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문제 정의
- 槐花의 여러 작용이 알려져 있으나, 아직 대식세포에서 항염증 작용에 대해서는 정확히 알려지지 않았다. 이에 우리는 槐花의 항염증 작용 기전을 조사하였다.
제안 방법
- 동일한 양의 단백질을 샘플링 버퍼 (4X)를 같이 넣어 섞은 다음 그 샘플을 10% SDS-PAGE에 전기영동 한 후 5% skim milk로 2 시간 blocking 하였다. ERK, p38, JNK의 phosphorylation과 Ik-Ba을 ECL detection 용액 (Amersham)으로 확인하였다.
- LPS (500 ng/ml)로 RAW 264.7 cell을 자극하기 전 槐花 추출물을 1시간동안 전 처리 하였다. Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS (500 ng/ml)로 자극한 후 24시간 뒤 이들 염증매개물을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다.
- 사용한 primer는 다음과 같다. PCR반응이 끝난 후 1X 샘플링 buffer를 섞은 뒤 1.5% agarose gel에 10 ㎕씩을 넣고 전기영동한 후 자외선을 이용하여 반응을 확인하였다.
- RAW 264.7 cell을 60 mm culture dish에 5 x 106 cells/ml로 세포를 배양하고 serum free media( RPMI 1640)로 12시간 starvation 시킨 후 槐花 (500 mg/ml)를 전처리 하고 1시간 뒤에 LPS (500 ng/ml)로 자극하여 cold PBS로 3회 세척한 후 시간별로(0, 15, 30, 60 min) cell을 harvest하여 cell을 얻은 뒤 원심분리 (5,000 rpm, 5 min) 하여 그 상층액을 버리고 cell pellet을 수거하였다. lysis buffer (lysis buffer 1 ml + phosphotase inhibitor 10㎕ + protase inhibitor 10 ㎕)를 넣어 단백질을 lysis 시켜서 원심 분리 (15,000 rpm, 20 min)하여 찌꺼기를 가라앉히고 단백질 정량하였다.
- 槐花가 RAW 264.7 cell에서 전염증성 인자들에 대한 영향을 조사하기위하여, 염증성 세포활성물질의 생성을 조사하였다. 槐花를 전처리한 후 LPS로 자극하여 ELISA 방법으로 IL-1b, IL-6, TNF-a를 측정한 결과 槐花 추출물이 IL-1b, IL-6의 생성은 억제하지 못하였으나, TNF-a를 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다(Fig.
- 7 cell에서 LPS에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 槐花를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과 LPS로 자극한 대조군에 비해 槐花 추출물을 전 처리한 군에서 농도 의존적으로 NO 생성이 감소하고 있음을 알 수 있다(Fig.
- 槐花의 세포독성에 관해 알아보기 위하여 RAW 264.7 cell에 槐花를 농도 의존적으로 처리하여 24 시간 후에 세포의 생존율을 측정하였다. Fig.
- 7 cell의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 2 x 105 의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 槐花를 처리하였다. 24시간 동안 배양한 뒤 5 mg/ml의 농도로 배양하기 위해서 MTT용액을 첨가하고 다시 30분 동안 배양하였다.
- 7 cell에서 NO와 전염증성 사이토카인(IL-1b, IL-6, TNF-a)의 발현에 대한 실험을 하였고, MAPKs family인 extracelluar signal-regulated kinase (ERK 1/2), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 및 p38에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 NF-kB의 활성 지표가 될 수 있는 inhibitory kappa B a (Ik-Ba)를 조사하였다.
- . 물 추출물에서의 항염효과에 대해서 조사하기 위하여 먼저 槐花가 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 槐花를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다.
- 이에 槐花가 LPS로 유도한 대식세포의 활성화를 억제하는 효과를 검증하고자 마우스 대식 세포주인 RAW 264.7 cell에서 NO와 전염증성 사이토카인(IL-1b, IL-6, TNF-a)의 발현에 대한 실험을 하였고, MAPKs family인 extracelluar signal-regulated kinase (ERK 1/2), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 및 p38에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 NF-kB의 활성 지표가 될 수 있는 inhibitory kappa B a (Ik-Ba)를 조사하였다.
- A)로 540 nm에서 측정하였다. 일산화질소의 농도는 아질산염의 표준커브로부터 계산하였다.
대상 데이터
- C57BL/6 6주령 암컷을 오리엔트(성남, 경기도)에서 구입하여 사용하였다.
- Fetal bovine serum(FBS), RPMI-1640, penicillin-streptomycin 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 배양조는 Corning(Rochester,USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 chloroform, Tri-zol, sodium dodesyl sulfate(SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA(St.
- anti-mouse IL-1b, IL-6, TNF-a antibodies, 재조합 IL-1b, IL-6, TNF-a는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입했다.
- 꽃받침은 얕게 갈라지고, 주머니모양의 화관은 5편으로 피고 각 편은 크기 및 모양이 각각 다르다. 수술은 10개이고 그 기부는 합착되어 있으나 끝은 갈라지고 화관에 따라서 구부러져 있다. 암술은 1개이며 짧고 작다1).
- Fetal bovine serum(FBS), RPMI-1640, penicillin-streptomycin 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 배양조는 Corning(Rochester,USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 chloroform, Tri-zol, sodium dodesyl sulfate(SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA(St. Louis,USA)사에서 구입하였으며, 실험에 사용된 항체인 anti-phospho-ERK1/2, anti-phospho-p38, anti-Ik-Ba, anti-phospho-JNK는 Cell signaling사에서 구입하였다. anti-mouse IL-1b, IL-6, TNF-a antibodies, 재조합 IL-1b, IL-6, TNF-a는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입했다.
- 실험에 사용한 槐花(Sophora Japonica L.)는 옴니허브에서 구입하여 원광대학교 한의과대학 본초학 교실에서 槐花로서 확인을 받은 후 사용하였다. 槐花 추출물을 얻기 위하여 물 1 L에 100 g을 넣고 2시간 30분 동안 전탕한 액을 동결 건조하여 3차 증류수에 녹여서 필터한 후 사용하였다
데이터처리
- 실험결과에 대한 통계처리는 students' t-test에 준하였고 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- The cells were treated with SJ water extract at indicated concentration for 1 h, and then incubated with or without 500 ng/ml LPS for 24 h. NO release was measured by the method of Griess.*P < 0.
- 7 cell을 자극하기 전 槐花 추출물을 1시간동안 전 처리 하였다. Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS (500 ng/ml)로 자극한 후 24시간 뒤 이들 염증매개물을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다.
- RAW 264.7 cell의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 2 x 105 의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 槐花를 처리하였다.
- Tri-zol로 추출한 RNA는 MML-V reverse transcriptase의 protocol을 사용하여 cDNA로 합성하였다. 역전사 반응을 위하여 total RNA (1 ㎎)에 0.
성능/효과
- 槐花를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과 LPS로 자극한 대조군에 비해 槐花 추출물을 전 처리한 군에서 농도 의존적으로 NO 생성이 감소하고 있음을 알 수 있다(Fig. 2).
- 槐花 추출물은 세포독성이 거의 나타나지 않았으며 농도 의존적으로 NO 생산을 억제하였고, TNF-a의 생성을 단백질 수준과 mRNA 수준에서 억제하였다. 槐花 추출물은 ERK 1/2, JNK, p38의 인산화를 억제하였으나, Ik-Ba의 분해를 억제하지 못했다.
- 槐花가 RAW 264.7 cell에서 전염증성세포활성물질을 단백질 수준에서 억제하였고(Fig. 3), mRNA수준에서도 전염증성 인자들을 억제함을 알아보기 위해 槐花를 전처리한 후 LPS로 자극하여 IL-1b, IL-6, TNF-a의 mRNA를 측정한 결과, TNF-a mRNA 발현은 현저히 억제하였으나, IL-b와 IL-6 mRNA 발현은 억제하지 못했다(Fig. 4).
- 7 cell에서 전염증성 인자들에 대한 영향을 조사하기위하여, 염증성 세포활성물질의 생성을 조사하였다. 槐花를 전처리한 후 LPS로 자극하여 ELISA 방법으로 IL-1b, IL-6, TNF-a를 측정한 결과 槐花 추출물이 IL-1b, IL-6의 생성은 억제하지 못하였으나, TNF-a를 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 약리실험에서 꽃의 루틴성분이 모세혈관의 투과성을 낮추고 염증을 없애며, 槐花 물 추출액은 혈압을 낮추고 피속 콜레스테롤을 낮추는 것으로 밝혀졌다. 장출혈, 치루, 자궁출혈, 토혈, 코피, 혈리 등의 모세혈관 장애로 인한 여러 가지 출혈과 간열로 눈이 붉어진데, 부스럼에 쓴다.
- 이와 같은 결과로 보아 槐花 물 추출물은 MAPKs의 인산화를 억제하여서, NO와 TNF-a의 생산을 억제하였다.
후속연구
- 槐花의 이와 같은 작용은 천식, 류마티스 관절염 같은 자가 면역 질환과 소화 질환 염증, 예를 들어 췌장염, 지방간, 대장염 등과 염증에 효과적일 것이라고 생각되어진다. 위와 같은 槐花의 효능을 이용하여, 추가적인 마우스나 랫트에서 in vivo 실험이 이루어져야 할 것이다.
- 이러한 감소는 槐花가 LPS에 관련된 패혈증 및 TNF와 관련된 염증 반응에 사용할 수 있다는 것을 보여준다. 추후에는 쇼크 억제 실험과 그에 따른 싸이토카인의 변화를 측정하는 것이 더 이루어져야 할 것 같다.
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