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문제 정의
- 따라서 본 연구는 생약제 성분을 추출하고 각각의 추출물에서 항균특성을 조사하여 천연 항진균 성분을 분리하고자실험을 실시하였다.
- 본 연구에서는 여성의 질염을 일으키는 칸디다증 병원균에 대한 항진균 성분을 한약재에서 조사하였다. 한약재에 ethanol 이용하여 phenol분을 추출하고, 추출물의 phenol 함량을 츸정하였다.
제안 방법
- Na?C03 (Sigma, USA), quercetin(Sigma, USA), catechin(sigma, USA)의 시 약을 이용하여 microplate spectrophotometer (BENCHMARK PLUS, BIO-RAD, US A) 에서 측정하였다. 항진균활성 조사는 분양받은 Candida albicans(.
- 확인된 spotse MeOH에 녹여 HPLC 분석을 실시하였다. HPLC기기는 Varian(USA), columne varian C18 reversed-phase, flow ratee 1 mLAnin, buffer 는 mobile phase A: acetonitrile, B:0.2% KH2PO4를 이용하여 A buffer 25%, B buffer 75%에서 A 55%, B 45% 30분간으로 linear gradien하여 분석하였다.
- acid(7:2:l)이다. TLC에서 분리한 물질은 세부분으로 나누어 다시 항균활성처리를 실시하여 확인하였다. 항균활성효과를 나타내는 부분의 물질은 다시 2차 분리하여 3개의 spots로 분리하여 항균활성을 조사하였다.
- utils 이상 5종류의 Candida 종에 대한 항균활성검색은 다음과 같이 실시하였다. 각각의 균을 최적배지인 YM agar 배지에 20uL씩 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한다음 추출물을 각각의 농도에 맞추어 배지에 흡수시키고 대조구로는 amphotericin B를 사용하였다. 추출물이 흡수된 처리구는 3VC에서 3일간 배양하였으며 24시간 단위로 clear zone을 확인하여 저해활성을 계산 하였다.
- 위의 주줄물중 항균효과를 나타내는 추출물로부터 항균물질을 분리하기 위하여 TLC를 이용하여 1차 분리하였으며, 용매의 분리조건은 buthanol:DW:acetic acid(7:2:l)이다. TLC에서 분리한 물질은 세부분으로 나누어 다시 항균활성처리를 실시하여 확인하였다.
- 각각의 균을 최적배지인 YM agar 배지에 20uL씩 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한다음 추출물을 각각의 농도에 맞추어 배지에 흡수시키고 대조구로는 amphotericin B를 사용하였다. 추출물이 흡수된 처리구는 3VC에서 3일간 배양하였으며 24시간 단위로 clear zone을 확인하여 저해활성을 계산 하였다.
- 있다[5, 19]. 한방에서 사용되는 약재에 ethanol을 이용하여 phenol분을 추출하고, 추출물의 phenol 함량을 측정하였다. 효과적인 phenol성분의 추출을 위하여 ethanol의 농도를 단계별로 증가하여 추출하였는데 그 결과 Fig.
- 한약재에 ethanol 이용하여 phenol분을 추출하고, 추출물의 phenol 함량을 츸정하였다. Ethanol 농도에 따른 phenol성 물질의용출량은 시료마다 다른 양상을 보이고 있는데, 40% ethanol 농도에서 가장 높은 용출량은 어성초, 지모, 금은화 등이며 , 60% ethanol에서 가장 높은 용출량은 포공영 , 작약 등이다.
- 항균활성을 강하게 나타낸 황련 추출물을 이용하여 항균물질을 분리하였다. 황련 추출물은 TLC를 이용하여 1차로분리하였으며, TLC plate를 3등분하여 분리된 추출물은 MeOH로 녹여 회수하였다.
- 회수된 추출물은 항균활성을 측정하여 항균성분이 포함된 TLC plate부분을 확인하였다. 항균활성이 확인된 TLC plate의 성분을 다시 TLC에 전개하여 3개의 spots을 확인하였다. 3개의 spot&으로부터 분리된 3개의 compounds는 항균활성이 측정되었으며, 3개의 com- pounds중 한 개의 compound에서 항균활성을 확인하였다 (Table 2).
- TLC에서 분리한 물질은 세부분으로 나누어 다시 항균활성처리를 실시하여 확인하였다. 항균활성효과를 나타내는 부분의 물질은 다시 2차 분리하여 3개의 spots로 분리하여 항균활성을 조사하였다. 확인된 spotse MeOH에 녹여 HPLC 분석을 실시하였다.
- 항균활성효과를 나타내는 부분의 물질은 다시 2차 분리하여 3개의 spots로 분리하여 항균활성을 조사하였다. 확인된 spotse MeOH에 녹여 HPLC 분석을 실시하였다. HPLC기기는 Varian(USA), columne varian C18 reversed-phase, flow ratee 1 mLAnin, buffer 는 mobile phase A: acetonitrile, B:0.
- 황련 추출물은 TLC를 이용하여 1차로분리하였으며, TLC plate를 3등분하여 분리된 추출물은 MeOH로 녹여 회수하였다. 회수된 추출물은 항균활성을 측정하여 항균성분이 포함된 TLC plate부분을 확인하였다. 항균활성이 확인된 TLC plate의 성분을 다시 TLC에 전개하여 3개의 spots을 확인하였다.
- 한방에서 사용되는 약재에 ethanol을 이용하여 phenol분을 추출하고, 추출물의 phenol 함량을 측정하였다. 효과적인 phenol성분의 추출을 위하여 ethanol의 농도를 단계별로 증가하여 추출하였는데 그 결과 Fig. 1과 같은 결과를 얻었다. Ethanol 농도에 따른 phenol성 물질의 용출량은 시료마다 다른 양상을 보이고 있는데 , 40% ethanol 농도에서 가장 높은 용출량은 어성초, 지모, 금은화 등이며 , 60% ethanol에서 가장 높은 용출량은 포공영, 작약 등이었다.
대상 데이터
- 폴리페놀및 항산화조사를 위하여 Folin ciocalteu(Wako, Japan), a, a-diphenyl-P-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma, USA), Na?C03 (Sigma, USA), quercetin(Sigma, USA), catechin(sigma, USA)의 시 약을 이용하여 microplate spectrophotometer (BENCHMARK PLUS, BIO-RAD, US A) 에서 측정하였다. 항진균활성 조사는 분양받은 Candida albicans(.KTCC 10231), C. tropicalis(ATCC 750), C. glabrata (ATCC 2001), C. parapsilesis(ATCC 22019), C. "切s(ATCC 22023) 등을이용하여 조사하였다. 유기시약은 butanol (Junsei, Japan), acetic acid(J.
- 배지로는 YM Broth(Difco, USA)를 이용하고 진균억제제로 amphotericin B(Sigma, USA)를 사용하였다. 폴리페놀및 항산화조사를 위하여 Folin ciocalteu(Wako, Japan), a, a-diphenyl-P-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma, USA), Na?C03 (Sigma, USA), quercetin(Sigma, USA), catechin(sigma, USA)의 시 약을 이용하여 microplate spectrophotometer (BENCHMARK PLUS, BIO-RAD, US A) 에서 측정하였다.
- 실험에 이용된 황련, 어성초, 지모, 포공영 , 작약, 연교, 금인화 등은 한약재 판매소에서 당년에 생산된 재품을 구입하여 충분히 건조하고 50 mesh로 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다. 시료의 추출은 건조된 시료 20 g을 분쇄하여 ethanol 200 mL를 가하고 24시간 상온에서 교반 추출하였다.
- "切s(ATCC 22023) 등을이용하여 조사하였다. 유기시약은 butanol (Junsei, Japan), acetic acid(J.T Baker, USA), MeOH(J.T Baker, USA), TLC Silica gel 60 F254(merck, USA), berberin (Sigma, USA)을 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과의 통계처리는 SPSS 12.0(SPSS Inc, IL, USA) 을 사용하여 검증하였다.
이론/모형
- 주줄물의 전자공여능(EDA; eletron donating abilities) 측정은 Blois의 방법을 따라 측정 하였다[3]. 각 시료는 일정한 농도로 dilution하고 시료용액 2.
- 총 페놀 화합물은 Folin-Denis 방법으로 측정하였다[6]. 시료 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL을 첨가하고, IN Folin-ciocalteu reagent 0.
성능/효과
- 항균활성이 확인된 TLC plate의 성분을 다시 TLC에 전개하여 3개의 spots을 확인하였다. 3개의 spot&으로부터 분리된 3개의 compounds는 항균활성이 측정되었으며, 3개의 com- pounds중 한 개의 compound에서 항균활성을 확인하였다 (Table 2). 항균활성이 확인된 물질은 HPLC 분석을 통하여 berberin의 retention time과 일치하는 것으로 나타났다 (Fig 3).
- 1과 같은 결과를 얻었다. Ethanol 농도에 따른 phenol성 물질의 용출량은 시료마다 다른 양상을 보이고 있는데 , 40% ethanol 농도에서 가장 높은 용출량은 어성초, 지모, 금은화 등이며 , 60% ethanol에서 가장 높은 용출량은 포공영, 작약 등이었다. 황련은 80% ethanol 농도에서는 낮은 용출량을 보이나다른 농도에서는 비슷한 용출량을 보이고 있고, 연교는 80% ethanol에서 높은 용출량을 보이고 있다.
- albicans와 non-C. albicans 의 일부병원균에도 항진균 효과를 나타내고있음을 확인하였다. 또한 항련 추출물의 성분들중 하나로 알려진 berberin이 칸디다증 병원균에 항진균 효과를 나타내는성분임을 확인하였다.
- albicans 의 일부병원균에도 항진균 효과를 나타내고있음을 확인하였다. 또한 항련 추출물의 성분들중 하나로 알려진 berberin이 칸디다증 병원균에 항진균 효과를 나타내는성분임을 확인하였다.
- 황련 추출물은 50, 100, 150, 200 |Ag/mL 농도로 주입시 2, 3, 6, 9 mm의 저해환을 나타내었다. 연교, 지모, 금은화 추출물은 C. glabrata, C. parap- silesis, C. utils 3개 종에 대한 항균활성을 나타내지 않았다.
- 황련은 80% ethanol 농도에서는 낮은 용출량을 보이나 다른농도에서는 비슷한 용출량을 보이고 있고, 연교는 80% ethanol에서 높은 용출량을 보였다. 전자공여능은 ethanol 농도별 추출물에 따라 다르게 나타나고 있는데, 포공영은 80% ethanol 추출물 이상에서 전자공여능을 보이며, 황련, 지모, 금은화는 100%의 ethanol 추출물에서 전자공여능을 보였다. 한약재 추출물의 항균활성은 C.
- 황련 추출물은 50, 100, 150, 200 μg/mL 농도로주입시 2, 3, 6, 9 mm의 저해환을 나타내었다. 추출물을 이용한 C. glabrata, C. parapsilesis, C. utils 3개 종에 대한항균활성은 나타나지 않았다. 황련 추출물에서 항균성분은 TLC와 HPLC 분석을 통하여 berberin인 것으로 나타났다.
- 전자공여능은 ethanol 농도별 추출물에 따라 다르게 나타나고 있는데, 포공영은 80% ethanol 추출물 이상에서 전자공여능을 보이며, 황련, 지모, 금은화는 100%의 ethanol 추출물에서 전자공여능을 보였다. 한약재 추출물의 항균활성은 C. albicans는 황련 추출물 200 |ig/mL 농도로 주입하였을 때 3 mL 저해환을 나타내었으며, C. tropicalis는 포공영 주줄물을 200 μg/mL 농도로 주입시 2 mm, 어성초 추출물을 200 |ig/mL 농도로 주입시 2 mm, 작약 추출물을 200 |ig/mL 주입 시 3 mm 저 해 환을 나타내었다. 황련 추출물은 50, 100, 150, 200 μg/mL 농도로주입시 2, 3, 6, 9 mm의 저해환을 나타내었다.
- 3개의 spot&으로부터 분리된 3개의 compounds는 항균활성이 측정되었으며, 3개의 com- pounds중 한 개의 compound에서 항균활성을 확인하였다 (Table 2). 항균활성이 확인된 물질은 HPLC 분석을 통하여 berberin의 retention time과 일치하는 것으로 나타났다 (Fig 3).
- utils 3개 종에 대한항균활성은 나타나지 않았다. 황련 추출물에서 항균성분은 TLC와 HPLC 분석을 통하여 berberin인 것으로 나타났다.
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