ANOVA를 실시하고 다군 간의 차이는 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test로 사후 검정하였다.
이론/모형
- 본 실험에 사용한 기본식이는 AIN-76(23)(Table 1)의 식이조성에 준하였으며 단백질 급원으로는 카제인(Murray, UK)을 공급하고, 탄수화물 급원은 옥수수 전분(신동방), 지방 급원으로는 옥수수기름(제일제당)을 사용하였다. 식이성 비만 유도는 총 열량의 37%를 지방(3% 옥수수기름과 18% 쇠기름)으로 공급하였다.
- 조직과 변의 지질 함량은 Folch 등의 방법(26)에 준하여 클로로포름 : 메탄올(2:1 , v/v) 혼합액으로 지질을 추출한 후 혈액과 동일한 방법으로 측정하여 농도를 구하였다.
- 미토콘드리아 분획은 fatty acid β-oxidation(β-oxidation) 활성 측정에 사용하였고 시토졸 분획은 fatty acid synthase(FAS) 활성 측정에 사용하였다. 조직의 효소활성도는 Bradford의 방법(27)을 사용하여 측정한 단백질 mg당의 고유활성도로 나타내었다.
- 혈장 중의 중성지질 함량은 Muller의 방법(24)으로 조제된 kit 시약(아산제약, 한국)을 사용하여 측정하였다. 총 콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤 함량은 Richmond의 방법(25)으로 조제된 kit(아산제약, 한국) 시약을 사용하였다.
- 혈장 중의 중성지질 함량은 Muller의 방법(24)으로 조제된 kit 시약(아산제약, 한국)을 사용하여 측정하였다. 총 콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤 함량은 Richmond의 방법(25)으로 조제된 kit(아산제약, 한국) 시약을 사용하였다.
성능/효과
- 3)Means in the column not sharing a common letter are sig-nificantly different between groups (p<0.05).
- 5% 대두박 사포닌 급여군의 혈당은 정상군 수준이었다. 9주 동안 고지방식이 급여는 간조직 중의 지방산 합성과 산화효소활성을 모두 증가시켰는데 합성효소의 상승이 훨씬 큰 것으로 나타났다. 그러나 대두박 사포닌은 간조직 중의 지방산 합성과 산화효소활성을 정상화하였다.
- 대두 사포닌이 고지방을 급여한 C57BL/6 마우스의 간조직 중 지질대사에 미치는 영향을 Table 6에 나타내었다. 9주 동안 고지방식이 급여는 간조직 중의 지방산 합성과 지방산 산화효소활성을 정상군에 비하여 각각 3.1배, 1.3배 유의적으로 높였으며, 지방산 합성효소의 상승이 훨씬 큰 것으로 나타났다. 특히, 본 실험에서는 간조직의 합성효소(FAS)와 지방산 산화효소(β-oxidation)가 양의 상관관계를 보였다(Fig.
- 한편, 캄보지아는 변의 지질함량에 유의적인 영향을 미치지 않았다. 간조직 중의 중성지방과 콜레스테롤 함량 역시 고지방대조군에 비하여 대두박사포닌 급여군(1.5%)에서 유의적으로 개선되었으나 캄보아지군의 콜레스테롤 함량은 증가되었다. 고지방식이는 정상식이에 비하여 혈당과 내당능을 유의적으로 증가시켰으나 대두박 사포닌과 캄보지아 급여는 혈당과 식후 혈당 변화를 효과적으로 개선하는 것으로 나타났다.
- 간조직 중의 중성지질과 콜레스테롤 함량은 고지방대조군이 정상군에 비하여 유의적으로 높았다. 고지방식이는 혈장과 간조직의 콜레스테롤 함량을 증가시키는 것(39)으로 알려져 있는데 본 실험에서도 고지방 대조군이 정상군에 비해 간조직의 지질 함량이 1.
- 3에 나타내었다. 고지방식이 급여로 혈장의 렙틴 함량은 정상군에 비하여 약 2배 정도 유의적으로 높았으나 대두박 사포닌 급여로 유의적으로 낮아졌다. 특히 1.
- 5%)에서 유의적으로 개선되었으나 캄보아지군의 콜레스테롤 함량은 증가되었다. 고지방식이는 정상식이에 비하여 혈당과 내당능을 유의적으로 증가시켰으나 대두박 사포닌과 캄보지아 급여는 혈당과 식후 혈당 변화를 효과적으로 개선하는 것으로 나타났다. 특히, 1.
- 비록 당뇨병이 유발되지는 않았으나 고지방식이는 유의적으로 혈당상승을 유발하였으며, 이러한 혈당상승은 내당능 장애를 동반하였다. 그러나 대두박 사포닌 1.0% 이상 급여수준에서 혈당개선을 보이기 시작하였으며 특히, 1.5% 급여군과 캄보지아 급여 시 유의적인 감소효과를 보였다. 또한 대두박 사포닌은 비만으로 야기되는 내당능 장애를 개선하였다.
- 3배 증가하였다. 그러나 대두박 사포닌의 급여수준에 의존적으로 간조직 중 중성지질 함량은 낮았으며, 콜레스테롤 함량은 유의적인 변화가 없었다.
- Oakenfull과 Sidhu(7)는 대두 사포닌이 콜레스테롤과 결합하여 외인성 또는 내인성 콜레스테롤의 흡수를 저해할 뿐만 아니라 담즙산의 장간순환을 저해하여 담즙산의 재흡수를 억제함으로써 콜레스테롤 함량을 개선하다고 제시한바 있다. 그러나 본 실험에서는 대두박 사포닌이 콜레스테롤을 첨가하지 않은 고지방식이로 비만을 유도한 마우스의 변 중 콜레스테롤 배설에는 유의적인 영향을 미치지 않았다. 또한 캄보지아는 변으로의 지질 배설에 유의적인 영향을 미치지 않은 반면, 대두박 사포닌은 변으로의 중성지질 배설을 증가시킴으로써 식이지방의 흡수를 효과적으로 저해하는 것으로 나타났다.
- 혈장 중의 렙틴 함량은 고지방대조군에 비하여 대두박 사포닌 보충군에서 낮았다. 대두박 사포닌 급여수준에 관계없이 혈장의 중성지질과 총 콜레스테롤 함량은 유의적으로 낮아진 반면, 사포닌 급여 수준에 의존적으로 변으로 중성지질 배설은 유의적으로 높았다. 한편, 캄보지아는 변의 지질함량에 유의적인 영향을 미치지 않았다.
- 5% 급여군과 캄보지아 급여 시 유의적인 감소효과를 보였다. 또한 대두박 사포닌은 비만으로 야기되는 내당능 장애를 개선하였다. 향후 이러한 대두박 사포닌의 내당능과 인슐린 저항성 개선에 관한 심도 있는 연구가 이루어져야 될 것으로 생각된다.
- 그러나 본 실험에서는 대두박 사포닌이 콜레스테롤을 첨가하지 않은 고지방식이로 비만을 유도한 마우스의 변 중 콜레스테롤 배설에는 유의적인 영향을 미치지 않았다. 또한 캄보지아는 변으로의 지질 배설에 유의적인 영향을 미치지 않은 반면, 대두박 사포닌은 변으로의 중성지질 배설을 증가시킴으로써 식이지방의 흡수를 효과적으로 저해하는 것으로 나타났다.
- 한편, 혈장 HDL-콜레스테롤 함량은 고지방대조군이 정상군에 비하여 다소 증가하는 경향이었으나 총 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤은 감소됨으로써 고지방식이에 의한 총 콜레스테롤 증가에 기인된 것으로 사료된다. 본 실험에서는 대두박 사포닌이 혈장의 HDL-콜레스테롤 변화에 영향을 미치지 않은 반면, 캄보지아 급여군은 고지방대조군에 비하여 HDL-콜레스테롤이 유의적으로 낮았다.
- 부고환지방 무게는 고지방대조군이 정상군보다 1.5배 높았으며, 신장주변의 백색지방조직 무게도 고지방대조군에서 높은 경향을 보였다. 그러나 대두박 사포닌 급여는 내장지방 축적을 감소시키는 경향이었으며 특히, 1.
- 5% 대두박 사포닌 급여군과 캄보지아 급여군은 고지방대조군에 비하여 유의적으로 낮았다. 부고환지방과 신장주변 지방조직 무게를 합한 총 내장지방 무게 역시 대두박 사포닌 급여수준이 높을수록 효과적으로 낮았다.
- 식이섭취량은 고지방급여군이 정상군보다 낮은 경향이었으나 일일 에너지섭취량은 고지방대조군이 13.4% 유의적으로 높았으며, 이는 고지방식이로 인한 체중증가량과 유사한 수준이었다. 대두박 사포닌은 식이섭취량과 에너지섭취량에 유의적인 영향을 미치지 않은 반면, 캄보지아는 식이섭취량을 현저히 낮추었다.
- 열량의 37%를 지방으로 급여한 마우스의 체중은 실험 3주부터 정상식이군보다 유의적으로 높았으나, 대두박 사포닌과 캄보지아 급여군의 체중은 고지방대조군에 비하여 유의적인 낮았다(Table 2). 실험기간 동안 체중증가량은 대두박 사포닌의 급여수준에 의존적으로 낮아짐으로써(Fig. 1) 사포닌 급여량이 높을수록 체중감소 효과가 큰 것으로 나타났다. 비만에서 체중 감량은 비만과 관련된 질환과 대사 상태를 호전시키는 것으로 알려져 있다(30).
- 열량의 37%를 지방으로 급여한 마우스의 체중은 실험 3주부터 정상식이군보다 유의적으로 높았으나, 대두박 사포닌과 캄보지아 급여군의 체중은 고지방대조군에 비하여 유의적인 낮았다(Table 2). 실험기간 동안 체중증가량은 대두박 사포닌의 급여수준에 의존적으로 낮아짐으로써(Fig.
- 그러나 대두박 사포닌은 간조직 중의 지방산 합성과 산화효소활성을 정상화하였다. 이와 같이 대두박 사포닌은 비만유도 마우스에서 변으로의 중성지질 배설을 증가시키고 간조직에서 지질대사 관련 효소활성을 조절함으로써 체중조절과 혈당개선에 효과적이었다.
- 그러나 대두박 사포닌과 캄보지아는 간조직 중의 지방산 합성과 산화효소의 활성을 정상화하였다. 캄보지아는 지방산 합성을 저해하는 것으로 알려져 있는데 본 실험에서도 고지방대조군에 비하여 지방산 합성효소 활성을 유의적으로 낮추었으며, 대두박 사포닌 역시 유사한 수준으로 FAS 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 최근 체내 지질 합성의 중요한 역할을 수행하는 FAS 활성 저해는 동물실험에서 비만 치료의 중요한 타깃(41)으로 제시되고 있다.
- 특히, 본 실험에서는 간조직의 합성효소(FAS)와 지방산 산화효소(β-oxidation)가 양의 상관관계를 보였다(Fig. 4).
- 양성대조물질인 캄보지아 급여 역시 혈장의 지질 농도를 유의적으로 개선하였다. 한편, 혈장 HDL-콜레스테롤 함량은 고지방대조군이 정상군에 비하여 다소 증가하는 경향이었으나 총 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤은 감소됨으로써 고지방식이에 의한 총 콜레스테롤 증가에 기인된 것으로 사료된다. 본 실험에서는 대두박 사포닌이 혈장의 HDL-콜레스테롤 변화에 영향을 미치지 않은 반면, 캄보지아 급여군은 고지방대조군에 비하여 HDL-콜레스테롤이 유의적으로 낮았다.
- 혈장 중의 중성지질과 총 콜레스테롤 함량은 고지방대조군이 정상군에 비하여 각각 1.2배와 1.4배 유의적으로 높았다. 그러나 대두박 사포닌의 모든 급여 수준에서 혈장의 중성지질과 총 콜레스테롤 함량이 고지방대조군에 비하여 유의적으로 낮았다.
후속연구
- 또한 장기간의 고지방 섭취는 지방세포의 증대를 유도하는 것으로 알려져 있어(32), 부고환지방 세포의 면적을 측정한 결과 고지방대조군의 지방세포 면적이 정상군에 비하여 유의적으로 높았으나 대두박 사포닌의 급여수준에 의존적으로 지방세포 면적이 작아졌다. 내장지방 축적은 여러 대사 질환을 일으키는 중요한 요소로 알려져 있으므로 대두박 사포닌의 내장지방 축적 및 지방세포 증대 억제는 고지방 식이로 인한 대사 장애를 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 대두박 사포닌은 비만으로 야기되는 내당능 장애를 개선하였다. 향후 이러한 대두박 사포닌의 내당능과 인슐린 저항성 개선에 관한 심도 있는 연구가 이루어져야 될 것으로 생각된다.
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