선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 자연 지향적이고 환경 친3会적인 국내 소비추세에 따라이미 쇠비름 추출액을 이용한 미백, 항노화 화장품이 출시되고 있으며 항균 활성(17), collagen 형성으로 인한 상처치유 능력(7, 18, 19), tyrosine에서 DOPA로의 전환을 도와 melanin 형성에 기여하는 핵심 enzyme인 tyrosinase의활성을 억제하여 미백에 기여한다(12, 15, 20)는 보고가있다 이에 따라 본 실험에서는 쇠비름 추출물의 NF-kB 활성 조절을 통한 항염증 효과와 collagen 합성 촉진에 의한 노화 방지 효과를 확인하였고 tyrosinase mRNA 합성억제를 통한 미백 작용 기전을 검증하고자 하였다.
- 이에따라 TNF-a에 의한 NF-kB의 활성화 과정에 쇠비름 추출액이 어떤 영향을 미치는지 확인하였다. TNF-a가 세포를사멸시키지 않으면서 염증을 유발한다고 알려져 있는 농도인 40 ng/mL의 농도(18)가 본 실험에서도 가장 적절한 농도로확인되어 이 농도로 실험을 진행하였다(data not shown).
- 본 연구에서는 몇 가지 생물공학 기반 기술로서 이미한방 화장품의 소재로 사용되고 있는 쇠비름 에탄올 추출액의 tyrosinase 저해, collagen 합성, 항염증 기대 효과, 항노화 대한 효능을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma cell, NIH3T3 mouse embryonic fibroblast, MCF-7 human breast adenocarcinoma cell에 쇠비름 추줄액을 처리하여 실험하였다. 실험 결과, 쇠비름 에탄올추출액 (0.
제안 방법
- 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 1 X MTT (3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)가첨가된 배지를 세포에 처리하여 5% C6와 90%의 습도 37℃가 일정하게 유지되는 배양기에서 10~15분 동안 세포를 배양 후 배지를 버리고 DMSO (Sigma)로 세포를 용해시켜 ELISA reader (Molecular Devices, USA)를 이용흐H 570 nm에서 O.D. 값을 측정하였다
- B16F10 mouse melanoma 세포주를 6-well plate 에 4 x lW/well 개로 접종하여 24시간 배양하고 배지를 제거한 후 각각의 well에 시료가 함유된 배지를 처리한 후 5% CO2와 90%의 습도 37℃가 일정하게 유지되는 배양기에서 2일 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포는 PBS buffer로 2~3회 세척한 후 RIPA lysis buffer를 첨가하고 4℃ 에서 30분간 lysis 시킨 후 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다.
- 단백질 농도 정량은 Bradford법을 이용하였으며 40 熙의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 변성 분리하고, nitrocellulose transfer membrane (Whatman, Germany) 에 150 mV로 1시간 동안 transfer 하였다. Tyrosinase 항체는 Santa Cruz사 (USA) 의 제품을 5% skim milk가 함유된 IX TBST에 1 : 1000으로 희석하여 반응시켰고, 순차적으로 1차 항체 및 2차 항체를 처리한 후 ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, USA)를 사용하여 발광시킨 후 film 을 이용하여 현상하였다.
- NIH3T3 mouse embryonic fibroblasts (wild ty戏e)를 6-well plate에 4 x 104/well 개로 접종하여 24시간 배양하고 배지를 제거한 후 각 well에 시료가 함유된 배지를 첨가하여 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 5% FBS가함유된 배지로 교체하여 24시간 배양하고, 배양 상등액을수집 한 후 단백질 함량을 Bradford기법으로 측정하였다 Collagen assay kit (Biocolor, UK) 따라 100 gL씩 단백질은첨가한 튜브에 Sircol Dye 1 mL/sample로 첨가하여 30분동안 교반 한 후 12,000 rpm, 10분 동안 원심분리하였다.
- 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 5% FBS가함유된 배지로 교체하여 24시간 배양하고, 배양 상등액을수집 한 후 단백질 함량을 Bradford기법으로 측정하였다 Collagen assay kit (Biocolor, UK) 따라 100 gL씩 단백질은첨가한 튜브에 Sircol Dye 1 mL/sample로 첨가하여 30분동안 교반 한 후 12,000 rpm, 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리를 통해 얻어진 pellet을 10분 동안 건조시킨 다음 alkali reagent를 1 mL/sample로 첨가하여 pellet을 완전히 용해시킨 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하고 시료마다 collagen 함유량을 계산하였다
- 배지를 제거한 후 5% FBS가함유된 배지로 교체하여 24시간 배양하고, 배양 상등액을수집 한 후 단백질 함량을 Bradford기법으로 측정하였다 Collagen assay kit (Biocolor, UK) 따라 100 gL씩 단백질은첨가한 튜브에 Sircol Dye 1 mL/sample로 첨가하여 30분동안 교반 한 후 12,000 rpm, 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리를 통해 얻어진 pellet을 10분 동안 건조시킨 다음 alkali reagent를 1 mL/sample로 첨가하여 pellet을 완전히 용해시킨 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하고 시료마다 collagen 함유량을 계산하였다
- TNF-a에 의한 NF-kB 활성 측정 실험을 위해서 PNF-k B-luc vector (Panomics, USA) 유전자가 영구 삽입된 NIH3T3/NFkB-Luc mouse embryonic fibroblasts를 사용하였다. 각각의 시료가 함유된 배지에 NIH3T3/NFkB-Luc mouse embryonic fibroblasts를 24시간 배양 후, PBS solution으로 2회 세척한 다음 lx lysis reagent (Sigma)를첨가하여 4℃ 에서 5분 동안 배양시켰다.
- 5일간 배양하였다. 배양된 세포를 PBS solution 으로 2회 세척하고 1 X fixative solution (BioVision, USA) 로 15분 동안 세포를 고정시킨 다음, x-gal (Sigma)로 24시간 동안 염색시키고 PBS solution으로 세척하였다 노화된세포수는 ><400배율의 광학현미경 (Olympus, Japan)으로측정하였다
- 쇠비름 알코올 추출물의 tyrosinase 합성 저해 효과를실험하기에 앞서, 쇠비름 알코올 추출물의 B16F10 mouse melanoma 세포주에 대한 독성을 측정하였다. 대조군으로사용한 a-MSH와 arbutine 세포독성을 나타내지 않았으며각 시료를 농도별(Fig.
- IB). 위의 결과에 의거하여 a-MSH와 arbutine 세포독성이 없는 적정 농도에서, 쇠비름 추출액은 2 mg/mL 농도에서 최대 배양 시간을 2일로 실험하였다.
- 섬유다발을 형성한다. 이들은 피부 부속기관들과상피 진피에서 망상 조직을 형성하며 노화의 가장 뚜렷한척도라 할 수 있는 주름 형성을 억제하는데 관여하므로(21), 본 실험에서는 NIH3T3 mouse fibroblast 세포주를 사용하여 다양한 농도에서 collagen 합성 정도를 측정하였다 Collagen assay를 위해 사용한 kit의 dye reagent는 모든유형의 collagen [Gly-X-Y] 특정 잔기에 결합함으로써 collagen의 합성 정도를 측정할 수 있다. NIH3T3 세포에서쇠비름 추출액의 독성을 검사한 결과, 0.
- 이에따라 TNF-a에 의한 NF-kB의 활성화 과정에 쇠비름 추출액이 어떤 영향을 미치는지 확인하였다. TNF-a가 세포를사멸시키지 않으면서 염증을 유발한다고 알려져 있는 농도인 40 ng/mL의 농도(18)가 본 실험에서도 가장 적절한 농도로확인되어 이 농도로 실험을 진행하였다(data not shown). 이미 항염증제로 알려진 목단피 (肱 cortex, 2.
- NIH3T3/NFkB-Luc mouse embryonic fibroblast cells were treated with M. cortex (2.5 x 104 mg/mL), P. oleracea (2 mg/mL) and TNF-α (40 ng/mL) alone or their combinations for 24 h, which were then examined for activation of NF-kB by monitering luciferase activities as described in Materials and Methods.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 쇠비름과 목단피 (Moutan cortex)는경동시장 동의보감에서 구입하였고 추출액은 건조 상태의쇠비름을 분쇄하여 80%의 ethanol, 60℃ 에서 4일 동안진탕 배양하여 준비하였다. 상등액을 취하여 동결건조 한후 분말을 수득하였으며 pH를 보정하기 위해 이를 PBS buffer에 용해 시켰다.
- 그 후 filtration 시켜 용액을 본 실험에서 사용하였다. 실험에 사용된 a-melanocyte stimulating hormone (a-MSH), arbutin, L-ascorbic acid, doxolubicin 은 Sigma (USA) 로부터, Collagen assay kit는 Biocolor (UK), MTT assay kit는 Promega (USA), TNF-a는 R&D Systems (USA) 로부터 각각 구입하여 사용하였다
- 본 실험에 사.용한 B16F10 mouse melanoma cells, NIH3T3 mouse embryonic fibroblast cells, MCF-7 human breast adenocarcinoma cellse 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS, Invitrogen, USA), 1% penicillin (WelGENE, Korea)을 첨가한 DMEM (WelGENE) 배지를 사용하여 5%의 CO와 90%의 습도, 37℃가 일정하게 유지되는 배양기에서 배양하였다.
- 시료가 함유된 배지에 MCF7 human breast adenocarcinoma 세포주를 5일간 배양하였다. 배양된 세포를 PBS solution 으로 2회 세척하고 1 X fixative solution (BioVision, USA) 로 15분 동안 세포를 고정시킨 다음, x-gal (Sigma)로 24시간 동안 염색시키고 PBS solution으로 세척하였다 노화된세포수는 ><400배율의 광학현미경 (Olympus, Japan)으로측정하였다
이론/모형
- 배양이 끝난 세포는 PBS buffer로 2~3회 세척한 후 RIPA lysis buffer를 첨가하고 4℃ 에서 30분간 lysis 시킨 후 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 단백질 농도 정량은 Bradford법을 이용하였으며 40 熙의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 변성 분리하고, nitrocellulose transfer membrane (Whatman, Germany) 에 150 mV로 1시간 동안 transfer 하였다. Tyrosinase 항체는 Santa Cruz사 (USA) 의 제품을 5% skim milk가 함유된 IX TBST에 1 : 1000으로 희석하여 반응시켰고, 순차적으로 1차 항체 및 2차 항체를 처리한 후 ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, USA)를 사용하여 발광시킨 후 film 을 이용하여 현상하였다.
- 0 mg/mL) for 1 to 5 days. Analysis of cytotoxicity was carried out using the MTT assay as described in Materials and Methods.
성능/효과
- 0 mg/mL 농도의 쇠비름 주줄 액은 목단피보다 더욱 효과적으로 cytokine (TNF-a)에 의한 NF-kB 활성을 억제시켰다. Doxorubicin 에 의한 과 노화에서도 효과적인 항노화 작용을 하는 것으로 나타났다. Tyrosinase 합성을 억제하므로 미백에 대한효과와 세포의 생장을 도와 collagen 합성을 촉진함으로서노화방지에 효과적인 것으로 사료되며, TNF-a에 의한 NF-kB의 활성화를 저해함으로서 염증반응 억제 효과도기대 할 수 있다
- 대조군으로사용한 a-MSH와 arbutine 세포독성을 나타내지 않았으며각 시료를 농도별(Fig. 1A) 시간별로 (data not shown) 처리하고 MTT assay로 분석한 결과, 사용한 실험조건에서는세포 독성이 없는 것으로 확인되었다. 또한, 저농도에서배양기간은 무관하였으나 1 mg/mL 이상의 농도에서는 2일째부터 생존율이 60% 이상 감소하는 것으로 확인되었다 (Fig.
- 1A) 시간별로 (data not shown) 처리하고 MTT assay로 분석한 결과, 사용한 실험조건에서는세포 독성이 없는 것으로 확인되었다. 또한, 저농도에서배양기간은 무관하였으나 1 mg/mL 이상의 농도에서는 2일째부터 생존율이 60% 이상 감소하는 것으로 확인되었다 (Fig. IB). 위의 결과에 의거하여 a-MSH와 arbutine 세포독성이 없는 적정 농도에서, 쇠비름 추출액은 2 mg/mL 농도에서 최대 배양 시간을 2일로 실험하였다.
- PKA 신호전달경로를 경유하여 멜라닌 합성을 유도하는 것으로 알려진 a-MSH (0.3 mg/mL)와 멜라닌 생성 저해제인 arbutin (1 x 1* 0 mg/mL)을 쇠비름 추출액 (0.5 mg/mL) 과 함께 처리하여 2일간 배양한 결과 tyrosinase 발현에영향을 주는 것을 확인할 수 있었다RFigs. 2A, 2B).
- 2A, 2B). 대조군에 비해 쇠비름 추출액을 처리한 경우 tyrosinase 발현이 약 80% 감소하였고 a-MSH를 처리한 경우 보다는 약 82%가 억제되는 것으로 나타났다. 미백제로서 상당한 효과가 있는 것으로 알려져 있는 arbutin에 비해 쇠비름 추출액의 미백효과가 40% 정도 더 있는 것으로 나타났다.
- 대조군에 비해 쇠비름 추출액을 처리한 경우 tyrosinase 발현이 약 80% 감소하였고 a-MSH를 처리한 경우 보다는 약 82%가 억제되는 것으로 나타났다. 미백제로서 상당한 효과가 있는 것으로 알려져 있는 arbutin에 비해 쇠비름 추출액의 미백효과가 40% 정도 더 있는 것으로 나타났다. 반면, TYRP-1과 DCT 활성에도 영향을 미칠 것이라는 예상과는 달리 이들 단백질의 발현에는 변화가 거의 없었다.
- 이들은 피부 부속기관들과상피 진피에서 망상 조직을 형성하며 노화의 가장 뚜렷한척도라 할 수 있는 주름 형성을 억제하는데 관여하므로(21), 본 실험에서는 NIH3T3 mouse fibroblast 세포주를 사용하여 다양한 농도에서 collagen 합성 정도를 측정하였다 Collagen assay를 위해 사용한 kit의 dye reagent는 모든유형의 collagen [Gly-X-Y] 특정 잔기에 결합함으로써 collagen의 합성 정도를 측정할 수 있다. NIH3T3 세포에서쇠비름 추출액의 독성을 검사한 결과, 0.1 mg/mL 농도에서는 대조군과 차이가 없는 반면, 0.5 ~2.0 mg/mL 농도에서 세포 증식에 도움을 주는 것으로 나타났다(Fig. 3A). 이미 collagen 합성에 기여하는 것으로 알려진 L-ascorbic acid (0.
- 3B). 반면 2.0 mg/mL 농도에서는 L-ascorbic acid보다 collagen 합성을 약 15% 촉진 시키는 결과를 나타내므로 쇠비름 추출액이 NIH3T3 mouse fibroblast 세포의생장에 영향을 주며 모교원질 생성을 촉진함으로써 주름생성 억제 효과가 있는 것으로 사료된다.
- TNF-a가 세포를사멸시키지 않으면서 염증을 유발한다고 알려져 있는 농도인 40 ng/mL의 농도(18)가 본 실험에서도 가장 적절한 농도로확인되어 이 농도로 실험을 진행하였다(data not shown). 이미 항염증제로 알려진 목단피 (肱 cortex, 2.5 x 104 mg/mL) 를 positive control로 사용하였다 쇠비름 (2 mg/mL) 을 처리후 24시간 배양한 다음 luciferin 반응을 측정한 결과, 목단피의 경우 TNF-a에 의한 NF-kB의 활성이 50% 감소한 반면 쇠비름의 경우 77%가량 억제되는 것을 확인할수 있었다(Fig. 4).
- 25 mM)를 positive control로 사용하였다(23). 쇠비름 추출액 (2 mg/mL)을 NIH3T3 mouse fibroblasts에 처리한 후 5일 동안 배양한결과 collagen 합성을 촉진하여 노화를 억제하는 L-ascorbic acid 만큼 2 mg/mL 농도의 쇠비름 추출액에서 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 5). 정상 상태인 NIH3T3 mouse fibroblasts 에서는 쇠비름 추출액의 효과가 큰 반면, 과노화 상태의세포에서는 쇠비름 추출액과 L-ascorbic acid의 효과가비슷하였다.
- 처리하여 실험하였다. 실험 결과, 쇠비름 에탄올추출액 (0.5mg/mL)은 tyrosinase 발현을 억제하여 멜라닌합성을 억제하며, 농도 冒존적으로 NIH3T3 mouse fibroblast 세포의 collagen 합성을 촉진시켰다. 또한 2.
- 5mg/mL)은 tyrosinase 발현을 억제하여 멜라닌합성을 억제하며, 농도 冒존적으로 NIH3T3 mouse fibroblast 세포의 collagen 합성을 촉진시켰다. 또한 2.0 mg/mL 농도의 쇠비름 주줄 액은 목단피보다 더욱 효과적으로 cytokine (TNF-a)에 의한 NF-kB 활성을 억제시켰다. Doxorubicin 에 의한 과 노화에서도 효과적인 항노화 작용을 하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 지금까지의 화장품에 있어식물 추출물은 피부 노화 억제에 대한 연구가 가장 많은부분을 차지하고 있으며, 그 외 항균 탈모, 세정, 자외선차단에 대한 연구가 활발히 진행되었으며 현재 많은 제품에적용되고 있다(1, 2). 따라서 천연 및 유기농 원료와 화장품에 대한 범국가적이며 신뢰성 있는 인증제도가 강화되어야 하며, 이에 근거가 되는 천연 주줄 물의 효능 검증 연구가 보다 체계적이고 엄격히 이루어져야 할 것이다.
- 정상 상태인 NIH3T3 mouse fibroblasts 에서는 쇠비름 추출액의 효과가 큰 반면, 과노화 상태의세포에서는 쇠비름 추출액과 L-ascorbic acid의 효과가비슷하였다. 쇠비름 추출액이 tyrosinase 활성을 억제하여미백효과를 나타냄과 더불어 세포의 생장에 도움을 주어 collagen 생성 촉진을 통해 노화 방지에 효과가 있는 것으로사료되며 화장품 원료로서의 활용 가치도 있다고 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.