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문제 정의
- 본 연구에서는 아스타잔틴의 항산화 기작을 확인하고자 다양한 항산화 활성의 측정법을 통해 항산화 활성을 확인하였다. 또한 유방암, 폐암 및 자궁경부암에 대한 항암효과를 측정하였고, 미백기능과 함께 숙취해소에 대한 효과를 검토하였다.
- 또한 유방암, 폐암 및 자궁경부암에 대한 항암효과를 측정하였고, 미백기능과 함께 숙취해소에 대한 효과를 검토하였다. 특히 cyclodextrin과의 포접화합물을 조제하였을 경우에도 유리형 아스타잔틴과 비슷한 생리활성을 나타내는지 확인하였다.
- 아스타잔틴의 항산화 기작은 일중항 산소 (singlet oxygen)를 제거하거나 자유라디칼 소거능이 높고 특히 과산화물 연쇄반응 (peroxide chain reaction)을 정지시켜 지질의 산화를 방지하는 것으로 알려져 있다 [45-48]. 본 연구에서는 아스타잔틴의 항산화능을 확인하기 위해 몇 종류의 항산화 활성을 검토하였다.
- 그 예로 아스타잔틴의 활성산소 (oxygen radical) 제거에 의한 개시 (cancer initiation)와 진행 (propagation)의 과정을 감소시켜 난소암, 간암에 대한 예방효과 등이 보고되었다 [11,12]. 본 연구에서는 일반적으로 사용되고 있는 유방암 세포주 (MCF-7), 자궁암 세포주 (HeLa)에 대해 아스타잔틴과 헤마토코커스 추출물의 항암활성을 측정하였다. 실험결과, 자궁암 세포주 (HeLa)에 대해서는 대조군인 5-fluorouracil (5-FU)과 비교하여 비슷하거나 높은 세포독성을 나타냈고, 유방암 세포주 (MCF-7)에 대해서는 대조군인 indol-3-carbinol (I3C)의 50% 수준으로 활성을 나타냈다 (Fig.
- 항산화 물질의 숙취해소 효과를 함께 검토한 최근의 연구동향에 비추어 본 연구에서도 아스타잔틴의 숙취해소 효과를 검토하였다. 기존에 효모의 일종인 파피아 로도지마(Phaffia rhodozyma)에서 추출된 아스타잔틴을 음료에 첨가하여 두통해소, 혈중 알콜농도 감소 등의 숙취해소 효과가 보고된 예가 있다 [52].
제안 방법
- 본 연구팀에서는 지용성 물질의 안정화와 용해도 향상을 위해 널리 사용되는 수종의 싸이클로덱스트린 (β-cyclodextrin, hydroxypropyl-β-cyclodextrin, hydroxypropyl-γ-cyclodextrin)을 이용한 포접화합물을 제조하였고 안정성과 용해도를 향상시킨 아스타잔틴 제형을 얻을 수 있었다.
- 본 연구에서는 아스타잔틴의 항산화 기작을 확인하고자 다양한 항산화 활성의 측정법을 통해 항산화 활성을 확인하였다. 또한 유방암, 폐암 및 자궁경부암에 대한 항암효과를 측정하였고, 미백기능과 함께 숙취해소에 대한 효과를 검토하였다. 특히 cyclodextrin과의 포접화합물을 조제하였을 경우에도 유리형 아스타잔틴과 비슷한 생리활성을 나타내는지 확인하였다.
- 5% (w/v)의 비율로 현탁시킨 후, 40℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 원심분리로 침전물을 회수하여 아세톤을 0.5% (w/v)의 농도로 첨가한 후 초음파처리 (75 min, 40 kHz; Power sonic 510, Hwashin, Korea)하여 아스타잔틴을 추출하였다.
- 측정하고자 하는 시료를 phosphate buffer saline (PBS)에 녹인 후 농도별로 20 μL씩 각 well에 첨가하여 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 배지를 제거하고 새로운 배지 190 μL와 10 μL의 CCK-8 용액을 각 well에 가하였다.
- 10% fetal bovine serum (FBS)과 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 각각 배양된 유방암 세포주 (MCF-7)와 자궁암 세포주 (HeLa)를 1 × 104 cell/mL의 농도가 되도록 96 well plate에 각각 180 μL씩 넣고, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
- 반응 후, 2.8% TCA 200 μL와 50 mM NaOH에 용해한 1% TBA 200 μL를 첨가하여 100℃ 15분 동안 가열시키고, 얼음 속에서 급속히 냉각하여 530 nm에서 생성된 malondialdehyde (MDA)의 양을 측정하였다.
- 50 mM FeSO4 ․ 7H2O 20 μL와 50 mM의 EDTA 20 μL를 각각 넣고, 50 mM 2-deoxyribose 40 μL와 시료 40 μL를 첨가하였다.
- 1 mL를 신속하게 혼합한 다음 분광광도계로 340 nm에서 5분간 흡광도를 측정하였다. 대조군에는 ADH 대신 0.1% BSA를 첨가하여 흡광도를 측정하였다. 시료의 ADH 활성은 대조군에 대한 상대활성 (%)으로 측정하였다.
- 1% BSA를 첨가하여 흡광도를 측정하였다. 시료의 ADH 활성은 대조군에 대한 상대활성 (%)으로 측정하였다.
- -β-CD)을 사용하였고, 대조군으로 지용성 항산화제인 알파-토코페롤을 사용하였다. 활성 분석시 포접화합물의 농도는 포접된 아스타잔틴의 농도로 환산하여 첨가하였고, 포접화합물의 특성상 짧은 시간동안의 in vitro 실험보다는상대적으로 오랜 시간동안 반응이 이루어지는 in vitro 실험에서 안정화 효과가 나타날 것으로 판단되어 항산화 측정법 중 장시간 반응시킬 수 있는 조건에서 활성 분석 실험을 시행하였다. 먼저 아스타잔틴의 라디칼 소거능을 확인하였고, 검정방법으로 DPPH 라디칼 소거능, hydroxyl 라디칼 소거능 및 xanthine oxidase 저해활성 등을 측정하였다.
- 활성 분석시 포접화합물의 농도는 포접된 아스타잔틴의 농도로 환산하여 첨가하였고, 포접화합물의 특성상 짧은 시간동안의 in vitro 실험보다는상대적으로 오랜 시간동안 반응이 이루어지는 in vitro 실험에서 안정화 효과가 나타날 것으로 판단되어 항산화 측정법 중 장시간 반응시킬 수 있는 조건에서 활성 분석 실험을 시행하였다. 먼저 아스타잔틴의 라디칼 소거능을 확인하였고, 검정방법으로 DPPH 라디칼 소거능, hydroxyl 라디칼 소거능 및 xanthine oxidase 저해활성 등을 측정하였다.
- 또한, 가장 보편적으로 사용되고 있는 항산화능의 검정 법인 DPPH 자유라디칼 소거능을 조사하였다. DPPH는 분자내 라디칼을 함유하고 있으며 토코페롤, ascorbic acid, polyhydroxy aromatic compounds, aromatic amine에 의해 환원되면서 라디칼이 소거되어 짙은 자색이 탈색되는데 이정도를 항산화 물질의 수소공여능으로 측정하는 방법이다.
- 다음으로 hydroxyl 라디칼 소거능을 측정하였다. hydroxyl 라디칼은 활성산소 중반응성이 매우 강하여 생체 산화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
- Fe+2와 H2O2가 반응하는 Fenton’s reaction에 의해 생성된 hydroxyl 라디칼이 2-deoxyribose를 산화시켜 malondialdehyde (MDA)로 분해시킨다. 이때 MDA를 530 nm에서 측정하여 hydroxyl 라디칼의 반응정도를 측정하고자 하였다. 아스타잔틴의 경우 2.
- 본 실험에서는 알콜대사 산물인 β-NADH의 양을 측정하여 효소활성을 측정하였다.
- 아스타잔틴의 미백활성은 바 있다 [33]. 미백활성은 기존의 보고된 방법인 tyrosinase 대조군인 kojic acid와 비슷한 활성을 지니는 것으로 보고된 저해활성을 측정하여 평가하였다. 멜라닌 (melanine)은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 생물고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다.
- 이 색소의 생합성 경로는 tyrosine을 출발 물질로 하여 dopaquinone을 거쳐 합성이 이루어지며 이후 아미노산 혹은 단백질과의 중합반응에 의해 최종적으로 멜라닌을 합성하게 된다. 본 실험에서 멜라닌 색소의 생합성 과정에서 tyrosinase가 L-dopa를 기질로 하여 초기 반응의 주요 과정을 촉진한다는 것을 이용하여 tyrosinase활성의 저해도를 측정하는 방법을 사용하였다. 현재 강한 미백 물질로 알려져 있는 kojic acid를 대조군으로 비교하였다.
- 본 실험에서 멜라닌 색소의 생합성 과정에서 tyrosinase가 L-dopa를 기질로 하여 초기 반응의 주요 과정을 촉진한다는 것을 이용하여 tyrosinase활성의 저해도를 측정하는 방법을 사용하였다. 현재 강한 미백 물질로 알려져 있는 kojic acid를 대조군으로 비교하였다. Tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과 Fig.
- 본 실험에서는 알콜대사 산물인 β-NADH의 양을 측정하여 효소활성을 측정하였다. 즉 기질인 에탄올이 조효소 NAD의 존재하에서 대사되면서 생성되는 NADH의 양을 340 nm에서 흡광도를 측정하여 ADH 활성을 측정하였다. Fig.
- 헤마토코커스로부터 아스타잔틴의 추출과 제형화의 유효성을 확인하고 적용성을 검토하고자 헤마토코커스 추출물과 아스타잔틴 포접화합물의 생리활성을 측정하였다. 그 결과, 헤마토코커스 추출물은 DPPH 라디칼 소거능, xanthine oxidase 저해 활성 및 hydroxyl 라디칼 소거능에 대해 in vitro 실험에서 활성을 나타냈다.
대상 데이터
- L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)는 Across Organics사 (NJ, USA)로부터 β-nicotinamide adenine dinucleotide (β-NAD)는 Fluka사 (Steinheim, Germany)로부터 구입하였다.
- Astaxanthin은 Sigma사 (MO, USA)의 제품으로서 순도 92% 이상의 것을 사용하였고, Haematococcus pluvialis cracked cell은 순도 1.5%의 Parry Nutraceutical사 (India)로부터 구입하였고, 포접화합물의 제조에 사용된 베타-싸이클로덱스트린 (β-cyclodextrin)은 Wako사 (Osaka, Japan)로부터 구입하여 사용하였다.
- 5%의 Parry Nutraceutical사 (India)로부터 구입하였고, 포접화합물의 제조에 사용된 베타-싸이클로덱스트린 (β-cyclodextrin)은 Wako사 (Osaka, Japan)로부터 구입하여 사용하였다. Xanthine과 xanthine oxidase, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), mushroom tyrosinase (25,000 U/mg), kojic acid, ethylenediaminetetraaceticacid(EDTA), 2-deoxyribose,trichloroacetic acid (TCA), bovine serum albumin (BSA), alcohol dehydrogenase (ADH)는 Sigma사 (MO, USA)의 제품을 구입하여 사용하였고, 4, 6-dihydroxy-2-mercapto-pyrimidine (TBA)은 Alfa Aesar사(MA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)는 Across Organics사 (NJ, USA)로부터 β-nicotinamide adenine dinucleotide (β-NAD)는 Fluka사 (Steinheim, Germany)로부터 구입하였다.
- L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)는 Across Organics사 (NJ, USA)로부터 β-nicotinamide adenine dinucleotide (β-NAD)는 Fluka사 (Steinheim, Germany)로부터 구입하였다. 항암활성에 사용한 cell counting kit-8 (CCK-8)은 Dojindo Molecular Technology사 (MD, USA) 제품을 사용하였다. 항암활성을 위한 MCF-7 세포주 (유방암), HeLa 세포주 (자궁경부암)는 한국세포주은행 (한국)으로부터 분양받았다.
- 항암활성에 사용한 cell counting kit-8 (CCK-8)은 Dojindo Molecular Technology사 (MD, USA) 제품을 사용하였다. 항암활성을 위한 MCF-7 세포주 (유방암), HeLa 세포주 (자궁경부암)는 한국세포주은행 (한국)으로부터 분양받았다.
- 항산화 측정 시료로는 합성 아스타잔틴 (astaxanthin)과헤마토코커스 추출물 (H. pluvialis extract) 및 이 두 물질을 베타-사이클로텍스트린으로 포접시킨 포접화합물 (As-β-CD 와 H.p.-β-CD)을 사용하였고, 대조군으로 지용성 항산화제인 알파-토코페롤을 사용하였다.
이론/모형
- Xanthine oxidase 저해활성 측정은 An 등 (2006)의 방법 [40]에 따라 측정하였다. 각 시료용액 0.
- DPPH radical 소거능은 Heo 등 (2006)의 방법 [41]에 따라 메탄올에 0.4 mM의 농도로 용해한 DPPH 용액 160 μL와 시료 40 μL를 첨가하여 암소에서 30분간 방치한 다음 microplate reader (VERSAmax, Molecular Device, CA, USA)를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Hydroxyl radical 소거능은 Kang 등 (2001)의 방법 [42]에 의해 측정하였다. 50 mM FeSO4 ․ 7H2O 20 μL와 50 mM의 EDTA 20 μL를 각각 넣고, 50 mM 2-deoxyribose 40 μL와 시료 40 μL를 첨가하였다.
- Tyrosinase 저해활성 측정은 Jeong 등 (2004)의 방법 [43]에 따라 측정하였다. 반응구는 0.
- 숙취해소활성은 Jeong 등 (2004)의 방법 [43]에 따라 기질인 ethanol이 조효소 NAD의 존재 하에서 대사되면서 생성되는 NADH 양을 340 nm에서 흡광도를 측정하여 alcohol dehydrogenase (ADH) 활성으로서 측정하였다. 우선 50 mM 인산완충용액 (pH 8.
성능/효과
- 8% TCA 200 μL와 50 mM NaOH에 용해한 1% TBA 200 μL를 첨가하여 100℃ 15분 동안 가열시키고, 얼음 속에서 급속히 냉각하여 530 nm에서 생성된 malondialdehyde (MDA)의 양을 측정하였다. Hydroxyl radical 소거능은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
- 포접화합물은 포접전의 약 50% 수준의 활성을 나타내는 것으로 나타났고, 1 μg/mL의 농도에서 포접화합물 As-β-CD와 H.p.-β-CD는 각각 70%와 50% 정도의 저해활성을 보였다 (Fig.
- (a)에서와 같이 헤마토코커스 추출물은 대조군인 알파-토코페롤과 비슷한 활성을 나타냈고, 반면 합성 아스타잔틴은 25 μg/mL 농도에서 15% 정도의 수준으로 낮은 활성을 보였다.
- 1). Xanthine oxidase 저해활성은 아스타잔틴의 항산화 활성으로 기존에 보고된 것은 아니지만, xanthine oxidase와 xanthine 의 반응에서 일어나는 라디칼 형성을 저해하는 원리로 아스타잔틴의 라디칼 소거능을 확인할 수 있었다. 포접화합물은 포접전의 약 50% 수준의 활성을 나타내는 것으로 나타났고, 1 μg/mL의 농도에서 포접화합물 As-β-CD와 H.
- 이 점은 기존에 보고되었던 베타카로틴과 아스타잔틴의 항산화 활성에 대한 비교 연구결과에서도 확인할 수 있었다 [48]. 포접화합물의 항산화 활성을 검토한 결과, 포접전의 아스타잔틴보다는 낮은 활성을 나타냈고, 이러한 결과는 아스타잔틴이 충분히 유리되지 않아 활성이 발현되지 않아 나타난 결과로 판단된다. 기존의 보고에서도 포접된 물질의 in vitro 측정시에는 물질의 반응시간을 길게 수행한 분석법에서 활성이 충분히 발현되는 것으로 나타났다 [49,50].
- Tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과 Fig. 4(a)에서 보는 바와 같이 모든 측정 농도에서 헤마토코커스 추출물이 대조군인 kojic acid보다 2배 이상의 활성을 나타내는 것으로 나타났다. Lee 등 (1999)의 연구에서 기존에 보고된 미백물질 박태기나무 추출물의 IC50값이 20-50 μg/mL인 것과 비교하여 헤마토코커스 추출물은 IC50값이 5 μg/mL 이하로 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다 [51].
- 본 연구에서는 일반적으로 사용되고 있는 유방암 세포주 (MCF-7), 자궁암 세포주 (HeLa)에 대해 아스타잔틴과 헤마토코커스 추출물의 항암활성을 측정하였다. 실험결과, 자궁암 세포주 (HeLa)에 대해서는 대조군인 5-fluorouracil (5-FU)과 비교하여 비슷하거나 높은 세포독성을 나타냈고, 유방암 세포주 (MCF-7)에 대해서는 대조군인 indol-3-carbinol (I3C)의 50% 수준으로 활성을 나타냈다 (Fig. 5(a)).
- 또한, 아스타잔틴과 싸이클로덱스트린의 포접화합물 As-β-CD와 헤마토코커스 추출물과 싸이클로 덱스트린의 포접화합물인 H.p.-β-CD의 생리활성을 조사한 결과, As-β-CD는 대조군인 지구자추출물보다 높은 숙취해소 효과를 나타냈고, H.p.-β-CD는 대조군인 kojic acid와 비슷한 수준의 미백효과를 나타냈다.
- 즉 기질인 에탄올이 조효소 NAD의 존재하에서 대사되면서 생성되는 NADH의 양을 340 nm에서 흡광도를 측정하여 ADH 활성을 측정하였다. Fig. 6에서 보는 바와 같이 대조군으로 사용된 지구자 추출물에 비해 1.5배 높은 숙취해소 효과를 나타냈으며 아스타잔틴 포접화합물의 경우에도 대조군으로 사용된 지구자 추출물에 비해 높은 활성을 보였고, 이는 포접 화합물 형성전과 비슷한 결과였다. 숙취해소 활성측정법의 경우 시료를 주입하고 25℃에서 충분히 예열시켜 주었다.
- 아스타잔틴과 포접화합물의 다양한 생리활성을 평가한 결과, 포접 후에도 생리활성을 나타내는 것을 볼 수 있었고, 포접의 특성상 장시간 반응이 이루어지는 평가에서 포접전과 비슷한 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 헤마토코커스로부터 아스타잔틴의 추출과 제형화의 유효성을 확인하고 적용성을 검토하고자 헤마토코커스 추출물과 아스타잔틴 포접화합물의 생리활성을 측정하였다. 그 결과, 헤마토코커스 추출물은 DPPH 라디칼 소거능, xanthine oxidase 저해 활성 및 hydroxyl 라디칼 소거능에 대해 in vitro 실험에서 활성을 나타냈다. 또한 헤마토코커스 추출물은 대조군인 kojic acid에 비해 동일한 농도에서 2배 이상의 미백활성을 나타냈고, 자궁암 세포주 (HeLa)에 대해 대조 항암물질인 5-fluorouracil (5-FU)과 비슷한 항암활성을 나타냈다.
- 그 결과, 헤마토코커스 추출물은 DPPH 라디칼 소거능, xanthine oxidase 저해 활성 및 hydroxyl 라디칼 소거능에 대해 in vitro 실험에서 활성을 나타냈다. 또한 헤마토코커스 추출물은 대조군인 kojic acid에 비해 동일한 농도에서 2배 이상의 미백활성을 나타냈고, 자궁암 세포주 (HeLa)에 대해 대조 항암물질인 5-fluorouracil (5-FU)과 비슷한 항암활성을 나타냈다. 아스타잔틴은 또한 숙취해소 효과를 갖고 있는 것으로 확인되었는데, 대조군인 지구자 추출물에 비해 1.
- 또한 헤마토코커스 추출물은 대조군인 kojic acid에 비해 동일한 농도에서 2배 이상의 미백활성을 나타냈고, 자궁암 세포주 (HeLa)에 대해 대조 항암물질인 5-fluorouracil (5-FU)과 비슷한 항암활성을 나타냈다. 아스타잔틴은 또한 숙취해소 효과를 갖고 있는 것으로 확인되었는데, 대조군인 지구자 추출물에 비해 1.5배 높음을 알 수 있었다. 또한, 아스타잔틴과 싸이클로덱스트린의 포접화합물 As-β-CD와 헤마토코커스 추출물과 싸이클로 덱스트린의 포접화합물인 H.
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