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문제 정의
- 본 연구팀은 우리나라 재래식 메주로부터 항세균 및 항진균 활성을 나타내는 균주들을 분리하였다. 이중 항세균 활성과 항진균 활성을 모두 지닌 B.
- polyfermenticus는 현재 정장용 생균제재(probiotic)로 시판되고 있다[9]. 우리나라 메주로부터 분리된 B. polyfermenticus CJ9이 생산하는 항세균 물질과 항진균 물질에 관한 본 연구는 인체와 식품에 유해한 곰팡이, 효모 및 세균에 항진균 활성과 항세균 활성을 동시에 가지는 B. polyfermenticus 유래의 항균 물질에 관한 보고이다. 본 연구 결과를 통하여 새로운 항균 활성 미생물의 개발이라는 측면과 아울러 식품 및 사료 등에 천연보존제(biopreservative), 생균제재(probiotic) 및 항생제 대체 의약품으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 연구팀은 우리나라 재래식 메주로부터 항세균 및 항진균 활성을 나타내는 균주들을 분리하였다. 이중 항세균 활성과 항진균 활성을 모두 지닌 B. polyfermenticus를 분리하였고, 이에 본 연구에서는 분리균주의 미생물학적 특성과 이 분리균주가 생산하는 항세균 및 항진균 활성 및 활성 물질의 특성을 규명하고자 하였다.
가설 설정
- Paper disk method는 감수성 균주가 도말된 평판배지 위에8 mm 직경의 paper disk를 놓고 항균 물질을 100 µL씩 일정하게 가하였다.
제안 방법
- 2차 PCR은 B. subtilis와 B. polyfermenticus의 16s rRNA gene의 염기 서열 중 상동성이 높은 부분을 primer 서열(Ba4-F: 5'- AGCTGCTCCCTGATGTTAG-3'; 4-subRR: 5'-TCGAAGAATCGAATGATCCT-3')로 합성하여 시행하였다.
- B. polyfermenticus CJ9의 생육에 따른 항세균 및 항진균 활성을 조사하였다. B.
- C18 Sep-Pak column으로 부분 정제한 시료의 항세균 및 항진균 활성을 나타내는 물질의 분자량을 Tricine-SDS-PAGE 를 통하여 결정하였다. 18% acrylamide gel을 사용하여 전기영동을 시행하였으며, 표준 분자량 물질로는 polypeptide SDS-PAGE standards(Bio-Rad, U.
- pH에 대한 영향을 알아보기 위하여 배양상등액을 5 N HCl과 5 N NaOH를 사용하여 pH 3.0~9.0으로 조정한 후 4℃에서 4시간 동안 처리한 후 항균 활성을 측정하였다[4, 20].
- subtilis ATCC 6633(1×105 cfu/mL)을 첨가 하여 분주하여 굳힌 후 37℃에서 12시간 배양하여 항세균 생육 저해 활성을 보이는 부분을 확인하였다. 대조구로는 분리균주의 부분 정제한 시료를 첨가 하지 않은 acrylamide gel을 direct detection에 사용된 band gel과 같은 크기로 잘라 동일한 세척 및 활성 측정법을 시행하여 acrylamide 성분에 의한 생육 저해 작용이 없음을 확인하였다.
- 본배양액을 원심분리(9,500×g, 15 min, 4℃) 후 상등액을 0.2 µm membrane filter(Advantec MFS, Inc., Japan)로 제균하여 배양상등액을 조항균물질로 사용하거나 또는 동결건조(Labconc℃o., U.S.A.)한 후에 3차 증류수로 녹여 5배, 10배, 20배 농축하여 사용하였다.
- , France) 을 이용하여 당 이용능을 조사하는 생화학적 특성을 통하여 일차적으로 균주를 동정하였으며, 분리 균주의 16S rRNA gene 염기서열 결정을 통하여 최종적인 동정을 하였다. 분리 균주의 chromosomal DNA를 Genomic DNA purification kit(Q-Biogene, U.S.A.)을 이용하여 분리한 후, Universal primer[42]를 사용하여 1차 PCR을 수행하였다. 2차 PCR은 B.
- 분리균주의 유당 이용능을 조사하였다. 분리균주를 tryptic soy broth(TSB, Difco Laboratories)에 접종하여 37℃에서12시간 전배양한 후 전배양액을 TSB 액체 배지와 유당 1%, 2%가 각각 첨가된 TSB 액체 배지에 1% 접종하여 37℃에서 48시간 동안 진탕배양 후 12시간 간격으로 세포 생육 정도를 600 nm(Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에서 흡광도로 측정하였다. 이때 대조구로는 유당을 이용하지 못하는 B.
- 분리균주의 동정은 형태학적 특성으로 그람 염색 및 포자 형성 관찰과 API 50 CHB system(BioMérieux, Co., France) 을 이용하여 당 이용능을 조사하는 생화학적 특성을 통하여 일차적으로 균주를 동정하였으며, 분리 균주의 16S rRNA gene 염기서열 결정을 통하여 최종적인 동정을 하였다.
- 분리균주의 배양시간에 따른 생육도와 항균 활성을 조사 하기 위하여 분리균주를 50 mL TSB 액체배지에 1% 접종 하여 37℃에서 0~120시간 동안 진탕배양하면서 600 nm에서 흡광도를 측정하여 생육곡선을 그리고, 이때 생육시기에 따른 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성 측정은 paper disk method[35]를 사용하여 다음과 같이 시행하였다.
- 분리균주의 생산물을 분리정제하기위해 분리균주를 50 mL TSB 액체 배지에서 37℃, 30시간동안 진탕배양 한 후 원심 분리(9,500×g, 15 min, 4℃)하여 얻은 상등액을 0.2 µm membrane filter로 제균하였다.
- 분리균주의 유당 이용능을 조사하기 위하여 유당을 첨가 하지 않은 TSB 액체 배지와 1%, 2% 유당을 각각 첨가한 TSB 배지에서 B. subtilis ATCC 6633 균주와 B. polyfermenticus CJ9의 생육도를 600 nm에서 흡광도로 측정하였다. B.
- 분리균주의 유당 이용능을 조사하였다. 분리균주를 tryptic soy broth(TSB, Difco Laboratories)에 접종하여 37℃에서12시간 전배양한 후 전배양액을 TSB 액체 배지와 유당 1%, 2%가 각각 첨가된 TSB 액체 배지에 1% 접종하여 37℃에서 48시간 동안 진탕배양 후 12시간 간격으로 세포 생육 정도를 600 nm(Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에서 흡광도로 측정하였다.
- 분리균주의 항균 물질의 각종 효소에 대한 영향을 알아보기 위하여 배양 상등액에 proteinase K(EC 3.4.21.64, Sigma Co., U.S.A.)는 10 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 5 mM EDTA(pH 7.5), protease(type I, Sigma) 및 trypsin(EC 3.4.21.4, Sigma)은 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), pepsin(EC 3.4.23.1, Sigma)은 10 mM citrate(pH 6.0), α-chymotrypsin (EC 3.4.21.1, type I-S, Sigma)은 10 mM phosphate(pH 7.0), lipase(EC 3.1.1.3, type VII, Sigma)는 50 mM TrisHCl 10 mM CaCl2(pH 7.0), α-amylase(EC 3.2.1.1, Type VIII, Sigma)는 50 mM sodium phosphate 10 mM NaCl (pH 7.0)에 4 mg/mL의 농도로 25℃에서 24시간 처리한 후에 잔존하는 항균 활성을 측정하였다[4, 20].
- 1). 선별된 미생물(18종)은 곰팡이, 효모, 세균에 대해 direct method 및 paper disk method을 통하여 항진균 활성과 항세균 활성을 조사하였다. 이중 항균 활성 범위가 넓고 그 활성도 강한 균주 1종을 최종 선별하고(data not shown), 이를 CJ9라 명명 하였다.
- 분리균주의 부분 정제 시료를 전기영동 후 gel을 25%(v/v) isopropanol과 10%(v/v) glacial acetic acid 용액에 담가 상온에서 30분간 고정시키고 증류수로 1시간 30분 동안 세척 하였다. 세척한 gel은 1개의 lane으로 잘라 PDA 평판배지 위에 놓은 후 그 위에 PDA top agar(0.7%, w/v) 10 mL를 분주하여 굳힌 배지 표면에 C. gossypiicola KF-2를 전면에 도말하여 25℃ 에서 72시간 배양한 후 항진균 생육 저해환이 생성되는 부분을 확인하였다. 항세균 활성은 B.
- 온도에 의한 영향을 알아보기 위하여 분리 균주 배양상 등액을 25℃, 37℃, 50℃, 70℃에서 24시간, 100℃에서30분, 121℃에서 15분간 열처리한 후에 잔존활성을 측정하였다[4, 20].
- )한 후에 3차 증류수로 녹여 5배, 10배, 20배 농축하여 사용하였다. 이때 TSB 액체 배지를 동결건조 후 실험구와 같은 배율로 농축한 것을 대조구로 사용하였다.
- 선별된 미생물(18종)은 곰팡이, 효모, 세균에 대해 direct method 및 paper disk method을 통하여 항진균 활성과 항세균 활성을 조사하였다. 이중 항균 활성 범위가 넓고 그 활성도 강한 균주 1종을 최종 선별하고(data not shown), 이를 CJ9라 명명 하였다.
- polyfermenticus의 16s rRNA gene의 염기 서열 중 상동성이 높은 부분을 primer 서열(Ba4-F: 5'- AGCTGCTCCCTGATGTTAG-3'; 4-subRR: 5'-TCGAAGAATCGAATGATCCT-3')로 합성하여 시행하였다. 증폭된 PCR 산물은 pGEM-T easy vector(Promega Co., U.S.A.)에 cloning한 후 ABI PRISM 3730 DNA analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.)를 이용하여 염기 서열을 분석하였다. 그 결과를 BLASTN 프로그램[10]을 이용 하여 GenBank의 ribosomal RNA gene sequence와 비교하였으며 sequence의 상동성은 CLUSTAL X program을 이용 하여 비교분석하였다.
- subtilis ATCC 6633이 유당을 분해하지 못한 결과와 달리 분리균주 CJ9은 유당을 분해하여 대사에 이용하였다(Table 1). 최종 동정을 위하여 16S rRNA gene의 염기서열을 결정 하여(1,520 bp) 이를 GenBank에 등록된 표준균주(type strain)나 참고균주(reference strain)의 16S rRNA gene 염기서열들과 상동성을 비교하였다. 그 결과 분리균주 CJ9은 B.
- 항균 활성 균주를 분리하기 위해 멸균수에 현탁된 메주가루 시료를 희석하여 LB, MEA, PDA, MEA-skim milk, PDA-skim milk 평판배지에 도말하여 2~5일간 배양한 후, 형성된 미생물의 집락을 관찰하였다. 관찰 결과 다양한 종류의 세균(352종)과 곰팡이(10종)들이 관찰되었다.
- Paper disk method와 direct method에 의한 분리균주의 항균 활성 측정시 감수성 세균은 37℃에서 12시간 동안 배양하고, 감수성 효모와 곰팡이는 25℃ 또는 30℃에서 24~72시간 동안 배양하였다. 항균 활성은 diamatic caliper를 사용하여 생육저지환의 지름으로 측정하였으며 3회의 반복실험을 한 후 평균값을 사용하였다.
- 항세균 활성은 37℃에서 24시간 배양하여, 항진균 활성은 30℃에서 48시간 배양한 후 활성을 측정하였다. 항균활성은 diamatic caliper(CD15CPX, Mitutoyo, Japan)를 사용하여 생육저지환의 지름으로 측정하였으며 3회의 반복실험을 한 후 평균값을 사용하였다.
- 항세균 물질과 항진균 물질은 proteinase K, protease, trypsin, α-chymotrypsin 등의 단백분해효소 처리로 역가를 상실하거나 일부 감소되어 단백질성 물질임을 추정하였다.
- 항세균 및 항진균 물질의 온도, pH 및 각종 효소처리에 대한 안정성을 조사하였다.
- 항진균 활성은 감수성 곰팡이인 Aspergillus petrakii PF-1의 포자를 PDA 배지 20 mL에 1×106 cfu/mL로 첨가하여 petri dish에 부은 후에 굳으면 8 mm 직경의 paper disk를 놓고 항진균 물질을 100 µL씩 일정하게 가하였다. 항세균 활성은 37℃에서 24시간 배양하여, 항진균 활성은 30℃에서 48시간 배양한 후 활성을 측정하였다. 항균활성은 diamatic caliper(CD15CPX, Mitutoyo, Japan)를 사용하여 생육저지환의 지름으로 측정하였으며 3회의 반복실험을 한 후 평균값을 사용하였다.
- 항세균 활성은 B. subtilis ATCC 6633을 지시균으로 사용하여 1개의 lane으로 자른 gel 을 LB 평판배지 위에 놓고 그 위에 LB top agar(0.7%, w/ v) 10 mL에 B. subtilis ATCC 6633(1×105 cfu/mL)을 첨가 하여 분주하여 굳힌 후 37℃에서 12시간 배양하여 항세균 생육 저해 활성을 보이는 부분을 확인하였다.
- 항세균 활성은 B. subtilis ATCC 6633을 지시균으로 사용하여 LB 평판배지에 1×105 cfu/mL로 도말한 후 8 mm 직경의 paper disk(ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 놓고 항균 물질을 100 µL씩 일정하게 가하였다.
- 항진균 활성 균주를 분리하기 위해 가정에서 제조된 재래형 메주를 수집하였다. 수집된 메주는 분쇄기를 사용하여 마쇄 후 이중 1g을 취하여 10 mL의 멸균수에 현탁한 후, 현탁액을 100 µL 또는 200 µL를 취하여 평판배지에 도말하였다.
- 항진균 활성은 감수성 곰팡이인 Aspergillus petrakii PF-1의 포자를 PDA 배지 20 mL에 1×106 cfu/mL로 첨가하여 petri dish에 부은 후에 굳으면 8 mm 직경의 paper disk를 놓고 항진균 물질을 100 µL씩 일정하게 가하였다.
대상 데이터
- Sep-Pak column으로 부분 정제한 시료의 항세균 및 항진균 활성을 나타내는 물질의 분자량을 Tricine-SDS-PAGE 를 통하여 결정하였다. 18% acrylamide gel을 사용하여 전기영동을 시행하였으며, 표준 분자량 물질로는 polypeptide SDS-PAGE standards(Bio-Rad, U.S.A.)를 사용하였다. 전기 영동 후 coomassie brilliant blue G(Sigma Co.
- 분리균주 CJ9은 그람염색 및 포자 형성 관찰 결과 그람양성의 간균이며 내생포자를 형성하였다. API 50 CHB system을 이용한 당 이용성 조사를 통한 균주 동정 결과 Bacillus subtilis와 87%의 상동성을 나타내었으며, B. subtilis ATCC 6633이 유당을 분해하지 못한 결과와 달리 분리균주 CJ9은 유당을 분해하여 대사에 이용하였다(Table 1). 최종 동정을 위하여 16S rRNA gene의 염기서열을 결정 하여(1,520 bp) 이를 GenBank에 등록된 표준균주(type strain)나 참고균주(reference strain)의 16S rRNA gene 염기서열들과 상동성을 비교하였다.
- 분리균주를 tryptic soy broth(TSB, Difco Laboratories)에 접종하여 37℃에서12시간 전배양한 후 전배양액을 TSB 액체 배지와 유당 1%, 2%가 각각 첨가된 TSB 액체 배지에 1% 접종하여 37℃에서 48시간 동안 진탕배양 후 12시간 간격으로 세포 생육 정도를 600 nm(Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에서 흡광도로 측정하였다. 이때 대조구로는 유당을 이용하지 못하는 B. subtilis ATCC 6633을 사용 하였다.
- 수집된 메주는 분쇄기를 사용하여 마쇄 후 이중 1g을 취하여 10 mL의 멸균수에 현탁한 후, 현탁액을 100 µL 또는 200 µL를 취하여 평판배지에 도말하였다. 이때 사용된 배지로는 Luria broth(LB, 1% bacto-tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) 평판배지, malt extract agar (MEA, Difco Laboratories), potato dextrose agar(PDA, Difco Laboratories) 배지 또는 이에 2%(w/v) skim milk (Difco Laboratories)를 첨가한 배지를 사용하였다. LB 평판 배지는 37℃, MEA 평판배지는 30℃, PDA 평판배지는 25℃에서 2~5일 동안 배양하면서 곰팡이 및 세균들에 대해 생육저해 활성을 나타내는 균주를 분리하였다.
- 관찰 결과 다양한 종류의 세균(352종)과 곰팡이(10종)들이 관찰되었다. 이중 동일한 평판 배지 내에서 형성된 곰팡이 집락들에 대해 생육 저해활성을 나타내는 균주를 선별하였다(Fig. 1). 선별된 미생물(18종)은 곰팡이, 효모, 세균에 대해 direct method 및 paper disk method을 통하여 항진균 활성과 항세균 활성을 조사하였다.
- 그람 양성과 음성세균, 효모 및 곰팡이에 대한 분리균주의 항균 활성은 paper disk method 및 direct method[36]를 사용하여 조사하였다. 항균 활성 실험에 사용한 미생물 중 ATCC 균주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, U.S.A.)로부터 구입하였으며 본 실험실에서 토양, 된장, 메주 그리고 김치로부터 분리하여 동정한 균주 Bacillus subtilis cx1[4], Bacillus subtilis DJI[5], A. petrakii PF-1[12], Aspergillus ochraceus PF-2[12], Aspergillus nidulans PF-3[12], Cladosporium gossypiicola KF-2[12]를 사용하였다. 항균 활성 측정을 위한 감수성 세균은 LB 또는 brain heart infusion(BHI, Difco Laboratories) 평판배지, 감수성 곰팡이는 PDA 또는 MEA 평판배지, 감수성 효모는 YM(Difco Laboratories) 또는 sabouraud dextrose(SD, Difco Laboratories) 평판배지에 1×106 cfu/mL로 도말하였다.
데이터처리
- )를 이용하여 염기 서열을 분석하였다. 그 결과를 BLASTN 프로그램[10]을 이용 하여 GenBank의 ribosomal RNA gene sequence와 비교하였으며 sequence의 상동성은 CLUSTAL X program을 이용 하여 비교분석하였다.
이론/모형
- B. polyfermenticus CJ9의 배양상등액을 곰팡이 7종, 효모 3종, 세균 10종에 대한 항균 활성을 paper disk method로 조사하였다. B.
- )을 100% methanol 과 3차 증류수로 미리 soaking한 후에 제균된 상등액을 흡착 시킨 후, 3차 증류수로 수세하고 100% methanol로 용출하였다. Methanol에 녹아있는 분획을 Speed Vac Concentrator (Centra-Vac VS-802, Vision, Korea)를 이용하여 용매를 제거한 후 멸균수에 녹여 항세균 활성과 항진균 활성 측정 및 Tricine-SDS-PAGE[29]에 사용하였다.
- 그람 양성과 음성세균, 효모 및 곰팡이에 대한 분리균주의 항균 활성은 paper disk method 및 direct method[36]를 사용하여 조사하였다. 항균 활성 실험에 사용한 미생물 중 ATCC 균주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, U.
- 4). 세 개의 band의 항세균 및 항진균 활성을 direct detection 방법으로 측정하였다. 항세균 활성은 B.
- 이때 대조구로서는 동일한 반응조건에서 효소만을 제외한 것으로 삼았다. 잔존하는 항세균 및 항진균 활성 측정은 paper disk method 를 사용하여 감수성 세균으로 B. subtilis ATCC 6633을 감수성 곰팡이로는 A. petrakii PF-1을 사용하였다.
- )를 사용하였다. 전기 영동 후 coomassie brilliant blue G(Sigma Co., U.S.A.)로 단백질을 염색 하였고, gel 상에서 항균활성을 나타내는 물질의 band 확인은 direct detection 방법[3]으로 시행하였다. 분리균주의 부분 정제 시료를 전기영동 후 gel을 25%(v/v) isopropanol과 10%(v/v) glacial acetic acid 용액에 담가 상온에서 30분간 고정시키고 증류수로 1시간 30분 동안 세척 하였다.
- 분리균주의 배양시간에 따른 생육도와 항균 활성을 조사 하기 위하여 분리균주를 50 mL TSB 액체배지에 1% 접종 하여 37℃에서 0~120시간 동안 진탕배양하면서 600 nm에서 흡광도를 측정하여 생육곡선을 그리고, 이때 생육시기에 따른 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성 측정은 paper disk method[35]를 사용하여 다음과 같이 시행하였다. 항세균 활성은 B.
성능/효과
- 2). B. polyfermenticus CJ9에 유당을 1%와 2% 첨가한 TSB 배지에서 48시간 생육시 유당을 첨가하지 않은 TSB 배지보다 훨씬 높은 생육도(A600: 0%-7.37, 1%-11.22, 2%-9.74)를 나타내었다(Fig. 2). 이러한 결과로부터 B.
- polyfermenticus CJ9의 배양상등액을 곰팡이 7종, 효모 3종, 세균 10종에 대한 항균 활성을 paper disk method로 조사하였다. B. polyfermenticus CJ9의 배양상등액은 그람 양성균인 B. subtilis ATCC 6633과 식중독 원인균인 Listeria monocytogenes ATCC 19113에 대하여 강한 저해 활성을 나타내었으며, 배양상등액을 5배, 10배, 20배 농축하여 처리한 구에서는 그람 양성균과 음성균에 대해 모두 저해 활성을 나타내었다(Table 2). 이때 사용된 TSB 액체배지만을 5배~20배 농축하여 처리한 구에서는 본 실험에 사용된 20종의 미생물에 대하여 어떠한 생육 저해 활성을 나타내지 않음을 확인 하였다.
- B. polyfermenticus CJ9의 배양상등액의 항진균 활성을 측정한 결과 곰팡이 독소인 ochratoxin A를 생성하는 A. petrakii PF-1, 식품과 사료의 저장기간 중 부패를 일으키며 곰팡이 독소인 ochratoxin A, B, C를 생산하는 A. ochraceus PF-2, 알레르기, 폐렴 및 피부염을 일으키는 C. gossypiicola KF-2의 곰팡이에 대해 강한 저해 활성을 나타내었다(Table 2). 또한 배양상등액을 10배 농축한 구간에서 Penicillium roqueforti ATCC 10110에 대한 생육 저해활성을 나타내었 으며, 배양상등액을 20배 농축한 구간에서 피부, 손톱, 여성의 질에 염증을 일으키는 병원성 효모인 Candida albicans strain에 대해서도 저해활성을 나타내었다(Table 2).
- polyfermenticus CJ9로 명명하였다. B. polyfermenticus CJ9의 생육에 따른 항균 활성을 측정한 결과 항세균 활성은 배양 12시간에 최대 활성을 나타내며 72시간까지 90% 이상 활성을 유지하다 120시간에 활성을 완전히 상실하였다. 항진균 활성은 배양 24시간 이후부터 최대 활성을 나타내었고, 사멸기 이후 활성이 다소 감소되었으나 배양 120시간까지 활성이 유지되었다.
- 항세균 물질과 항진균 물질은 proteinase K, protease, trypsin, α-chymotrypsin 등의 단백분해효소 처리로 역가를 상실하거나 일부 감소되어 단백질성 물질임을 추정하였다. B. polyfermenticus CJ9의 항세균 물질과 항진균 물질을 C18 Sep-Pak column에 흡착된 분획으로부터 역가를 확인하여 소수성 물질임을 알 수 있었으며, Tricine-SDS-PAGE 및 direct detection 실험을 통하여 분자량을 확인한 결과 항진균 물질은 약 1.4 kDa의 물질임을 확인하였다. 그러나 항세균 활성 물질은 열 불안정성 때문에 동 실험법상에서 그 분자량을 확인할 수 없었다.
- B. polyfermenticus CJ9의 항세균 물질과 항진균 물질을 부분 정제하기 위해서 배양상등액을 C18 Sep-Pak column에 흡착시킨 후 100% methanol로 용출하여 얻은 분획에서만 강한 항세균 활성과 항진균 활성을 관찰하였으며, 이로부터 B. polyfermenticus CJ9이 생산하는 항세균 및 항진균 물질이 소수성 물질임을 알 수 있었다(data not shown).
- B. polyfermenticus CJ9의 항세균 물질의 열 안정성 실험 결과 항세균 활성은 25℃에서 24시간 처리시 그 활성이 다소 저하되며 37℃에서 24시간 처리 후 역가가 완전히 소실 되어 열에 불안정함을 알 수 있었다(Table 3). 그러나 항진균 활성은 100℃에서 30분간 열처리 후에 활성을 100% 유지하였으며 121℃에서 15분간 열처리하였을 때도 항진균 활성이 50%는 잔존하여 열에 매우 안정한 물질임을 알 수 있 었다(Table 3).
- polyfermenticus CJ9은 식품과 인체에 유해한 곰팡이, 효모, 그람 양성및 음성 세균에 대한 항진균 활성과 항세균 활성을 동시에 나타내었다. B. polyfermenticus CJ9의 항세균 활성은 37℃에서 24시간 열처리 후에 활성을 상실하였으며, pH 5.0~9.0구간에서는 안정한 활성을 나타내었으나 pH 3.0~4.0 구간에서 활성이 감소하였다. 항진균 물질은 121℃에서 15분간 열 처리시 활성이 감소되었으나 역가가 완전히 소실되지 않았 으며, pH 3.
- B. polyfermenticus CJ9이 생산하는 항세균 물질과 항진균 물질은 생육곡선에 따른 역가 차이를 보였으며, 열 및 pH 안전성 등의 특성에서 큰 차이를 보여 두 물질은 서로 다른 물질임을 알 수 있었다. 그러나 단백분해효소에 의해 항세균 활성과 항진균 활성이 크게 감소되거나 소실되어 항세균 물질과 항진균 물질은 모두 단백질성 물질임을 추정할 수 있 었다.
- polyfermenticus CJ9의 생육도를 600 nm에서 흡광도로 측정하였다. B. subtilis ATCC 6633은 유당의 첨가 여부와 관계없이 비슷한 생육도를 나타내었으나, B. polyfermenticus CJ9은 1%와 2% 유당을 첨가한 TSB 배지에서 유당을 첨가하지 않은 TSB 배지보다 더 높은 생육도를 각각 나타내었다(Fig. 2). B.
- pH에 대한 안정성 실험에서 B. polyfermenticus CJ9의 항 세균 활성은 pH 3.0~4.0 구간에서 활성이 감소하였으나 pH 5.0~9.0 구간에서는 안정함을 나타내어 산성영역에서는 불안 정하지만 알칼리 영역에서는 안정함을 알 수 있었다(Table 3). 항진균 활성 물질은 pH 3.
- 각종 효소에 대한 영향을 살펴본 결과 B. polyfermenticus CJ9의 항세균 물질은 pepsin, α-amylase, lipase 처리에 영향을 받지 않았으나, proteinase K, protease, trypsin, α-chymotrypsin의 단백분해 효소에 역가를 상실하였다(Table 3).
- 항균 활성 균주를 분리하기 위해 멸균수에 현탁된 메주가루 시료를 희석하여 LB, MEA, PDA, MEA-skim milk, PDA-skim milk 평판배지에 도말하여 2~5일간 배양한 후, 형성된 미생물의 집락을 관찰하였다. 관찰 결과 다양한 종류의 세균(352종)과 곰팡이(10종)들이 관찰되었다. 이중 동일한 평판 배지 내에서 형성된 곰팡이 집락들에 대해 생육 저해활성을 나타내는 균주를 선별하였다(Fig.
- 최종 동정을 위하여 16S rRNA gene의 염기서열을 결정 하여(1,520 bp) 이를 GenBank에 등록된 표준균주(type strain)나 참고균주(reference strain)의 16S rRNA gene 염기서열들과 상동성을 비교하였다. 그 결과 분리균주 CJ9은 B. polyfermenticus와 99.9%의 상동성을 나타내어 최종적으로 B. polyfermenticus로 동정되었으며 이를 B. polyfermenticus CJ9라 명명하였고, 그 16S rRNA gene의 염기서열은 GenBank(FJ436015)에 등록하였다.
- subtilis가 생산하는 항진균 활성 물질인 bacillomycin D와 plipastatin B1 등의 기존에 연구된 Bacillus 속 유래의 항진균 활성 물질은 cyclic peptide 구조를 가지거나 구조내에 D형 아미노산을 가지므로 열에 매우 안정하며 단백분해효소에 영향을 받지 않았다[14, 19, 27, 33, 39]. 그러나 B. polyfermenticus CJ9이 생산하는 항진균 물질은 일부 단백분해효소에 분해되며 pH와 열에는 안정하여 기존에 보고된 Bacillus 유래의 항진균 활성 물질들과 서로 다른 구조를 가지는 단백질성 물질임을 추정할 수있었다.
- 그러나 열에 안정한 항진균 물질의 활성은 Tricine-SDSPAGE 상의 세 개의 band 중 분자량 1.4 kDa 부분의 band 에서만 항진균 활성을 나타내었으며 다른 두 band 부분에서는 항진균 활성이 관찰되지 않았다(Fig. 4). 이상의 실험 결과로부터 B.
- polyfermenticus CJ9의 항세균 물질의 열 안정성 실험 결과 항세균 활성은 25℃에서 24시간 처리시 그 활성이 다소 저하되며 37℃에서 24시간 처리 후 역가가 완전히 소실 되어 열에 불안정함을 알 수 있었다(Table 3). 그러나 항진균 활성은 100℃에서 30분간 열처리 후에 활성을 100% 유지하였으며 121℃에서 15분간 열처리하였을 때도 항진균 활성이 50%는 잔존하여 열에 매우 안정한 물질임을 알 수 있 었다(Table 3).
- polyfermenticus CJ9은 서로 다른 특징을 지닌 항세균 물질과 항진균 물질을 생산함을 알 수있었다. 또한 두 물질은 일부 단백 분해 효소에 영향을 받아 단백질성 물질임을 추측할 수 있었다. B.
- gossypiicola KF-2의 곰팡이에 대해 강한 저해 활성을 나타내었다(Table 2). 또한 배양상등액을 10배 농축한 구간에서 Penicillium roqueforti ATCC 10110에 대한 생육 저해활성을 나타내었 으며, 배양상등액을 20배 농축한 구간에서 피부, 손톱, 여성의 질에 염증을 일으키는 병원성 효모인 Candida albicans strain에 대해서도 저해활성을 나타내었다(Table 2).
- 메주로부터 항진균 및 항세균 활성을 나타내는 균주를 분리하고 동정하여 B. polyfermenticus CJ9로 명명하였다. B.
- subtilis ATCC 6633과 식중독 원인균인 Listeria monocytogenes ATCC 19113에 대하여 강한 저해 활성을 나타내었으며, 배양상등액을 5배, 10배, 20배 농축하여 처리한 구에서는 그람 양성균과 음성균에 대해 모두 저해 활성을 나타내었다(Table 2). 이때 사용된 TSB 액체배지만을 5배~20배 농축하여 처리한 구에서는 본 실험에 사용된 20종의 미생물에 대하여 어떠한 생육 저해 활성을 나타내지 않음을 확인 하였다.
- 2). 이러한 결과로부터 B. polyfermenticus CJ9은 유당을 분해하여 대사에 이용함을 알 수 있었으며, 이와 같은 결과는 Table 1의 API 50 CHB system을 이용한당 이용성 조사 결과와 함께 기존 보고에서 B. polyfermenticus는 B. subtilis와 상당히 유사한 것으로 인정되고 있으나, B. subtilis와 다른 점은 유당을 분해하는 능력이 있다는 보고와 일치하는 결과이다[20].
- 이상의 결과로부터 B. polyfermenticus CJ9은 서로 다른 특징을 지닌 항세균 물질과 항진균 물질을 생산함을 알 수있었다. 또한 두 물질은 일부 단백 분해 효소에 영향을 받아 단백질성 물질임을 추측할 수 있었다.
- 4). 이상의 실험 결과로부터 B. polyfermenticus CJ9이 생산하는 항세균 물질의 분자량은 본 실험으로부터 확인할 수 없었으며, 항진균 물질은 약 1.4 kDa 분자량을 가지는 단백질성 물질임을 추정할 수 있었다.
- 세 개의 band의 항세균 및 항진균 활성을 direct detection 방법으로 측정하였다. 항세균 활성은 B. subtilis ATCC 6633을 지시균으로하여 측정한 결과 세 개의 band에서 항세균 저해 활성을 보이는 부분이 관찰되지 않았다. 이와 같은 결과는 Table 3에서 보여진 B.
- 항세균 활성은 대수기인 배양 6시간부터 높은 활성을 보였으며 배양 12시간에 최대 활성을 나타내었다. 그 이후 배양 18시간부터 활성이 서서히 감소하다가 72시간 이후 급격히 활성이 감소되어 배양 120시간에는 활성이 완전히 소실되었다(Fig.
- 0 구간에서는 안정함을 나타내어 산성영역에서는 불안 정하지만 알칼리 영역에서는 안정함을 알 수 있었다(Table 3). 항진균 활성 물질은 pH 3.0~9.0 구간에서 안정한 활성을 나타내어 분리균주가 생산하는 항진균 물질은 산성에서부터 알칼리 영역에서 안정함을 알 수 있었다(Table 3).
- 항진균 활성 물질은 pepsin, trypsin, α-amylase, lipase 처리에는 영향을 받지 않았으나, proteinase K 처리시 역가가 크게 감소하였으며 protease, α-chymotrypsin의 단백분해효소 처리로 항진균 활성이 불활성화 되었다(Table 3).
- polyfermenticus CJ9의 생육에 따른 항균 활성을 측정한 결과 항세균 활성은 배양 12시간에 최대 활성을 나타내며 72시간까지 90% 이상 활성을 유지하다 120시간에 활성을 완전히 상실하였다. 항진균 활성은 배양 24시간 이후부터 최대 활성을 나타내었고, 사멸기 이후 활성이 다소 감소되었으나 배양 120시간까지 활성이 유지되었다. B.
- 항진균 활성은 항세균 활성보다 늦게 나타나기 시작하여 배양 24시간 이후부터 최대 활성을 나타내었으며, 배양 60시간 이후부터 활성이 급격히 감소되었으나 72시간 이후부터는 최대 활성의 50% 정도를 유지하며 배양 120시간까지그 활성을 그대로 유지하였다(Fig. 3). 기존 보고에서는 B.
후속연구
- 그러나 항세균 활성 물질은 열 불안정성 때문에 동 실험법상에서 그 분자량을 확인할 수 없었다. B. polyfermenticus CJ9이 생산하는 항균 물질은 항세균 및 항진균 활성을 동시에 가지는 단백질성 물질로서 천연 식품보존제 및 정장제재로 활용이 기대되며, 이를 위하여 항세균 물질과 항진균 물질의 정제 및 구조분석 등의 연구가 필요하다.
- polyfermenticus SCD가 생산하는 항균 물질인 polyfermenticin SCD도 곰팡이에 대한 항진균 활성이 단 두 종에 제한되어 나타났다[13, 20]. 그러므로 항세균 활성과 항진균 활성을 동시에 나타내는 B. polyfermenticus CJ9에 관한 본 연구 결과는 식품 및 사료에 천연보존제로 사용함으로서 저장성을 향상시킬 뿐 아니라 식중독을 일으키는 병원성 세균, 인체에 유해한 곰팡이의 제어에도 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
- polyfermenticus 유래의 항균 물질에 관한 보고이다. 본 연구 결과를 통하여 새로운 항균 활성 미생물의 개발이라는 측면과 아울러 식품 및 사료 등에 천연보존제(biopreservative), 생균제재(probiotic) 및 항생제 대체 의약품으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 이를 위하여 본 실험실에서는 현재 항세균 물질과 항진균 물질의 정제 및 구조분석, 프로바이오틱 미생물로서의 기능적 특성규명 등의 연구를 수행 중에 있다.
- 본 연구 결과를 통하여 새로운 항균 활성 미생물의 개발이라는 측면과 아울러 식품 및 사료 등에 천연보존제(biopreservative), 생균제재(probiotic) 및 항생제 대체 의약품으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 이를 위하여 본 실험실에서는 현재 항세균 물질과 항진균 물질의 정제 및 구조분석, 프로바이오틱 미생물로서의 기능적 특성규명 등의 연구를 수행 중에 있다.
- polyfermenticus 유래의 항진균 물질에 관한 연구는 매우 미흡한 실정이며, 보고된 연구들도 대부분 좁은 범위의 항진균 활성만을 가지고 있다[13, 20]. 향후 프로바이오틱 생균제로 그 활용성이 기대되는 B. polyfermenticus 중 식품의 부패와 식중독을 일으키는 인체에 유해한 곰팡이, 효모 및 세균 등의 미생물에 대해 적용될 수 있는 넓은 범위의 항균력을 가지고 있는 GRAS (generally regarded as safe) 등급의 B. polyfermenticus 유래의 항균제나 생균제재의 개발은 그 유용성을 더욱 크게 할 것이다.
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