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문제 정의
- 3)는 HCD군과 차이가 나지 않았다. 따라서 본 유산균들은 간의 LDL 수용체를 활성화하여 LDL-C의 농도를낮춘다고 가정할 수 있으몌2], 향후 연구를 통하여 이를 증명하고자 한다. 본 결과에서 유산균의 고지혈 저하효과는 열처리 유산균에서 더욱 증가되었다.
제안 방법
- 탈결합된 담즙산은 지질의 용해와 흡수 활성을 떨어뜨리기 때문에 이러한 반응은 혈중 콜레스테롤의 농도를 조절하는데매우 중요한 작용의 하나이다. 1209와 1702 균주를 배양하여 배지 내에 해리된 담즙산 정도를 O-phthalaldehyde를사용하여 측정하였다. 초기 사람의 담즙산인 콜릭산의 농도가 0.
- Korea)의 사료를 1주간 식이하였다. 1주간의 안정 식이 후, 30마리의 rat 에게는 고콜레스테롤 식이 (hypercholesterolemic diet, HCD) 를 공급하였고, 나머지 1마리의 랫트는 대조군으로써 기존의 사료를 공급하되 고콜레스테롤 식이와 같은 형태로 식이하기 위하여 분쇄하여 가루로 공급하였다. 고콜레스테롤식이의 조성은 Table 1과 같다.
- 이러한 생균의 유산균 저항 능력은 여러 논문에 보고된 바 있으며 콜레스테롤을 조절하는 유산균 스크리닝 방법으로 이용된다. [4, 7, 11], 두 유산균의 반응 특성을 알아보기 위하여 콜레스테롤 제거와 탈결합 tes를 수행하였다(Fig. 1). 생균 1209와 1702 균주는 콜레스테롤 함유 MRS 배지에서 24시간 배양한 후 콜레스테롤 측정용 kit로 분석한 결과 20.
- 고콜레스테롤 식이를 4주간 투여한 후 HCD군(156.5±31.2 mg/dL)과 콜레스테롤 비첨가 식이의 대조군(74.2±4.8 mg/dL)간의 콜레스테롤 차이를 확인하였다. 대조군, 고지혈증 유발랫트를 식 이 조건에 따라 HCD군(HCD only), 생균 1702와 1209를 함유하는 LLAB군(HCD + live LAB)과 가열살균된균주 1702와 1209를 함유하는 HKLABe-(HCD + heatkilled LAB)으로 나누고 7주간 실험을 진행하였다.
- 균체 회수에서 Lactobacillus rhamnosus CBT 1702 균주와 Lactobacillus plantarum CBT 1209 균주를 MRS 액체배지에서 37℃, 18시간 동안 각각 배양한 두], 500 xg에서 15분 동안 원심분리하여 증류수로 세척하고 1:1비율로 하여 10% skim milk 용액에 100배 농축되게 현탁시켰다. 농축시킨 균 액은 균이 균일하게 되도록 잘 섞고, 40℃에서 3일간동결건조시켰다.
- 실험군은 고콜레스테롤 식이를 4주간 식 이한 뒤 , 고콜레스테롤혈증이 유도되는 지 확인하였다. 다음 30마리의 랫트 실험군을 좀 더 세분화시켜 3군으로 나누어 7주 동안 고콜레스테롤 식이만 공급한 HCD군, 고콜레스테롤 식이에 살아있는 LAB을 첨가하여 공급한 LLAB군, 가열살균한 LAB와 고콜레스테롤 식이를 함께 공급한 HKLAB군으로 실험하였다.
- 담즙산에 대하여 저항성을 갖는 유산균주들로부터 콜레스테롤 저하 활성을 갖는 균주를 screening하였다. 약 50개의 유산균주들로부터 0.
- 8 mg/dL)간의 콜레스테롤 차이를 확인하였다. 대조군, 고지혈증 유발랫트를 식 이 조건에 따라 HCD군(HCD only), 생균 1702와 1209를 함유하는 LLAB군(HCD + live LAB)과 가열살균된균주 1702와 1209를 함유하는 HKLABe-(HCD + heatkilled LAB)으로 나누고 7주간 실험을 진행하였다. 먼저 4 개 랫트 그룹의 식이 섭취량에 대해 조사하였다.
- 가열살균은 110℃에서 15분간 처리하였으며 그 뒤 동결건조시켰다. 동결건조된 가루는 LLAB의 CFU(colony forming unit) 측정과 HKLAB의 계수 측정 (hematocytometic count- ing)을 위한 분석에 사용하였다.
- 동맥경화증과 심장질환에 대한 유산균의 효과를 알아보기위해 이들의 동맥경화지수인 AI와 심장위험인자 CRF을 비교하기 위하여 Table 32로부터 A]와 CRF의 값을 구하였다. 대조군의 AI는 1.
- 대조군, 고지혈증 유발랫트를 식 이 조건에 따라 HCD군(HCD only), 생균 1702와 1209를 함유하는 LLAB군(HCD + live LAB)과 가열살균된균주 1702와 1209를 함유하는 HKLABe-(HCD + heatkilled LAB)으로 나누고 7주간 실험을 진행하였다. 먼저 4 개 랫트 그룹의 식이 섭취량에 대해 조사하였다. 대조군에비하여 콜레스테롤 그룹들의 식이 섭취와 체중이 감소하는경향을 보였으나 유의적 차이를 나타내지는 않았다(Table 2).
- 05% Tween 80을 추가한 MRS 액체 배지에서 24시간, 37P의 혐기적 조건에서 정치배양하였다. 배양 후, 세포를 12,000xg에서 20분 동안 원심분리하여 배양 배지로부터 분리하고, 상층액의 콜레스테롤의 양을 즉정하기 위해 효소 kit(Asan Pharmaceutical Co., Korea)를 사용하였다’ 배양 배지 내의 해리된 담즙산과 결합상태의 담즙산 농도는 O-phthalaldehyde를 사용하여 측정하였다 [7, 11],
- 본 실험에서는 Table 1과 같은 식이 조성으로 먼저 고농도 콜레스테롤 식이를 공급하는 동물모델을 확립하였다. 고콜레스테롤 식이를 4주간 투여한 후 HCD군(156.
- 고콜레스테롤식이의 조성은 Table 1과 같다. 실험군은 고콜레스테롤 식이를 4주간 식 이한 뒤 , 고콜레스테롤혈증이 유도되는 지 확인하였다. 다음 30마리의 랫트 실험군을 좀 더 세분화시켜 3군으로 나누어 7주 동안 고콜레스테롤 식이만 공급한 HCD군, 고콜레스테롤 식이에 살아있는 LAB을 첨가하여 공급한 LLAB군, 가열살균한 LAB와 고콜레스테롤 식이를 함께 공급한 HKLAB군으로 실험하였다.
- 농축시킨 균 액은 균이 균일하게 되도록 잘 섞고, 40℃에서 3일간동결건조시켰다. 여기서 얻은 균체를 LLABQyophilized lactic acid bacteria, 균주 1702와 1209를 1:1비율로 함유라고 하였으며 가열살균한(heat-killed) LAB(가열살균 균주 1702와 1209를 1:1비율로 함유)를 HKLAB라고 하였다. 가열살균은 110℃에서 15분간 처리하였으며 그 뒤 동결건조시켰다.
- 콜레스테롤 흡수와 담즙산의 해리를 측정하기 위해, 균은 0.2% sodium thioglycoiate, 0, 2% sodium taurocholate, 0.3% water-soluble cholesterol, 0.05% Tween 80을 추가한 MRS 액체 배지에서 24시간, 37P의 혐기적 조건에서 정치배양하였다. 배양 후, 세포를 12,000xg에서 20분 동안 원심분리하여 배양 배지로부터 분리하고, 상층액의 콜레스테롤의 양을 즉정하기 위해 효소 kit(Asan Pharmaceutical Co.
- 전혈은 꼬리의 정맥으로부터 채혈하고, 혈액의 응고를 막기 위해 1% EDTA와 식염수가 혼합된 용액에 보관하였다. 혈장은 2,000xg에서 15분 동안 저속으로 원심분리하여 전혈로부터 분리하였으며, 혈중 콜레스테롤의 농도는 in vitro 상의 실험과 같은 방법으로 확인하였다. 동맥경화지 수(atherogenic index, AI) 와 심장위험인 자(cardiac risk factor, CRF)는 아래의 식으로 계산하였다.
대상 데이터
- 2주령 된 40마리의 랫트(Male Sprague-Dawley)을 주)대한바이오링크(Seoul, Korea)에서 구입하고, 온도와 습도는 표준 조건 하에서 유지하고 (주}삼양사료 (Seoul. Korea)의 사료를 1주간 식이하였다. 1주간의 안정 식이 후, 30마리의 rat 에게는 고콜레스테롤 식이 (hypercholesterolemic diet, HCD) 를 공급하였고, 나머지 1마리의 랫트는 대조군으로써 기존의 사료를 공급하되 고콜레스테롤 식이와 같은 형태로 식이하기 위하여 분쇄하여 가루로 공급하였다.
- 본 실험에서 사용한 Lactqpacillus rhamnosus CBT 1702, Lactobacillus plantarum CBT 1209 균주와 다른 유산균은 Cellbiotech Co. (Kimpo, Kprea)의 보관균주를 사용하였다. 또한 모든 유산균은 MRS 배지(Difco)예서 계대배양흐}여 보존하였다.
데이터처리
- 0) 프로그램을 이용하여 평균값(mean)과 표준편차(SD)를 계산하였다. 각 군 간에 차이를 살펴보기 위하여유의수준은 p<0.05에서 One-way ANOVA를 사용하여 분산분석하였다. 유의한 차이가 있는 경우 Duncan's multiple range tes1를 실시하여 각 군별 차이를 검증하였다n
- 모든 실험결과는 SPSS(Statistical Package for Social Science 12.0) 프로그램을 이용하여 평균값(mean)과 표준편차(SD)를 계산하였다. 각 군 간에 차이를 살펴보기 위하여유의수준은 p<0.
- 05에서 One-way ANOVA를 사용하여 분산분석하였다. 유의한 차이가 있는 경우 Duncan's multiple range tes1를 실시하여 각 군별 차이를 검증하였다n
성능/효과
- 가지가 있다. 1) 간의 콜레스테롤이 담즙산 합성으로 감소되면 간의 LDL-C 수용체가 활성화되어 혈액의 LDL-C을사용하여 혈중 콜레스테롤이 감소된다. 2) 담즙산과 콜레스테롤이 체외로 배출되면 간은 혈중 콜레스테롤로부터 담즙산을 합성함으로써 혈중 콜레스테롤이 감소된다[17-19L 이와 같은 기작으로 볼 때 Table 3의 혈액 내 콜레스테롤 저하관련 인자들 실험에서 HKLAB군이 LLAB군보다 모두 좋은 결과를 보였으며 가열살균한 HKLAB군이 담즙산을 더배출되도록 작용하므로 LLAB군보다 HKLAB군을 복용하는것이 훨씬 콜레스테롤 관련 문제해결에 더 많은 도움이 될것으로 생각되었다.
- 1) 간의 콜레스테롤이 담즙산 합성으로 감소되면 간의 LDL-C 수용체가 활성화되어 혈액의 LDL-C을사용하여 혈중 콜레스테롤이 감소된다. 2) 담즙산과 콜레스테롤이 체외로 배출되면 간은 혈중 콜레스테롤로부터 담즙산을 합성함으로써 혈중 콜레스테롤이 감소된다[17-19L 이와 같은 기작으로 볼 때 Table 3의 혈액 내 콜레스테롤 저하관련 인자들 실험에서 HKLAB군이 LLAB군보다 모두 좋은 결과를 보였으며 가열살균한 HKLAB군이 담즙산을 더배출되도록 작용하므로 LLAB군보다 HKLAB군을 복용하는것이 훨씬 콜레스테롤 관련 문제해결에 더 많은 도움이 될것으로 생각되었다.
- lactis subsp. lactise] 가열살균 균이 in vivo'0에서 콜레스테롤을 저하시킨다는 것을 보고하였다[9, 12], 그러나 in vivo 실험에서 가열살균한 균이 콜레스테롤을 저하시킨다는 보고는 아직 없는데 본 논문에서는 in 에서 생균보다 가열살균한 1702와 1209 균주가 콜레스테롤 관련 인자들에 더 효과적인 것을 확인하였다.
- 결론적으로 본 유산균은 고지혈 랫트의 AI를 감소시켜 동맥경화의 가능성을 감소시켰으며 이의 가열살균 균체는 이에 더욱 효과적이었으며 이러한 증상을 개선시키는 유용한기능성 원료로 가능성을 보여주었다.
- 유산균 섭취군의 경우, 특히 HKLAB군은 HCD군 및 LLAB군과 비교하여 HDL-C를약 20%씩 유의적으로 증가시키고 LDL-C를 각각 60%, 20% 정도 씩 유의적으로 감소시켰다. 그리고 HDL/LDL-C 값에서는 HCD군, LLAB군에 비해 각각 200%, 40% 정도유의적으로 증가시키는 효과를 나타내었다. 이 결과로 가열살균 유산균의 콜레스테롤 저하 활성은 HDL-C를 증가시키는 것과 이 증가시키는 정도의 2배 이상 LDL-C를 감소시킴으로서 이루어지는 것을 알 수 있었다.
- 6배 정도 유의적으로 낮아졌다. 그리고 대조군의 CRF는 2.01±0.14이고 HCD 군은 5.2±0.43이었으며 LLAB군과 HKLAB군은 3.4±0.32와 2.6±0.13로, LLAB군과 HKLAB군은 HCD군 대비 각각 1.5 배, 2배 유의적으로 낮아졌다(Fig. 2). 그리고 HKLAB군은 LLAB군에 비해 AI는 30% 유의적으로 낮고 CRF도 24% 유의적으로 낮았다’ 따라서 이러한 질환에 대한 위험도가 유산균에 의하여 유의적으로 낮아짐을 알 수 있었으며 가열살균한 균주 1702와 1209를 식이한 HKLAB군이 생균 식이 LLAB군보다 유의적인 차이를 보여 더 효과적인 것으로 나타났다.
- 이 결과로 가열살균 유산균의 콜레스테롤 저하 활성은 HDL-C를 증가시키는 것과 이 증가시키는 정도의 2배 이상 LDL-C를 감소시킴으로서 이루어지는 것을 알 수 있었다. 그리고 생균은 HKLAB군보다는 약하여 LDL-C저하에만 효과를 보였다. 이와 같이 가열살균한 HKLAB군이 HDL-C와 LDL-C에 대하여 바람직한 방향으로 뛰어난 기능을 갖는 것을 확인하였으며 이러한 in vivo 실험은 아직 보고된 바 없다.
- 다음으로 유산균 섭취에 의한 혈 중 콜레스테롤량을 조사한결과 HCD군의 경우 204±6.2 mg/dl에서 LLLAB군은 131.9 +17.5 mg/dL, HKLAB군은 125.0±16.5 mg/dL로 LLLAB군과 HKLAB군이 콜레스테롤 농도를 HCD군 대비 각각 35%, 40%정도 씩 유의적으로 감소시켰다(Table 3). 여기에서 가열살균 균주 1702와 1209를 투여한 HKLAB에서 총 콜레스테롤 저하효과가 이들 생균체 식이인 LLAB군보다 유의적이진 않지만 5% 더 좋은 것을 알 수 있었다.
- 먼저 4 개 랫트 그룹의 식이 섭취량에 대해 조사하였다. 대조군에비하여 콜레스테롤 그룹들의 식이 섭취와 체중이 감소하는경향을 보였으나 유의적 차이를 나타내지는 않았다(Table 2).
- 대조군의 AI는 1.0±0.05이고 HCD군은 4.1±0.1이었으며 LLAB군과 HKLAB군은 2.3±0.2와 1.6±0.15로, LLAB군과 HKLAB군은 HCD군 대비 각각 1.8배, 2.6배 정도 유의적으로 낮아졌다. 그리고 대조군의 CRF는 2.
- 그리고 HKLAB군은 LLAB군에 비해 AI는 30% 유의적으로 낮고 CRF도 24% 유의적으로 낮았다’ 따라서 이러한 질환에 대한 위험도가 유산균에 의하여 유의적으로 낮아짐을 알 수 있었으며 가열살균한 균주 1702와 1209를 식이한 HKLAB군이 생균 식이 LLAB군보다 유의적인 차이를 보여 더 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 동맥경화와 심장질환의 예방 및 치료에는 생균보다는 가열살균한 1209와 1702 균을 복용하는 것이 보다 효과적일 것으로 생각되었다.
- 1) 이러한 담즙산이 탈결합되는 반응을 확인하였다. 따라서 본 Lactobacillus rhamnosus CBT 1702와 Lactobacillus plantarum CBT 1209는 콜레스테롤의 동화와탈결합 활성이 동시에 있음을 확인할 수 있었다.
- lactisA 배지에서 콜레스테롤을 동화하는데 가열살균한 균이 생균의 25% 정도 제거한다고 보고하였다[9]. 따라서 본균주의 활성은 이들 보고 [9, 12}와 같이 콜레스테롤 혼합물의 동화능력 (assimilation capacity)에 의한 것으로 추정할 수 있었으며 이들 가열살균한 균도 생균에 비해 떨어지나 제거능력을 어느 정도 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 본 결과로 랫트 모델에서유산균이 콜레스테롤을 감소시키는 활성을 갖는 것을 확인하였다. 또한 가열살균 유산균에 의한 콜레스테롤 저하 보고는 in vitro 실험은 있으나[9, 12] in vivo 실험은 아직 보고된 바 없는데 본 실험에서 가열살균한 균을 식 이한 HKLAB군이 생균을 식이한 LLAB군보다 콜레스테롤 제거에 유의적이지는 않지만 5% 더 좋은 것을 알았다.
- 유산균의 어느 성분이 혈중 LDL-C의 농도를 감소시키는지는 확실치 않으나 본 균주의 성분이 혈중 LDL-C를 낮추는데 영향을 주는 형태로 전환된다고 판단된다. 또한 생균체 식 이는 HDL-C의 농도에는거의 영향을 주지 못하였으나 가열살균 유산균은 HDL-C을 20% 정도 높이는 기능을 갖는 것으로 보아 생균체보다는 가열살균체가 고지혈 저하 효과에 더욱 효과적이라고 생각되었다. 이는 가열살균에 의해 균주의 어떤 성분이 낮아진 HDL-C의 농도를 정상상태에 가깝도록 올리는 기능을 하도록 하는 형태로 전환된다고 생각되었다.
- 이상을 초래할 수 있다[9]. 본 결과로 랫트 모델에서유산균이 콜레스테롤을 감소시키는 활성을 갖는 것을 확인하였다. 또한 가열살균 유산균에 의한 콜레스테롤 저하 보고는 in vitro 실험은 있으나[9, 12] in vivo 실험은 아직 보고된 바 없는데 본 실험에서 가열살균한 균을 식 이한 HKLAB군이 생균을 식이한 LLAB군보다 콜레스테롤 제거에 유의적이지는 않지만 5% 더 좋은 것을 알았다.
- 따라서 본 유산균들은 간의 LDL 수용체를 활성화하여 LDL-C의 농도를낮춘다고 가정할 수 있으몌2], 향후 연구를 통하여 이를 증명하고자 한다. 본 결과에서 유산균의 고지혈 저하효과는 열처리 유산균에서 더욱 증가되었다. 유산균의 어느 성분이 혈중 LDL-C의 농도를 감소시키는지는 확실치 않으나 본 균주의 성분이 혈중 LDL-C를 낮추는데 영향을 주는 형태로 전환된다고 판단된다.
- 본 실험에서 유산균(균주 1702와 1209)을 섭취한 LLAB 군은 HCD군과 비교 시에 LDL-C가 50%정도 감소하였으며다른 인자인 HDL-C, triglyceride(Table 3)와 fecal bile acid(Fig. 3)는 HCD군과 차이가 나지 않았다. 따라서 본 유산균들은 간의 LDL 수용체를 활성화하여 LDL-C의 농도를낮춘다고 가정할 수 있으몌2], 향후 연구를 통하여 이를 증명하고자 한다.
- 본 연구에서는 랫트 실험을 통호}여 screening한 CBT 1702와 1209 균주가 콜레스테롤을 낮추는 기능을 가진 것을 확인하였다. 또한 가열살균한 유산균이 in vivo에서콜레스테롤을 저하시킨다는 보고는 아직 없는데 이의 균들을 가열하여 사멸시킨 경우 혈중 콜레스테롤 저하에 더욱 효과젘인 것을 알았다.
- 1). 생균 1209와 1702 균주는 콜레스테롤 함유 MRS 배지에서 24시간 배양한 후 콜레스테롤 측정용 kit로 분석한 결과 20.4mg/mL의콜레스테롤을 15.4 mg/mL4 11.9 mg/mL로 각각 25%, 42% 나 감소시켰다(Fig. 1A). 그러나 이들 열처리 균주들은 감소력이 약하여 각각 대조군에 비해 12%와 21% 감소시켰다 (Fig.
- 저하 활성을 갖는 균주를 screening하였다. 약 50개의 유산균주들로부터 0.2% sodium thioglycolate, 0.2% sodium taurocholate, 0.3% cholesterol 첨가한 MRS배지에서 성장성 이 보이는 Lactobacillus plantarum CBT 1209 와 Lactobacillus rhamnosus 1702균주를 얻었다. 이러한 생균의 유산균 저항 능력은 여러 논문에 보고된 바 있으며 콜레스테롤을 조절하는 유산균 스크리닝 방법으로 이용된다.
- 5 mg/dL로 LLLAB군과 HKLAB군이 콜레스테롤 농도를 HCD군 대비 각각 35%, 40%정도 씩 유의적으로 감소시켰다(Table 3). 여기에서 가열살균 균주 1702와 1209를 투여한 HKLAB에서 총 콜레스테롤 저하효과가 이들 생균체 식이인 LLAB군보다 유의적이진 않지만 5% 더 좋은 것을 알 수 있었다.
- 그리고 HDL/LDL-C 값에서는 HCD군, LLAB군에 비해 각각 200%, 40% 정도유의적으로 증가시키는 효과를 나타내었다. 이 결과로 가열살균 유산균의 콜레스테롤 저하 활성은 HDL-C를 증가시키는 것과 이 증가시키는 정도의 2배 이상 LDL-C를 감소시킴으로서 이루어지는 것을 알 수 있었다. 그리고 생균은 HKLAB군보다는 약하여 LDL-C저하에만 효과를 보였다.
후속연구
- 그리고 다른 가능성으로는 세포가 열에 의해 파괴됨으로써 세포질의 기능 물질들이 용출되어 콜레스테롤을 저하시켰을 가능성도 있다. 세포질의 어떤 물질이 어떤 기작으로 콜레스테롤 저하에 효과가 있는지는 앞으로 검토할 예정이다.
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