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문제 정의
- 그러나 이 방법은 전처리 방법이 간편하다는 큰 장점을 가지고 있었기 때문에 본 연구에서는 일본 후생성 방법을 더 보완하고 변형시켜 간편하면서도 기기에 그다지 무리가 없는 erythromycin 항생제를 분석하는 방법을 고안하였다.
- 따라서 본 연구에서는 어류 및 갑각류 등 수산물에 잔류하는 erythromycin 항생제 분석방법을 확립하기 위해 기존의 연구자들이 보고한 방법 (Horie et al, 2003; Deubel et al., 2006; Labour and Welfare report, 2006)을 개량하여 전처리 및 분석조건을 검토하여 erythromycin 분석 방법을 확립하였다.
- , 1998; Lingerfelt and Champney, 1999)들을 보더라도 회수율 면이나 복잡한 전처리, 검출감도는 그다지 양호한 편이 아니었다. 최근 들어 외국문헌들이 LC-MS기기를 이용하여 erythromycin을 분석하는 사례들이 점차 느는 주세이고본 연구에서도 erythromycin이 어류질병 치료목적으로 많이 사용하고 있음에도 불구하고 검출방법이 국내에는 없었기 때문에 수산물에 적합한 LC-MS-MS 분석조건을 찾고자 하였다. 그 결과 Single MS를 이용하여 erythromycin을 분석한 Horie et al.
제안 방법
- Erythromycin 표준품 각 10 mg씩을 100 mL 용량 플라스크에 취하고 methan이에 녹여 100“g/mL 농도의 stock solution을 조제하였다. Working solutione stock solution 10mL을 정확히 취하여 100 mL 용량 플라스크에 옮기고 이동상으로 표시선까지 채운 표준용액을 5.
- HPLC 기기는 Finnigan Surveyor (Thermo, USA)를 사용하여 Cis column (Shiseido UG 120 V, 2 mm IDxl50 mm)을 시■용하여 0.2% acetic acid/water 용액과 0.2% acetic acid/acetonitrile 용액을 80:20의 비율로 초기 이동상으로 하여 흘리다가 10분후 50:50으로 gradient시킨 후 다시 초기 이동상으로 하여 20분간 분석하였다. 이때 column 온도는 40℃를 유지하였으며, 유속은 0.
- LC-MS/MS 조건으로는 Finnigan TSQ Quantum (Thermo, USA)을 사용하여 ESI와 positive 방식으로 nebulization4 collision gas는 질소와 아르곤으로 분사 및 이온화시켰으며 spray voltage, capillary 온도, collision energy와 cone voltage 는 각각 4, 500 V, 350℃, 22 V 및 114V로 고정하였다. Erythromycin 항생제의 precursor ion (m/z)은 735이며, fragment ion (m”z)은 577로 정량하고, fragment ion (m/z) 158은 확인하였다.
- 그러나 본 연구는 acetonitrile/water (4:6) 혼합액을 사용하여 hexane층으로 분리하였을 때 제대로 증분리가 되지 않거나 시료 속에 있는 여러가지 방해물질들이 hexane층으로 이행되지 않고 남아 filter과정에서 filtration이 잘 되지 않는 애로사항이 있어서 methanol이 오히려 그런 현상들이 없는 것으로 예상되어 methanol을 사용하여 그 회수율을 비교해보았다. Methanol을 50, 70, 90, 100% methanol 혼합액과 acetonitrile/water (4:6) 혼합액을 비교한 결과, acetonitrile/ water 혼합액이 filtration이 되지 않음에도 불구하고 90%의 높은 회수율을 나타내 었고, 50%, 70% methanol 혼합액은 약 33%, 65%의 낮은 회수율을 보였으나 90%, 100% methanol 혼합액은 100%의 가까운 회수율을 나타내어 본 연구에서는 정용액을 90% methanol을 선택하여 시험에 행하였다.
- MgSQ의 첨가량에 따라서 회수율을 비교검토한 결과, 첨가하지 않은 것과 첨가한 것 사이에 상당한 차이를 보였다. MgSO4 첨가하지 않은 경우 회수율이 100%에 가깝게 나타났으나, 2g 이상 첨가한 경우 회수율이 40% 이상 떨어져 본 연구에서는 MgSQ를 첨가하지 않고 전처리를 행하였다.
- Working solutione stock solution 10mL을 정확히 취하여 100 mL 용량 플라스크에 옮기고 이동상으로 표시선까지 채운 표준용액을 5.0, 10, 20, 50, 100, 200n以mL로 희석하여 사용하였다. 항생 제 표준원액 (stock solution)은 4C 에서 3개월까지 보관하며 사용하였고, working solutione 시험 때마다 만들어 사용하였다.
- 각 농도의 erythromycin 표준용액 (5, 10, 20, 50, 100, 200 1回g)을 10 “L씩 취하여 3회 반복 분석한 chromatography로부터 각각의 항생제에 대한 농도별 평균면적을 구하여 X축을 농도, Y축을 면적으로 하여 검량선을 작성하였다.
- 0 mL acetonitrile/water (4:6) 혼합액 으로 하는 사용하였다. 그러나 본 연구는 acetonitrile/water (4:6) 혼합액을 사용하여 hexane층으로 분리하였을 때 제대로 증분리가 되지 않거나 시료 속에 있는 여러가지 방해물질들이 hexane층으로 이행되지 않고 남아 filter과정에서 filtration이 잘 되지 않는 애로사항이 있어서 methanol이 오히려 그런 현상들이 없는 것으로 예상되어 methanol을 사용하여 그 회수율을 비교해보았다. Methanol을 50, 70, 90, 100% methanol 혼합액과 acetonitrile/water (4:6) 혼합액을 비교한 결과, acetonitrile/ water 혼합액이 filtration이 되지 않음에도 불구하고 90%의 높은 회수율을 나타내 었고, 50%, 70% methanol 혼합액은 약 33%, 65%의 낮은 회수율을 보였으나 90%, 100% methanol 혼합액은 100%의 가까운 회수율을 나타내어 본 연구에서는 정용액을 90% methanol을 선택하여 시험에 행하였다.
- (2003)방법에서 두 가지를 적용시켜 우리 실정에 맞는 방법을 고안하였는데, 첫째로 erythromycine 이동상을 조제할 때 pH 3 이하의 산성조건에서는 분해되어 peak의 형태가 나타나지 않으므로 그 이상이 되는 시약인 acetic acid를 사용하여 gradient 한 결과 peak의 형태와 감도면에서 대체로 양호한 결과를 나타내었다. 두번째는 precursor ion (m/z)인 734 (SIM mode)만 가지고 분석한 Horie et al. (2003)의 방법을 본 연구는 SRM mode로 한 번 더 이온화시켰다. 그 결과, erythromycin 항생 제 의 주요 fragment 이 온 (m/z)들은 578, 577 로 나타났으며, 이들 이온들을 SRM mode로 선택하여 577을정량하기 위한 이온으로 하고, 158은 확인하는 이온으로 사용하였다.
- 또한 일본 후생성 방법은 acetonitrile 추출액과 MgSCX를 함께 첨가하여 수분을 제거하는 과정이 있는데 본 연구에서는 70% acetonitrile을 사용하였기 때문에 일본 후생성 방법과는 다른 NaCl을 첨가하여 층분리시켜 수분을 1차로 제거한 후다시 acetonitrile 포화 hexane으로 증분리하고 난 후 MgSCM 첨가하는 방식을 취하였다. MgSQ의 첨가량에 따라서 회수율을 비교검토한 결과, 첨가하지 않은 것과 첨가한 것 사이에 상당한 차이를 보였다.
- 상증액은 다시 acetonitrile 포화 hexane 100 mL를 첨가하여 다시 10분간 강하게 흔든 다음 분리될 때까지 정치시켰다. 분리된 하층액을 받아서 n-propanol 10mL를 첨가하여 40 ℃ 에서 감압농축시켜 건고한 잔사를 90% methanol 2 mL로 정용한 후 다시 acetonitrile 포화 hexane 10mL를 첨가하여 30초 간 흔든 후 5,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 그 하층액을 여과 (0.22#m, PTFE)하여 LC-MS/MS로 분석하였다. 시료 전처리 과정은 Fig.
- 시험방법의 회수율을 조사하기 위하여 넙치 및 새우시료에 농도를 알고 있는 erythromycin 표준용액 10, 50, 100ng/g을 가하여 분석하고 얻어진 크로마토그램의 peak 면적비를 이용하여 회수율을 구하였다.
- 시험용액 분석에서 얻은 chromatogram으로부터 각 성분에 대하여 머무름 시간이 일치되는 각각의 peak에 대한 평균면적을 구한 다음 검량선 좌표의 Y축에 동일한 값을 표시하고이 값과 검량선상 만나는 점에서 수직으로 X축과 만나는 점이 시험용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시험용액의 희석배수(잔류물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료무게로 나누어 최종시료 중 각 성분의 농도를 산출하였다.
- 시험용액의 농도를 나타낸다. 이 농도에 시험용액의 희석배수(잔류물에 가한 이동상의 부피)를 곱하고 시료무게로 나누어 최종시료 중 각 성분의 농도를 산출하였다.
- 일본 후생성 방법 의 시료추출과정은 acetonitrile을 사용하였기 때문에 본 연구에서도 acetonitrile을 50%, 60%, 70%, 90%, 100%로 각각 나누어 추출하여 그 상대회수율을 비교하였다. 그 결과 50%에서는 평균 24.
- 표준 검량선 작성은 표준물질 10mg을 정확히 달아 100 mL 용량 플라스크에 취하고 methanee에 녹여 100以g/mL 농도로 조제하였다. 이 표준용액을 acetonitrile로 5, 10, 20, 50, 100, 200 ng/mL 농도로 희 석 하여 분석한 결과 직 선성 (『값)은 0.
대상 데이터
- Louis MO, USA)의 제품을, 항생제 추출시약으로 증류수, acetonitrile, methanol, MgSQi 등은 Merck (Germany)의 제품을 사용하였으며, 기타 시약은 HPLC급이나 특급을 사용하였다. 실험에 사용한 넙치와 새우는 껍질을 벗기고 내장을 제거한 후 육만을 사용하여 잘게 다진 후 실험에 사용하였고, 실험 전까지 -20℃ 에 보관하였다.
- 항생 제 의 표준품으로 erythromyciane Sigma사 (St. Louis MO, USA)의 제품을, 항생제 추출시약으로 증류수, acetonitrile, methanol, MgSQi 등은 Merck (Germany)의 제품을 사용하였으며, 기타 시약은 HPLC급이나 특급을 사용하였다. 실험에 사용한 넙치와 새우는 껍질을 벗기고 내장을 제거한 후 육만을 사용하여 잘게 다진 후 실험에 사용하였고, 실험 전까지 -20℃ 에 보관하였다.
- 0, 10, 20, 50, 100, 200n以mL로 희석하여 사용하였다. 항생 제 표준원액 (stock solution)은 4C 에서 3개월까지 보관하며 사용하였고, working solutione 시험 때마다 만들어 사용하였다.
이론/모형
- 검출한계 및 정 량한계는 R. Causon (1997) 보고서에 따라서 구하였다. 그 결과 검출한계 (LOD, Limit of Detection)은 1.
성능/효과
- 방식을 취하였다. MgSQ의 첨가량에 따라서 회수율을 비교검토한 결과, 첨가하지 않은 것과 첨가한 것 사이에 상당한 차이를 보였다. MgSO4 첨가하지 않은 경우 회수율이 100%에 가깝게 나타났으나, 2g 이상 첨가한 경우 회수율이 40% 이상 떨어져 본 연구에서는 MgSQ를 첨가하지 않고 전처리를 행하였다.
- 비교하였다. 그 결과 50%에서는 평균 24.6%로 나타났고 60%-80% 추출액은 96.3%-98.7%로 높게 나타내다가 100%일 때는 감소하는 경향이 보였다. 또한 시료 중에서 다소 색소를 함유한 새우시료의 경우 50%-100% 사이의 acetonitrile 추출을 비교하였을 때 acetonitrile 함유량이 높을수록 색소들이 많이 용출되어 색소증을 제거시키는데 hexane이 많이 소모되었고, 다른 한편으로 물 함유량이 높을수록 색소들은 많이 용출되지 않았으나 erythromycin이 물에 잘 용해되지 않는 특성 때문에 회수율이 낮아진 결과, 회수율도 높고 색소 등 방해물질이 비교적 적은 70% acetonitrile 추출이 가장 양호한 것으로 확인되 었다 (Data not shown).
- 최근 들어 외국문헌들이 LC-MS기기를 이용하여 erythromycin을 분석하는 사례들이 점차 느는 주세이고본 연구에서도 erythromycin이 어류질병 치료목적으로 많이 사용하고 있음에도 불구하고 검출방법이 국내에는 없었기 때문에 수산물에 적합한 LC-MS-MS 분석조건을 찾고자 하였다. 그 결과 Single MS를 이용하여 erythromycin을 분석한 Horie et al. (2003)방법에서 두 가지를 적용시켜 우리 실정에 맞는 방법을 고안하였는데, 첫째로 erythromycine 이동상을 조제할 때 pH 3 이하의 산성조건에서는 분해되어 peak의 형태가 나타나지 않으므로 그 이상이 되는 시약인 acetic acid를 사용하여 gradient 한 결과 peak의 형태와 감도면에서 대체로 양호한 결과를 나타내었다. 두번째는 precursor ion (m/z)인 734 (SIM mode)만 가지고 분석한 Horie et al.
- Causon (1997) 보고서에 따라서 구하였다. 그 결과 검출한계 (LOD, Limit of Detection)은 1.0 ng/mL, 정 량한계 (LOQ, Limit of Quantitation)는 10 ng/mL로 대상물질의 분리도 (S/N 비) 등이 뛰어났으며, 낮은 parts per billion (ppb) 범위의 극미량 존재 시에도 정량분석이 가능함을 알 수 있었다.
- (2003)의 방법을 본 연구는 SRM mode로 한 번 더 이온화시켰다. 그 결과, erythromycin 항생 제 의 주요 fragment 이 온 (m/z)들은 578, 577 로 나타났으며, 이들 이온들을 SRM mode로 선택하여 577을정량하기 위한 이온으로 하고, 158은 확인하는 이온으로 사용하였다. 따라서 질량분석기의 SRM 방식에서 precursor 이온은 [M+H]+ 즉, 수소화된 분자이온을 사용하여 Q2에서 생성된 product 이온을 모니터링 하였을 때 erythromycin 항생제에 대한 질량 spectrum과 SRM 크로마토그램을 Fig.
- 7%로 높게 나타내다가 100%일 때는 감소하는 경향이 보였다. 또한 시료 중에서 다소 색소를 함유한 새우시료의 경우 50%-100% 사이의 acetonitrile 추출을 비교하였을 때 acetonitrile 함유량이 높을수록 색소들이 많이 용출되어 색소증을 제거시키는데 hexane이 많이 소모되었고, 다른 한편으로 물 함유량이 높을수록 색소들은 많이 용출되지 않았으나 erythromycin이 물에 잘 용해되지 않는 특성 때문에 회수율이 낮아진 결과, 회수율도 높고 색소 등 방해물질이 비교적 적은 70% acetonitrile 추출이 가장 양호한 것으로 확인되 었다 (Data not shown).
- 새우와 넙 치 시 료에 표준품을 각각 10 ng/g, 50 ng/g, 100 ng/g 농도가 되도록 첨가하여 회수율을 본 결과 넙치시료는 10ng/g 시험구에서는 평균 91.6%, 50ng/g는 평균 84.4%, 100 ng/g는 평균 98.8%이었으며, 새우시료는 10ng/g 시험구에서 평 균 109.4%, 50 ng/g는 평균 Ⅲ.2%, 100 ng/g는 평균 109.6% 로 나타나 오히려 넙치보다는 새우시료에서 약간 높은 회수율을 보였다 (Table 2).
- 조제하였다. 이 표준용액을 acetonitrile로 5, 10, 20, 50, 100, 200 ng/mL 농도로 희 석 하여 분석한 결과 직 선성 (『값)은 0.9997을 나타내어 아주 양호한 것으로 확인되었다 (Fig. 4).
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