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문제 정의
- ) Mill과 유사한 우리나라 자생종 Opuntia ficus-indica var. saboten Makino의 열매와 줄기가 혈당 강하 효과를 가지는지, 그리고 당뇨의 합병증으로 문제시되는 지질대사를 개선시키는 효과가 있는지를 알아보고 더 나아가 Opuntia ficus-indica를 포함한 몇몇 종류의 당뇨개선 효과를 가지고 있는 한약재들을 복합하여 보다 효과적인 당뇨치료제를 개발하기 위한 선행연구로 실시되었다.
제안 방법
- 5)에 용해시켜 STZ 50 mg/kg씩 1회 복강 주사하였다. 24시간 경과 후 당뇨 유발정도를 요당 측정용 strip(영동제약, Uriscan GP2)을 이용하여 확인하였고, 요당이 300 mg/dL 이하인 개체는 2회 복강 주사하여 최종 당뇨유발 후 12시간 절식시켜 공복 시 혈당이 300 mg/dL 이상에 이르도록 하였다. 당뇨를 유발하지 않은 정상군은 동량의 saline액을 주사하였다.
- 기초식이는 AIN-76(American Institute Nutrition-76)의 사양표준에 준하여 제조되었으며, 각 실험에서 당뇨를 유발하지 않은 군(NC)과 당뇨를 유발한 당뇨대조군(DC)에는 기초식이를, DOF군은 기본식이에 8%수준으로 손바닥선인장 열매를, 그리고 DO-5군 및 DO-10군은 기초식이에 각각 5%와 10%수준으로 손바닥선인장 줄기를 혼합하여 자유채식시켰다. 실험동물은 금속케이지에 한 마리씩 분리 사육하였으며, 사육실 내 환경은 온도 20～25℃, 습도 60～70%, 광주기 12시간을 유지하였다.
- 실험군은 정상군(NC), 당뇨대조군(DC), 열매급여군 (DOF), 줄기5%급여군(DO-5), 줄기10%급여군(DO-10)으로 구분하였으며, 음수량은 1일, 식이섭취량은 2일 간격, 체중 및 혈당은 1주 간격으로 측정하였는데, 혈당은 12시간 절식 후 꼬리정맥에서 측정하였다. 당 내성은 공복 시 혈당을 측정한 후 포도당(50 mg/체중 1 kg)을 복강에 주사한 다음, 30, 60, 90, 120분 경과하였을 때 혈당과 동일한 방법으로 측정하였다. 수분함량은 열매가 94.
- 24시간 경과 후 당뇨 유발정도를 요당 측정용 strip(영동제약, Uriscan GP2)을 이용하여 확인하였고, 요당이 300 mg/dL 이하인 개체는 2회 복강 주사하여 최종 당뇨유발 후 12시간 절식시켜 공복 시 혈당이 300 mg/dL 이상에 이르도록 하였다. 당뇨를 유발하지 않은 정상군은 동량의 saline액을 주사하였다.
- 맹검인 증류수, 혈장과 표준액의 사용량은 4.5 μL이고, R1 시약은 240 μL, R2 시약은 120 μL를 10분간 반응시켜 660 nm와 546 nm에서 흡광도를 측정하고 여기서 얻은 검량곡선을 이용하여 효소의 활성 단위로 환산하였다.
- 실험동물은 평균 체중 250(±10) g의 Sprague-Dawley 쥐 8주령 수컷을 (주)셈타코에서 분양 받아 실험군 당 8마리씩 40마리를 공시하였다. 먼저 7일간의 적응기간을 거친 다음 당뇨를 유발하지 않은 정상군(NC), 당뇨를 유발한 당뇨대조군(DC), 당뇨를 유발한 후 전체식이에 대하여 8% 손바닥선인장 열매를 급여한 당뇨실험군(DOF), 당뇨를 유발한 후 전체식이에 대하여 5% 수준으로 손바닥선인장 줄기를 급여한 군(DO-5)과 10% 손바닥선인장 줄기를 급여한 군 (DO-10)으로 구분하고 각 8마리씩 평균혈당을 동일하게 배치하여 3주 동안 사육하였다.
- 손바닥선인장의 항당뇨 효과와 기작을 알아보기 위한 연구의 일환으로, 손바닥선인장의 열매 및 줄기의 급여가 STZ 으로 당뇨가 유발된 8주령 수컷 흰쥐의 음수량, 식이섭취량, 체중, 공복혈당, 당내성에 미치는 효과와 당뇨의 합병증인 고지혈증(중성지방, 유리지방산, 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤)을 조사하였다. 손바닥선인장의 열매 및 줄기는 동결건조 후 분쇄하여 분말사료에 8%(열매) 및 5%와 10%(줄기) 수준으로 첨가하여 3주간 자유채식 시켰다. 실험군은 정상군(NC), 당뇨대조군(DC), 열매급여군 (DOF), 줄기5%급여군(DO-5), 줄기10%급여군(DO-10)으로 구분하였으며, 음수량은 1일, 식이섭취량은 2일 간격, 체중 및 혈당은 1주 간격으로 측정하였는데, 혈당은 12시간 절식 후 꼬리정맥에서 측정하였다.
- 손바닥선인장의 항당뇨 효과와 기작을 알아보기 위한 연구의 일환으로, 손바닥선인장의 열매 및 줄기의 급여가 STZ 으로 당뇨가 유발된 8주령 수컷 흰쥐의 음수량, 식이섭취량, 체중, 공복혈당, 당내성에 미치는 효과와 당뇨의 합병증인 고지혈증(중성지방, 유리지방산, 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤)을 조사하였다. 손바닥선인장의 열매 및 줄기는 동결건조 후 분쇄하여 분말사료에 8%(열매) 및 5%와 10%(줄기) 수준으로 첨가하여 3주간 자유채식 시켰다.
- 음수는 수돗물을 자율 섭취케 하였고 1일 간격으로 음수 소비량을 측정하였다. 식이섭취량은 2일 간격으로 측정하였다. 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 체중증가량(g)/총 식이섭취량(g)×100으로 계산하였다.
- 실험 식이를 급여한 지 3주 후 12시간 절식시켜 공복 시 혈당을 측정한 뒤, glucose(50 mg/kg body weight)를 복강 주사하고 30, 60, 90, 120분 경과 후에 앞에서와 동일한 방법으로 혈당을 측정하였다.
- 손바닥선인장의 열매 및 줄기는 동결건조 후 분쇄하여 분말사료에 8%(열매) 및 5%와 10%(줄기) 수준으로 첨가하여 3주간 자유채식 시켰다. 실험군은 정상군(NC), 당뇨대조군(DC), 열매급여군 (DOF), 줄기5%급여군(DO-5), 줄기10%급여군(DO-10)으로 구분하였으며, 음수량은 1일, 식이섭취량은 2일 간격, 체중 및 혈당은 1주 간격으로 측정하였는데, 혈당은 12시간 절식 후 꼬리정맥에서 측정하였다. 당 내성은 공복 시 혈당을 측정한 후 포도당(50 mg/체중 1 kg)을 복강에 주사한 다음, 30, 60, 90, 120분 경과하였을 때 혈당과 동일한 방법으로 측정하였다.
- 실험동물은 7일간 적응기간을 두고 실험식이 급여에 들어가기 전 12시간 동안을 절식시킨 다음에, 당뇨군은 STZ(streptozotocin)을 0.1 M citrate buffer(pH 4.5)에 용해시켜 STZ 50 mg/kg씩 1회 복강 주사하였다. 24시간 경과 후 당뇨 유발정도를 요당 측정용 strip(영동제약, Uriscan GP2)을 이용하여 확인하였고, 요당이 300 mg/dL 이하인 개체는 2회 복강 주사하여 최종 당뇨유발 후 12시간 절식시켜 공복 시 혈당이 300 mg/dL 이상에 이르도록 하였다.
- 기초식이는 AIN-76(American Institute Nutrition-76)의 사양표준에 준하여 제조되었으며, 각 실험에서 당뇨를 유발하지 않은 군(NC)과 당뇨를 유발한 당뇨대조군(DC)에는 기초식이를, DOF군은 기본식이에 8%수준으로 손바닥선인장 열매를, 그리고 DO-5군 및 DO-10군은 기초식이에 각각 5%와 10%수준으로 손바닥선인장 줄기를 혼합하여 자유채식시켰다. 실험동물은 금속케이지에 한 마리씩 분리 사육하였으며, 사육실 내 환경은 온도 20～25℃, 습도 60～70%, 광주기 12시간을 유지하였다.
- 음수는 수돗물을 자율 섭취케 하였고 1일 간격으로 음수 소비량을 측정하였다. 식이섭취량은 2일 간격으로 측정하였다.
- 체중과 혈당은 당뇨 유발 후 실험 식이에 들어가기 전에 측정 한 다음, 실험기간 중에는 1주 간격으로 3주간 측정하였다. 혈당은 12시간 절식 후 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 공복 시 혈당을 혈당측정기(녹십자, MyCare GAM-2200)로 측정하였다.
- 체중과 혈당은 당뇨 유발 후 실험 식이에 들어가기 전에 측정 한 다음, 실험기간 중에는 1주 간격으로 3주간 측정하였다. 혈당은 12시간 절식 후 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 공복 시 혈당을 혈당측정기(녹십자, MyCare GAM-2200)로 측정하였다.
- 혈장 HDL-cholesterol의 함량은 dextran sulfate와 magnesium sulfate를 이용하여 LDL과 VLDL의 lipoprotein을 침전시킨 후 상층액에 남아있는 HDL 중의 콜레스테롤을측정하였으며, kit(신양화학)를 사용하였다. 혈장 0.
- 혈장과 표준액(300 mg/dL)을 각각 20 μL 와 효소제 3 mL를 37℃에서 5분간 반응시킨 뒤, 505 nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같은 공식으로 계산하였다.
대상 데이터
- 본 실험은 제주도산 손바닥선인장(Opuntia ficus-indica) 의 열매와 줄기를 -70℃로 동결 건조한 다음, Disc mill로 1차 분쇄하고 Cyclone mill로 2차 분쇄하여 본 실험에 사용하였다.
- 실험동물은 평균 체중 250(±10) g의 Sprague-Dawley 쥐 8주령 수컷을 (주)셈타코에서 분양 받아 실험군 당 8마리씩 40마리를 공시하였다.
데이터처리
- 3)Values with different superscripts within same column are significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).
- 4)Values with different superscripts within same column are significantly different by Duncan's multiple range test (p<0.05).
- 본 실험연구에서 얻어진 모든 측정치는 mean±SE로 나타내었고, 각 평균치간 차이에 대한 유의성은 Statistical Analysis System(SAS, version 9.2)를 이용하여 ANOVA를 실시한 후, Duncan's multiple range test로 각 군의 평균 차이에 대한 사후 검정을 하였으며, 통계적 유의성을 5%수준에서 분석하였다.
이론/모형
- 시료의 일반성분 분석은 AOAC법(11)에 의거하여, 수분은 상압가열건조법, 조회분은 회화법, 조단백질은 Kjeldahl 방법(Kjeltec system, ITecator사), 조지방은 Soxhlet 추출법, 조섬유는 산알칼리분해법(Fibertec system, ITecator사)을 이용하여 정량하였다.
- 혈장 내 총콜레스테롤의 함량은 cholesterolester hydrolase, cholesterol oxidase 및 hydrogen peroxidase를 이용한 효소법으로 kit(신양화학)를 이용하여 측정하였다. 혈장과 표준액(300 mg/100 mL)을 20 μL씩 넣고, 효소시약 3 mL을 혼합한 후 항온 수조에서 15분간 반응시켜 505 nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같이 계산하였다.
- 혈장 중 LDL-콜레스테롤은 Hitachi 7600-110(auto system), LDL-C plus(Roche)시약을 사용하여 homogeneous enzymatic colorimetric method로 분석하였다. 검체 및 표준의 흡광도는 600 nm에서 측정하였다.
- 혈장 중 유리지방산(non-esterified fatty acid, NEFA)의 함량은 Acylcoenzyme A synthetase(ACS)법을 이용한 kit(신양화학)를 사용하여 측정하였다. 맹검인 증류수, 혈장과 표준액의 사용량은 4.
- 혈장 중 인슐린함량은 방사선면역측정법(12)에 의하여 측정하였는데, 외부분석기관(삼광의료재단)에 분석을 의뢰하였다.
- 혈장 중 중성지방 함량은 Glycerol kinase(GK)-Glycerol phospho-oxidase(GPO)법을 이용한 kit(신양화학)를 사용하여 측정하였다. 혈장과 표준액(300 mg/dL)을 각각 20 μL 와 효소제 3 mL를 37℃에서 5분간 반응시킨 뒤, 505 nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같은 공식으로 계산하였다.
성능/효과
- DOF, DO-5그리고 DO-10은 DC에 비하여 유의적(p<0.05)인 증가를 보였고, 특히 DO-10은 NC와 비슷한 수준까지의 증가를 보였다.
- 손바닥선인장 열매를 실험식이로 급여한 실험에서 나타난 3주 후 최종 평균체중을 보면, 정상군의 경우 26%의 체중증가를 보였고, 당뇨대조군에서는 17%의 체중감소를 나타냈다. DOF군은 2%만큼 체중의 감소를 보여, DO-5군의 5%와 DO-10군의 5.7% 체중 감소보다 적은 체중 감소를 나타냈으나 유의적인 차이는 없었다. 따라서 손바닥선인장 열매와 줄기는 DC와 비교해 체중감소를 억제하는 유의적(p<0.
- Fig. 1에서 3주 후 DOF의 공복혈당은 DC의 공복혈당과 비교하여 28%의 유의적(P<0.05)인 감소를 나타냈고, DO-5는 5%, DO-10은 9%의 혈당 감소를 보였으나 통계적으로 유의한 차이는 아니었다.
- LDL-콜레스테롤 함량은 NC에 비하여 DC에서 유의적으로 증가하였으나, DOF, DO-5와 DO-10은 DC에 비하여 유의적인 감소를 보였다(p<0.05).
- NC의 공복혈당은 평균 100 mg/dL이었고 DC는 379 mg/dL이었으며, DOF는 DC에 비해 28%의 혈당 감소를 보인 반면(P<0.05), DO-5는 5%와 DO-10은 9% 감소하여 유의적 차이를 보이지 않았다.
- STZ로 당뇨를 유발한 실험군들(DC, DOF, DO-5, DO-10)의 혈당은 평균 347 mg/dL 이었으며, 당뇨 유발 후 3주 동안 실험 식이를 급여한 쥐의 평균공복혈당은 DC 379 mg/dL, DOF 276 mg/dL, DO-5 355 mg/dL 그리고 DO-10 344 mg/dL로 모든 실험군에서 NC의 공복혈당(100 mg/dL)에 비하여 높았다. Fig.
- 각 실험군의 식이효율(food energy ratio, FER)은 NC 14.7로 나타났고, DC는 -4.3으로 매우 낮은 식이효율을 보였으나, DOF는 -0.7로 DC와 비교하여 유의적(p<0.05)인 증가를 보였고, DO-5는 -1.9, 그리고 DO-10은 -2.4로 당뇨대조군과 비교해 유의적인 차이가 없었다.
- 3%인 줄기보다 다소 많았다. 건조중량에 대한 조회분은 열매가 10.7%로 줄기(22.5%)보다 적었고, 조단백질 농도는 열매가 4.8%로 줄기(7.9%)보다 낮았으며, 조지방 또한 열매가 2.0%로 줄기(2.7%)보다 낮게 나타났고, 조섬유도 열매가 9.0%로 줄기(11.4%)보다 적은 함량을 보였다. 손바닥 선인장에 대하여 분석한 Moon(13)이 보고한 결과를 보면, 조지방의 함량이 열매에서 1.
- 05)인 감소를 나타냈고, DO-5는 5%, DO-10은 9%의 혈당 감소를 보였으나 통계적으로 유의한 차이는 아니었다. 결과적으로 손바닥선인장의 열매는 혈당을 감소하는 효과가 있고, 이러한 효과는 기존의 연구들과 비교해볼 때 우수한 효과를 나타낸 것으로 볼 수 있다(15,16,18,21).
- 경제발전과 환경오염, 생활양식의 변화 등으로 인해 근래에 당뇨는 암 및 순환기계 질환과 더불어 사망률 및 유병률이 가장 높은 5대 질병으로 대두되었으며, 그로 인한 사망률도 지난 10년 동안에 3배 이상 증가하였고 앞으로도 계속 증가할 것으로 여겨진다(1). 현대 의학으로 당뇨병을 근원적으로 치료할 수 있는 방법은 아직 개발되지 못하고 있고, 혈당이 정상적인 수준으로 유지되도록 혈당을 조절하는 것만이 최선의 치료방법으로 알려져 있으며, 당뇨병의 치료방법으로는 약물요법, 운동요법, 식이요법의 3가지 방법이 있다(2).
- 그러나 본 연구에서는 NC에 비하여 DC, DOF, DO-5 그리고 DO-10에서 감소를 보이지 않고 오히려 유의적(p<0.05)인 증가를 보였다.
- 당 부하 정도를 살펴보면, NC와 DO-5는 포도당을 주입 후 30분에 최고치의 혈당을 보였으나, DC, DOF 그리고 DO-10은 주입 후 60분에 최고치의 혈당을 나타내고 유의적 (p<0.05)인 감소추세를 보였다(Fig. 2).
- 당뇨실험군에서 DOF는 154.3 mL, DO-5는 184.0 mL, 그리고 DO-10은 144.4 mL로 DOF와 DO-10은 DC에 비해 유의적(p<0.05)인 음수량 감소를 보였으며, 특히 DO-10은 DC보다 28%의 음수량 감소를 나타냈다.
- 따라서 손바닥선인장 열매와 줄기는 DC와 비교해 체중감소를 억제하는 유의적(p<0.05)인 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 또한 손바닥선인장의 열매 및 줄기 모두 당뇨의 합병증인 지질대사에서 혈장의 중성지방, 유리지방산, 총 콜레스테롤 그리고 LDL-콜레스테롤을 모두 DC와 비교해 DOF, DO-5와 DO10에서 유의적인 감소를 보였다(p<0.05).
- 가용무질소물(nitrogen-free extracts, NFE)은 100－(수분＋조회분＋조단백＋조지방＋조섬유)의 값으로 표시하며, 주성분은 soluble sugar, starch, 일부 cellulose, hemicellulose 및 lignin 등이다. 본 분석방법에서 탄수화물은 NFE와 조섬유의 합으로 표현할 수 있는바, 건조중량으로 비교했을 때 열매(78.4%)가 줄기(66.9%)보다 많은 탄수화물 함량을 나타내었다.
- 본 연구에서 DC에 비하여 DOF, DO-5 그리고 DO-10의 중성지질 함량이 유의적(p<0.05)으로 감소되는 것으로 볼 때, 손바닥선인장 열매 및 줄기가 STZ으로 당뇨를 유발한 쥐에서 혈중지질 증가를 억제함으로써 항고지혈증 예방에 효과를 발휘하는 것으로 생각된다.
- 한편 STZ으로 당뇨를 유발할 경우에는 alloxan으로 당뇨를 유발한 경우보다 체중감소가 심하며, 체중회복 또한 쉽지 않다는 보고들도 있다(19). 본 연구에서 손바닥선인장의 열매 및 줄기는 당뇨로 인한 평균체중의 감소를 완화시켰으며, 이러한 체중감소를 완화시킨 원인이 당뇨의 치료효과일 것으로 추정되었다.
- 05)인 체중의 차이가 관찰되었는데, STZ의 복강주사를 받은 쥐들은 saline을 복강주사 받은 쥐들보다 더 많은 통증을 느꼈으며 이로 인해 당뇨를 유발하는 과정에서 1차, 2차 STZ을 복강주사 함으로써 saline을 복강주사한 정상군보다 더 많은 스트레스를 받았기 때문인 것으로 판단된다. 손바닥선인장 열매를 실험식이로 급여한 실험에서 나타난 3주 후 최종 평균체중을 보면, 정상군의 경우 26%의 체중증가를 보였고, 당뇨대조군에서는 17%의 체중감소를 나타냈다. DOF군은 2%만큼 체중의 감소를 보여, DO-5군의 5%와 DO-10군의 5.
- 당 내성은 공복 시 혈당을 측정한 후 포도당(50 mg/체중 1 kg)을 복강에 주사한 다음, 30, 60, 90, 120분 경과하였을 때 혈당과 동일한 방법으로 측정하였다. 수분함량은 열매가 94.5%, 줄기가 92.3%였고, 조회분, 조단백, 조지방, 조섬유 등의 농도는 줄기가 열매에 비해 높았고, NFE는 열매가 줄기에 비해 높았다. 체중변화는 DC에 비해 DOF에서 체중이 적게 감소했다.
- 체중변화는 DC에 비해 DOF에서 체중이 적게 감소했다. 음수량과 사료섭취량은 NC에 비해 DC가 각각 7.5배 및 1.5배 이상 증가하였고, 처리군들은 음수량 및 식이섭취량이 DC에 비해 낮았다. NC의 공복혈당은 평균 100 mg/dL이었고 DC는 379 mg/dL이었으며, DOF는 DC에 비해 28%의 혈당 감소를 보인 반면(P<0.
- 7%의 체중 감소를 보여 당뇨대조군과 비교했을 때 그 감소의 폭이 적었고, 이는 본 연구에서 관찰된 것과 유사한 경향이다. 이로써 손바닥선인장 열매 및 줄기의 급여는 당뇨유발 쥐에서 체중의 감소현상을 완화시키는 효과가 있음을 재확인할 수 있었다. 한편 STZ으로 당뇨를 유발할 경우에는 alloxan으로 당뇨를 유발한 경우보다 체중감소가 심하며, 체중회복 또한 쉽지 않다는 보고들도 있다(19).
- 총 3주간의 실험기간 동안 각 처리군이 섭취한 평균 사료섭취량(g)은, Table 3에서 보는 바와 같이, NC는 494.8 g의 사료섭취량을 나타냈으며, DC는 758.0 g의 사료섭취량을 나타내 정상군에 비해 1.5배 이상의 많은 양의 사료섭취를 보였다. DOF의 평균섭취량은 673.
- 혈장 인슐린 농도는, Fig. 3에 제시한 바와 같이 NC에 비하여 DC에서 유의적(p<0.05)인 감소를 보였다.
- 혈장 인슐린 함량도 당뇨대조군과 비교해 DOF, DO-5와 DO-10에서 유의적(p<0.05)인 증가를 보였다.
- 혈장 중 유리지방산(NEFA) 함량은 Fig. 4B와 같이 NC에 비해 DC가 월등히 높았는데, 이는 혈장 중 중성지방 함량과 같이 당뇨 유발에 의한 당대사의 이상이 정상적인 지질대사를 저해시켜 나타난 현상으로 보이며, DOF, DO-5 그리고 DO-10은 당뇨대조군에 비하여 혈장 중 유리지방산 함량이 유의적(p<0.05)으로 감소한 사실로 보아, 이 역시 항고지혈증 예방에 효과를 가진 인자가 존재하는 것으로 판단된다.
후속연구
- 따라서 본 연구에서 손바닥선인장의 열매 및 줄기의 섭취는 흔히 당뇨의 부작용으로 나타나는 총콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤 증가를 완화시킴으로써 지질대사 이상으로 인한 혈관합병증을 줄여줄 것으로 기대된다.
- 따라서 췌장조직과 β-세포의 회복 여부 및 파괴정도를 관찰함으로써 손바닥선인장 열매 및 줄기의 작용기작을 더 세부적으로 연구할 필요성이 있다고 판단된다.
- 이상의 결과에서 볼 때, 손바닥선인장의 열매는 항당뇨 효능이 있었고, 또 당뇨 합병증인 지질대사의 이상도 개선하는 것으로 관찰되었으며, 그 줄기는 통계적으로 유의한 혈당 감소 효과를 보이지는 않았지만 당뇨의 합병증인 고지혈증을 개선시키는 것으로 나타나, 보다 구체적인 작용기작을 추가적 연구를 통해 확인할 필요가 있다고 사료된다.
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