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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 초대 배양한 사람의 혈관 내피 세포 (HUVEC)에서 CAMs 발현을 유도하는 염증성 종양 괴사인자인 TNF-a에 의한 혈관염증을 WK-38 추출물이 차단할 수 있는지를 세포의 유주에 관여하는 부착분자인 ICAM-1, VCAM-1, 그리고 E-selectin의 발현 정도를 그 지표로서 실험하였다. 또한 내피세포와 단핵구의 부착율 및 관련 신호전달인자의 비교를 통해 항염증작용에 대한 WK-38 추출물이 미치는 영향에 대해 연구하였다.
- 본 연구는 사람 혈관 내피 세포주인 HUVEC에서 WK-38 추출물이 이러한 죽상경화의 초기과정에서 TNF-a에 의한 CAMs 발현과 NF-kB 활성에 미치는 효과에 대해 조사하였다. TNF-a 처리에 의하여 증가된 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 발현은 WK-38 추출물 전처리에 의해 농도 의존적으로 감소되었다.
- NF-kB는 세포질 속에 p50과 p65의 hetero dimer와 저해제인 iKB-a와 함께 불활성형으로 존재하다 cytokine 같은 염증성 자극에 의해 IkB가 분해되면, NF-kB는 활성화된 후 핵으로 이동하여 염증발현을 유도하는 유전자의 발현을 촉진시켜 염증반응을 일으킨다31,32). 본 연구에서는 WK-38 추출물이 염증 조절인자인 NF-kB의 활성화에 어떠한 영향을 미치는지에 대해 알아보았다. 그 결과, TNF-a 처리는 핵 내의 NF-kB p65 단백질 양을 증가시켰으나 WK-38 추출물 전처리에 의해 억제되는 것으로 나타났다.
- 사람 혈관 내피세포에서는 VCAM-1 이나 ICAM-1과 같은 세포에서 선택적으로 발현하는 다양한 세포부착분자를 통해서 단핵구와 결합한다찌. 이에 본 실험에서는 WK-38 추출물이 TNF-a로 유도된 단핵구의 세포 부착에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 TNF-a에 의해 유도된 단핵구의 세포 부착이 WK-38 추출물에 의해 감소됨이 나타났다.
- 혈관 염증은 혈관에 염증이 발생하여 혈관내경이 좁아지고 조직의 허혈 및 괴사를 초래하는 질환으로 크기, 위치 및 형태에 관계없이 모든 혈관을 침범하여 다양한 증상을 나타낸다고 보고되어 있다I》. 이에 본 실험에서는 사람의 혈관 내피 세포주인 HUVEC에서 대표적인 pro-inflammation인 TNF-a에 의해 유도된 CAMs 발현에 대한 WK-38 추출물의 영향을 조사하였다 23-25). TNF-a (10 ng/ml) 처리에 의하여 증가된 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 발현이 WK-38 추출물 전처리에 의해 농도 의존적으로 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.
제안 방법
- HUVEC에 WK-38 추출물을 농도별로 18 시간 동안 전 처리한 후 6 시간 동안 염증유발 인자인 TNF-a를 최종농도 10 ng/ml이 되도록 가하여 배양하였다. 이를 이용하여 WK-38 추출물의 항염증 효과를 입증하기 위해 cell based ELISA를 수행하였다.
- 05 M Citrate-phosphate buffere] O-phenylenediamine (Sigma, USA)과 2 pl H2O2가 포함된 peroxidase substrate 발색용액을 각 well에 100 μ1씩 넣어 반응 시킨 후 반응을 중지시키기 위해 2 N H2SO4 용액을 100μl씩 넣어주었다. ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 발현 정도는 microplate reader (Bio-Tek Instrument Inc., Winooski, Vermont, USA)를 사용하여 490 nm 파장으토 측정하였다.
- 되도록 가하여 6 시간 배양하였다. U937 세포는 culture dish에서 10% FBS가 함유된 RPMI 1640배지로 배양한 후 10 pM 2z7-bis(2-carboxyethyl)-5(6) -carboxyfluorescein acetoxymethylester (BCECF-AM, Sigma, USA) 으로 1시간 동안 염색하였다 그 후 PBS로 3회 세척하였고 염색된 U937 세포를 혈관 내피 세포와 함께 1시간 배양시킨 후 부착되지 않은 U937 세포를 제거하기 위하여 3회 세척하였다. 혈관 내피 세포에 부착된 U937 세포는 Fluorescence microscopy를 사용하여 측정하였다 또한 측정한 후 0.
- WK-38과 TNF-a가 처리된 세포를 PBS로 2회 세척한 후 세포를 모아 원심 분리하여 상층액을 제거 하였다. 이 세포에 buffer A [10 mM HEPES-KOH, pH 7.
- WK-38과 TNFa가 처리된 세포를 PBS로 2회 세척하고, RIPA buffer로 세포를 용해하여 단백질을 추출하였다. 단백질 정량은 Bradford (Bio-Rad, USA)법을 이용하여 단백질의 동량을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophores을 10% 단백 SDS-PAGE) 로 전기 영동하여 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 transfer하였다.
- WK-38에 의한 VCAM-1, ICAM-L 그리고 E-selectin 발현의 억제가 전사수준에서 일어나는지를 확인하기 위하여 HUVEC에 WK-38 추출물을 농도별로 18 시간 동안 전 처리한 후 6 시간 동안 염증유발인자인 TNF-a를 최종농도 10 ng/ml이 되도록 가하여 배양하였다. 염증유발인자인 TNF-q 에 의한 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin mRNA 발현을 보기 위하여 real-time qRT・PCR으로 발현 정도를 측정하였다.
- 5 mM dNTP, 1 μl의 M-MLV enzyme에 ddHQ을 넣어 최종 부피가 20 μl가 되도록 만들고 42 ℃ 에서 1 시간 반응시킨 후 80C에서 15 분간 가열하여 cDNA를 합성하였다 합성된 cDNA을 이용하여 real-time qRT-PCR을 실시하였다. cDNA와 10 μl의 SYBR Green PCR Master Mix (Invitrogenz USA), 각각의 forward, reward primer를 1 μl씩 ddHQ와 함께 최종 부피가 20 μl가 되도록 한 후 Opticon을 이용하여 PCR을 수행하였다 (MJ Research instrument CAZ USA). PCR 조건은 95℃에서 10 분 denaturation® 후, 95℃에서 20 초, 60℃에서 30 초, 72 ℃ 에서 60 초를 40 cycle 반복하였다.
- PCR 조건은 95℃에서 10 분 denaturation® 후, 95℃에서 20 초, 60℃에서 30 초, 72 ℃ 에서 60 초를 40 cycle 반복하였다. 각 실험은 Opticon MJ Research instrument Software을 사용하여 분석하였고, 얻어진 데이터는 GAPDH의 발현량을 이용하여 각 유전자의 발현량을 분석하였다.
- 결과적으로, 이 실험에서는 TNF-a로 유도된 HIWEC에서의염증 반응에서 WK-38 추출물의 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin과 같은 CAMs 발현 및 NF-kB 활성에 대해 어떠한 영향을 미치는지 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. WK-38 추출물은 TNF-a로 유도된 CAMs 발현과 p65 NF-kB 활성을 저해함을 보였다.
- 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)]를 넣어 15 초간 vortexing한 후 ice에서 15 분간 두었다. 그 후 12,000 rpm에서 5 분간 원심 분리하여 세포질의 단백질이 포함되어있는 상층액을 tube 에 옮겨 -70 ℃ 에서 보관하고, pell머에 buffer B [20 mM HEPES, pH 7.9, 25% glycerol, 0.42 M NaClz 1.5 mM MgCl2/ 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 0.2 mM PMSF, protease inhibitor cocktail]을 넣고 10 초간 vortexing한 후 매 10 분마다 3회 vortexing 하였다. 그 후 12, 000rpm에서 10 분간 원심 분리하여 핵단백질 부분을 포함하는 그 상층액을 새로운 tube에 옮겨 -7 0℃에서 보관하였다.
- 비특이적 antibody 결합을 방지하기 위해 membrane을 5% skim milk가 함유된 Ttis-buffered saline (TBS) 용액에 상온에서 1시간 동안 blocking하였다 Blocking된 membrane을 1:1000으로 희석한 각 타겟 단백질의 1 차 antibody로 2 시간 이상 처리하였다. 그 후 TBS-Tween 20으로 3회 세척한 다음 1:2000으로 희석시킨 2차 antibody를 상온에서 1시간 반응시키고 TBS-tween 20으로 3회 세척한 후 ECL solution을 반응시켜 발현 정도를 Chemidoc image analyzer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 측정 후 정량하였다.
- cDNA 합성을 위해 1 ng의 RNA와 1 μl의 Oligo(dt) primer을 ddH?O와 섞은 후 70℃에 10 분간 반응시킨 후 ice에 5 분간 냉각시켰다. 그 후 반응액을 4 μl의 5X M-MLV buffer, 2 μ1 의 0.1 M DTT, 1 μl의 2.5 mM dNTP, 1 μl의 M-MLV enzyme에 ddHQ을 넣어 최종 부피가 20 μl가 되도록 만들고 42 ℃ 에서 1 시간 반응시킨 후 80C에서 15 분간 가열하여 cDNA를 합성하였다 합성된 cDNA을 이용하여 real-time qRT-PCR을 실시하였다. cDNA와 10 μl의 SYBR Green PCR Master Mix (Invitrogenz USA), 각각의 forward, reward primer를 1 μl씩 ddHQ와 함께 최종 부피가 20 μl가 되도록 한 후 Opticon을 이용하여 PCR을 수행하였다 (MJ Research instrument CAZ USA).
- 볼 수 있다. 그러므로 WK-38에 의한 백혈구 부착의 변화 정도를 알아보기 위하여 WK-38 추출물을 전 처리한 후 형광 현미경을 이용하여 부착 여부를 촬영하고 정량화하였다. 그 결과 Fig.
- 효능 면에서 대황, 후박, 목단피 각각에 대한 항염증작용, 항산화 작용 등이 보고되었으나 항염증 작용이 뛰어난 이 세 가지 한약재 복합물의 항염증 작용에 관한 연구는 아직 보고되지 않았다. 그러므로 본 연구에서는 초대 배양한 사람의 혈관 내피 세포 (HUVEC)에서 CAMs 발현을 유도하는 염증성 종양 괴사인자인 TNF-a에 의한 혈관염증을 WK-38 추출물이 차단할 수 있는지를 세포의 유주에 관여하는 부착분자인 ICAM-1, VCAM-1, 그리고 E-selectin의 발현 정도를 그 지표로서 실험하였다. 또한 내피세포와 단핵구의 부착율 및 관련 신호전달인자의 비교를 통해 항염증작용에 대한 WK-38 추출물이 미치는 영향에 대해 연구하였다.
- WK-38은 전탕 추출법을 이용하여 제조하였다. 대황, 후박, 목단피 각 100 g을 증류수 2.5 L에 넣고 냉각기가 설치된 삼각플라스크에 넣은 후 120 분간 가열하였다. 추출액을 3, 000 rpm으로 30 분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 회전식 증발기로 감압 농축한 후 동결 건조하여 추출물 45 g (수득율 15%)의 분말을 얻었다.
- 본 연구에서는 부작용 없이 탁월한 약리작용을 보이는 대황, 후박, 목단피의 한약리학적 효능에 착안하여 초대 배양한 사람의 혈관 내피 세포에서 WK-38 추출물을 전 처리한 후 TNF-a로 염증을 유발하고 대조군과 처리군을 비교함으로서 항염증 효능을 알아보았다. 혈관 염증은 혈관에 염증이 발생하여 혈관내경이 좁아지고 조직의 허혈 및 괴사를 초래하는 질환으로 크기, 위치 및 형태에 관계없이 모든 혈관을 침범하여 다양한 증상을 나타낸다고 보고되어 있다I》.
- 배양하였다. 염증유발인자인 TNF-q 에 의한 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin mRNA 발현을 보기 위하여 real-time qRT・PCR으로 발현 정도를 측정하였다. 그 결과, 단백질 발현과 마찬가지로 TNF-a 처리에 의하여 증가된 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 mRNA 발현이 WK-38 추출물 전처리에 의해 감소하는 경향을 보여주었다(Fig.
- 되도록 가하여 배양하였다. 이를 이용하여 WK-38 추출물의 항염증 효과를 입증하기 위해 cell based ELISA를 수행하였다. 그 결과, TNF-a에 의한 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin 의 발현 증가는 150 iig/ml와 200 ug/ml WK-38 추출물의 전처리에 의해서 유의성 있게 감소됨을 보였다(Fig.
- 혈관 내피 세포를 24 well에 4xl06 cells/well로 분주한 후세포가 70% 정도 자라면 serum free Medium (M200)과 함께 WK-38을 농도별로 18 시간 전처리 후 TNFp를 최종농도 10 ng/mlO] 되도록 가하여 6 시간 배양하였다. U937 세포는 culture dish에서 10% FBS가 함유된 RPMI 1640배지로 배양한 후 10 pM 2z7-bis(2-carboxyethyl)-5(6) -carboxyfluorescein acetoxymethylester (BCECF-AM, Sigma, USA) 으로 1시간 동안 염색하였다 그 후 PBS로 3회 세척하였고 염색된 U937 세포를 혈관 내피 세포와 함께 1시간 배양시킨 후 부착되지 않은 U937 세포를 제거하기 위하여 3회 세척하였다.
- 혈관 내피 세포를 96 well에 cells/well로 분주한 후세포가 70% 정도 자라면 serum free Medium 200과 힘께 WK-38을 농도별로 18 시간 동안 전처리하고, TNF-ct를 최종농도 10 ng/ml이 되도록 가하여 6 시간 더 배양하였다. 배양 후, 1% paraformaldehyde로 1시간 고정하고 1% BSA가 함유된 PBS를 well 당 200 μ1씩 넣고 1시간 동안 상온에서 blocking하였다.
- U937 세포는 culture dish에서 10% FBS가 함유된 RPMI 1640배지로 배양한 후 10 pM 2z7-bis(2-carboxyethyl)-5(6) -carboxyfluorescein acetoxymethylester (BCECF-AM, Sigma, USA) 으로 1시간 동안 염색하였다 그 후 PBS로 3회 세척하였고 염색된 U937 세포를 혈관 내피 세포와 함께 1시간 배양시킨 후 부착되지 않은 U937 세포를 제거하기 위하여 3회 세척하였다. 혈관 내피 세포에 부착된 U937 세포는 Fluorescence microscopy를 사용하여 측정하였다 또한 측정한 후 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS)가 함유된 Tris-HCl (pH 8.0)으로 세포를 용해시켜 spectrofluorometer (Varioskan, Thermo Electron Co., Vantaa, Finland) 를 사용하여 485 nm excitation 와 535 run emission의 파장으로 부착율을 측정하였다.
대상 데이터
- Human monocytic leukemic cells인 U937 단핵구 세포주는 American type culture collection (ATCC) (Bethesda, MD, USA)로부터 구입하여 10% FBS가 포함되어 있는 RPMI 1640 (GIBCO, USA)에서 37℃, 5% CO2의 공기 상태로 배양하였다.
- 인간 혈관 내피 세포 (Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)는 Cascade Biologies (Portland Oregon, USA)로부터 구입하였고 구입 즉시, LSGS가 포함되어 있는 Medium 200에서 37℃, 5% CO2의 공기 상태로 배양하였다. Human monocytic leukemic cells인 U937 단핵구 세포주는 American type culture collection (ATCC) (Bethesda, MD, USA)로부터 구입하여 10% FBS가 포함되어 있는 RPMI 1640 (GIBCO, USA)에서 37℃, 5% CO2의 공기 상태로 배양하였다.
데이터처리
- 실험 성적의 분석은 각 실험군 간의 평균치와 표준편차로 표시하였고 통계 처리는 studenfs t-test를 이용하여 각 실험군간의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 1). Cell-based ELISA 결과를 바탕으로 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin2] 단백질 발현을 Western blotting으로 측정하였다. 그 결과, TNF- a에 의해 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 발현이 유의성 있게 증가하였으나, 150 iig/ml와 200 pg/ml WK-38 추출물 의전처리로 인하여 발현이 감소됨을 나타내었다(Fig.
- WK-38 추출물이 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin 발현을 억제시키는 데 있어 관여할 수 있는 혈관염증 전사인자인 NF-kB와의 관련성을 알아보기 위하여 핵과 세포질 단백질을 각각 추출한 후 western blotting을 수행하였다. 그 결과, TNF-ci를단독 처리했을 때 핵 부분의 p65 NF-kB의 발현이 유의성 있게 증가하였고, 이는 NF-kB 가 세포질에서 핵 부분으로 translocation이 되었으며 활성화되었음을 보여준 것이다.
- WK-38은 전탕 추출법을 이용하여 제조하였다. 대황, 후박, 목단피 각 100 g을 증류수 2.
- buffer로 세포를 용해하여 단백질을 추출하였다. 단백질 정량은 Bradford (Bio-Rad, USA)법을 이용하여 단백질의 동량을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophores을 10% 단백 SDS-PAGE) 로 전기 영동하여 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 transfer하였다. 비특이적 antibody 결합을 방지하기 위해 membrane을 5% skim milk가 함유된 Ttis-buffered saline (TBS) 용액에 상온에서 1시간 동안 blocking하였다 Blocking된 membrane을 1:1000으로 희석한 각 타겟 단백질의 1 차 antibody로 2 시간 이상 처리하였다.
성능/효과
- 이에 본 실험에서는 사람의 혈관 내피 세포주인 HUVEC에서 대표적인 pro-inflammation인 TNF-a에 의해 유도된 CAMs 발현에 대한 WK-38 추출물의 영향을 조사하였다 23-25). TNF-a (10 ng/ml) 처리에 의하여 증가된 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 발현이 WK-38 추출물 전처리에 의해 농도 의존적으로 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 세포 수준에서의 단백질 양 및 mRNA의 양을 측정하기 위해 western blot 및 real-time qRT-PCR을 시행한 결과, TNF-a를 단독 처리한 군에 비해 WK-38 추출물을 전 처리한 군에서 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin 단백질 및 mRNA 발현율이 유의성 있게 감소함을 보여주었다.
- 본 연구는 사람 혈관 내피 세포주인 HUVEC에서 WK-38 추출물이 이러한 죽상경화의 초기과정에서 TNF-a에 의한 CAMs 발현과 NF-kB 활성에 미치는 효과에 대해 조사하였다. TNF-a 처리에 의하여 증가된 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 발현은 WK-38 추출물 전처리에 의해 농도 의존적으로 감소되었다. 또한 TNF-a를 단독 처리한 군에 비해 WK-38 추출물을 전 처리한 군에서 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin 단백질 및 mRNA 발현율이 유의적으로 감소됨을 보였다.
- 뿐만 아니라 WK-38 추출물의 전처리는 HUWEC에서 TNF-a에 의해 유도된 단핵구 U937의 부착을 현저하게 감소시켰다. WK-38 추출물이 중요한 염증조절인자인 NF-kB의 활성화에 어떠한 영향을 미치는지에 대해 알아본 결과에서 TNF-a에 의한 핵 내의 NF-kB p65 단백질 양의 증가가 WK-38 추출물 전처리에 의해 억제되며 NF-kB의 활성을 조절하는 IicB-a의 인산화 역시 억제됨을 알 수 있었다. 이러한 실험 결과로 보아, WK-38 추출물은 혈관내피 세포에서 NF-kB 활성을 억제시켜 이를 통해 TNF-a로 유도된 혈관염증을 저해하는 효과를 가지고 있으며, 혈관 내의 염증기작으로 인한 동맥경화나 죽상경화 같은 만성질환의 치료에 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 그러므로 WK-38에 의한 백혈구 부착의 변화 정도를 알아보기 위하여 WK-38 추출물을 전 처리한 후 형광 현미경을 이용하여 부착 여부를 촬영하고 정량화하였다. 그 결과 Fig. 4 에서 보는 바와 같이 TNF-a를 처리한 군 (B)는 아무것도 처리하지 않은 대조군 (A)와 비교해 볼 때 U937 단핵구의 세포 부착이 유의성 있게 증가함을 보였다. 하지만 TNF-ci를 처리한 혈관 내피 세포에 WK-38 추출물을 농도별로 전 처리 하였을 때 200 ug/ml WK-38 추출물을 처리한 군에서 단핵구의 세포부착이 억제 되는 것을 볼 수 있었다.
- 이에 본 실험에서는 WK-38 추출물이 TNF-a로 유도된 단핵구의 세포 부착에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 TNF-a에 의해 유도된 단핵구의 세포 부착이 WK-38 추출물에 의해 감소됨이 나타났다.
- Cell-based ELISA 결과를 바탕으로 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin2] 단백질 발현을 Western blotting으로 측정하였다. 그 결과, TNF- a에 의해 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 발현이 유의성 있게 증가하였으나, 150 iig/ml와 200 pg/ml WK-38 추출물 의전처리로 인하여 발현이 감소됨을 나타내었다(Fig. 2).
- 본 연구에서는 WK-38 추출물이 염증 조절인자인 NF-kB의 활성화에 어떠한 영향을 미치는지에 대해 알아보았다. 그 결과, TNF-a 처리는 핵 내의 NF-kB p65 단백질 양을 증가시켰으나 WK-38 추출물 전처리에 의해 억제되는 것으로 나타났다. 또한 WK-38에 의한 NF-kB의 활성 억제가 NF-kB의 활성을 조절하는 IKB-a의 인산화 억제 때문인지를 조사한 결과, WK-38 추출물은 TNF-a에 의한 IicB-a 인산화를 억제하는 것으로 나타났다.
- 이를 이용하여 WK-38 추출물의 항염증 효과를 입증하기 위해 cell based ELISA를 수행하였다. 그 결과, TNF-a에 의한 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin 의 발현 증가는 150 iig/ml와 200 ug/ml WK-38 추출물의 전처리에 의해서 유의성 있게 감소됨을 보였다(Fig. 1). Cell-based ELISA 결과를 바탕으로 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin2] 단백질 발현을 Western blotting으로 측정하였다.
- 추출한 후 western blotting을 수행하였다. 그 결과, TNF-ci를단독 처리했을 때 핵 부분의 p65 NF-kB의 발현이 유의성 있게 증가하였고, 이는 NF-kB 가 세포질에서 핵 부분으로 translocation이 되었으며 활성화되었음을 보여준 것이다. 그러나 WK-38 추출물을 농도별로 전 처리 하였을 때는 TNF-q에 의한 NF-kB translocation이 억제됨을 보여주었다(Fig 5A).
- 염증유발인자인 TNF-q 에 의한 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin mRNA 발현을 보기 위하여 real-time qRT・PCR으로 발현 정도를 측정하였다. 그 결과, 단백질 발현과 마찬가지로 TNF-a 처리에 의하여 증가된 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 mRNA 발현이 WK-38 추출물 전처리에 의해 감소하는 경향을 보여주었다(Fig. 3).
- 이 결과틀 정량화한 그래프에서도 WK-38이 TNF-a에 의한 단핵구 부착의 증가를 유의성 있게 감소시킴을 확인하였다. 그러므로, WK-38 추출물이 혈관염증과 정에서 활성화된 혈관 내피 조직 부위에 단핵구의 부착을 억제함으로써 죽상경화과정의 초기단계틀 억제시킬 수 있는 효능을 가지고 있음을 보여주는 결과이다.
- TNF-a 처리에 의하여 증가된 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 발현은 WK-38 추출물 전처리에 의해 농도 의존적으로 감소되었다. 또한 TNF-a를 단독 처리한 군에 비해 WK-38 추출물을 전 처리한 군에서 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin 단백질 및 mRNA 발현율이 유의적으로 감소됨을 보였다. 뿐만 아니라 WK-38 추출물의 전처리는 HUWEC에서 TNF-a에 의해 유도된 단핵구 U937의 부착을 현저하게 감소시켰다.
- 그 결과, TNF-a 처리는 핵 내의 NF-kB p65 단백질 양을 증가시켰으나 WK-38 추출물 전처리에 의해 억제되는 것으로 나타났다. 또한 WK-38에 의한 NF-kB의 활성 억제가 NF-kB의 활성을 조절하는 IKB-a의 인산화 억제 때문인지를 조사한 결과, WK-38 추출물은 TNF-a에 의한 IicB-a 인산화를 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 실험 결과로 보아, WK-38 추출물은 IKB-a의 인산화 억제를 통해 NF-kB 활성을 조절하는 것으로 예상되며 NF- kB의 활성화로 인한 여러가지 염증성 단백질의 발현을 억제하여 염증 과정을 조절하는 것으로 생각되어진다.
- TNF-a (10 ng/ml) 처리에 의하여 증가된 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 발현이 WK-38 추출물 전처리에 의해 농도 의존적으로 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 세포 수준에서의 단백질 양 및 mRNA의 양을 측정하기 위해 western blot 및 real-time qRT-PCR을 시행한 결과, TNF-a를 단독 처리한 군에 비해 WK-38 추출물을 전 처리한 군에서 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin 단백질 및 mRNA 발현율이 유의성 있게 감소함을 보여주었다. 이러한 실험 결과들로 보아 WK-38 추출물이 TNF-a로 유도된 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 발현을 조절함으로써 죽상경화증을 유발하는 혈관염증의 초기단계를 억제하여 항염증 작용에 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 하지만 TNF-ci를 처리한 혈관 내피 세포에 WK-38 추출물을 농도별로 전 처리 하였을 때 200 ug/ml WK-38 추출물을 처리한 군에서 단핵구의 세포부착이 억제 되는 것을 볼 수 있었다. 이 결과틀 정량화한 그래프에서도 WK-38이 TNF-a에 의한 단핵구 부착의 증가를 유의성 있게 감소시킴을 확인하였다. 그러므로, WK-38 추출물이 혈관염증과 정에서 활성화된 혈관 내피 조직 부위에 단핵구의 부착을 억제함으로써 죽상경화과정의 초기단계틀 억제시킬 수 있는 효능을 가지고 있음을 보여주는 결과이다.
- 또한 세포 수준에서의 단백질 양 및 mRNA의 양을 측정하기 위해 western blot 및 real-time qRT-PCR을 시행한 결과, TNF-a를 단독 처리한 군에 비해 WK-38 추출물을 전 처리한 군에서 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin 단백질 및 mRNA 발현율이 유의성 있게 감소함을 보여주었다. 이러한 실험 결과들로 보아 WK-38 추출물이 TNF-a로 유도된 VCAM-1, ICAM-1, 그리고 E-selectin의 발현을 조절함으로써 죽상경화증을 유발하는 혈관염증의 초기단계를 억제하여 항염증 작용에 효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 또한 WK-38에 의한 NF-kB의 활성 억제가 NF-kB의 활성을 조절하는 IKB-a의 인산화 억제 때문인지를 조사한 결과, WK-38 추출물은 TNF-a에 의한 IicB-a 인산화를 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 실험 결과로 보아, WK-38 추출물은 IKB-a의 인산화 억제를 통해 NF-kB 활성을 조절하는 것으로 예상되며 NF- kB의 활성화로 인한 여러가지 염증성 단백질의 발현을 억제하여 염증 과정을 조절하는 것으로 생각되어진다.
- WK-38 추출물이 중요한 염증조절인자인 NF-kB의 활성화에 어떠한 영향을 미치는지에 대해 알아본 결과에서 TNF-a에 의한 핵 내의 NF-kB p65 단백질 양의 증가가 WK-38 추출물 전처리에 의해 억제되며 NF-kB의 활성을 조절하는 IicB-a의 인산화 역시 억제됨을 알 수 있었다. 이러한 실험 결과로 보아, WK-38 추출물은 혈관내피 세포에서 NF-kB 활성을 억제시켜 이를 통해 TNF-a로 유도된 혈관염증을 저해하는 효과를 가지고 있으며, 혈관 내의 염증기작으로 인한 동맥경화나 죽상경화 같은 만성질환의 치료에 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 특히 200 ug/ml의 농도에서는 ICAM-1, VCAM-1, 그리고 E-selectin의 단백질 및 mRNA 발현 모두 확실한 저해 효과를 나타내었으며 핵 내 NF-kB 활성 역시 현저하게 저해시키는 것을 알 수 있었다. 이런 결과들로 보아 WK-38 추출물은 염증 및 염증성 질환 치료에 효과적일 수 있다고 생각되어진다.
- WK-38 추출물은 TNF-a로 유도된 CAMs 발현과 p65 NF-kB 활성을 저해함을 보였다. 특히 200 ug/ml의 농도에서는 ICAM-1, VCAM-1, 그리고 E-selectin의 단백질 및 mRNA 발현 모두 확실한 저해 효과를 나타내었으며 핵 내 NF-kB 활성 역시 현저하게 저해시키는 것을 알 수 있었다. 이런 결과들로 보아 WK-38 추출물은 염증 및 염증성 질환 치료에 효과적일 수 있다고 생각되어진다.
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