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문제 정의
- 본 연구실에서 rosmarinic acid에 대한 선행 연구로서 사람 대장암 세포주인 HCT116에 대한 항암활성을 규명한 바 있다. Rosmarinic acid가 다양한 생물학적 활성이 보고되고 있었기 때문에 사람 동맥 평활근 세포인 HASMC에 대한 항동맥경화 활성을 조사하게 되었다.
- 본 연구에서는 rosmarinic acid의 활성을 조사하기 위하여 HASMC 세포의 증식과 apoptosis, cell cycle arrest에 관여하는지 조사하였다. 또한 세포의 migration을 억제할 수 있는지 알아보았고 그에 관여하는 효소인 MMPs의 활성을 측정하였다.
- 또한 세포의 migration을 억제할 수 있는지 알아보았고 그에 관여하는 효소인 MMPs의 활성을 측정하였다. 그 결과, rosmarinic acid가 항동맥경화 활성제로의 가능성이 있는 것으로 보여 보고하는 바이다.
- Rosmarinic acid가 HASMC 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 알아보았다. 세포에 0.
- Rosmarinic acid에 의해 apoptosis가 유도되는지 조사하였다. HASMC에 rosmarinic acid를 농도별로 처리하고 1시간 후 10 ng/ml의 TNF-α를 처리하여 24시간 후 세포를 수거하였다.
- 2). Rosmarinic acid에 의해 유도되는 apoptosis가 mitochondrial pathway에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, pro-apoptotic Bax는 rosmarinic acid 처리 시 점차 증가하였고 anti-apoptotic Bcl-2는 감소하는 것을 확인하였다.
- 따라서 본 실험에서는 TNF-α에 의해 유도되는 MMP-9, MMP-2가 rosmarinic acid에 의해 효과적으로 감소시키는 지 알아보았다.
- CDK-cyclin complex의 활성을 조절하는 cyclin-dependent kinase inhibitor (CKI)는 세포의 불필요한 증식을 억제하는 단백질로서 p21, p27, p57 등이 있고 이들을 조절하는 단백질로 p53이 존재한다 23). Rosmarinic acid가 HASMC의 cell cycle에 미치는 영향을 알아보았다. PI/RNase staining을 통한 FACS analysis를 수행하한 결과, TNF-α에 의해 G0/G1 phase의 세포의 비율이 감소하였고 S phase의 세포비율이 약 455.
- 다음으로, rosmarinic acid가 HASMC의 유주능에 미치는 영향을 알아보았다. 평활근세포의 유주는 세포간질 (interstitial tissue)이나 혈관 형성층 (내막, 중막, 외막)의 구성성분인 세포외기질이나 기저막이 MMPs에 의해 분해됨으로써 중막에 있던 평활근세포가 내막으로 이동하게 된다.
제안 방법
- 본 연구에서는 rosmarinic acid의 활성을 조사하기 위하여 HASMC 세포의 증식과 apoptosis, cell cycle arrest에 관여하는지 조사하였다. 또한 세포의 migration을 억제할 수 있는지 알아보았고 그에 관여하는 효소인 MMPs의 활성을 측정하였다. 그 결과, rosmarinic acid가 항동맥경화 활성제로의 가능성이 있는 것으로 보여 보고하는 바이다.
- 96 well plate에 1×104/well의 HASMC를 분주하고 약재를 농도별로 24 시간 동안 처리하였다. Well당 20 ㎕의 MTS solution을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다. 각 농도별 약재가 갖는 흡광도를 보정하기 위하여 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교 보정하여 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
- Well당 20 ㎕의 MTS solution을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다. 각 농도별 약재가 갖는 흡광도를 보정하기 위하여 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교 보정하여 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
- 1% Tween 20을 함유한 TBST 용액으로 40분간 세척한 다음, secondary antibody로 반응시켰다. 이어서 ECL system으로 반응 시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay kit를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
- 이어서 ECL system으로 반응 시킨 후 X-ray film상에서 단백질을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay kit를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
- HASMC의 유주능은 transwell chamber를 사용하여 측정하였다. 먼저 HASMC에 100 ng/ml의 TNF-α를 처리하여 24시간 배양한 후 배양액을 얻어 세포의 유주를 유도하는 conditioned medium을 준비한다.
- 여기에 각각의 약재를 1시간동안 전처리한 후 100 ng/ml의 TNF-α를 24시간 처리하였다.
- 여기에 각각의 약재를 1시간동안 전처리한 후 100 ng/ml의 TNF-α를 24시간 처리하였다. 각각의 세포 배양액을 수거하여 gelatin zymography를 수행하였다. 20 ㎕의 배양액을 reducing agent가 없는 SDS-sample buffer에 섞은 후 전기영동을 한 후, gel을 2.
- 5% Triton X-100에서 30분간 2회 soaking시킴으로써 SDS를 제거하고 3차 증류수로 20분간 2회 세척하였다. 세척된 gel은 incubation buffer (50 mM Tris-HCl ; pH 7.6, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.01% NaN3)에 넣어 37℃ incubator에서 24시간동안 반응시킨 후 0.1% coomassie brilliant blue 용액으로 30분간 염색하여 gelatin이 분해되는 정도를 관찰하였다.
- Cell cycle 분석을 하기 위해 PI/RNase staining을 하여 FACS analysis를 수행하였다. 1✕106 cells/ml의 세포에 rosmarinic acid와 TNF-α를 24시간 처리한 후 trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 수거하여 1% paraformaldehyde로 15분간 상온에서 고정시킨다.
- 1% Triton X-100을 처리하여 permeability를 갖게 한 후 500 ㎕ PI/RNase를 첨가하여 상온에서 30분 동안 incubation하였다. Becton Dickinson FACS calibur flow cytometer 와 CELL-Quest Pro (BD Biosciences)를 사용하여 cell cycle을 분석하였다.
- 00을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였다. Western blot과 gelatin zymography를 수행하여 얻은 band의 density 분석은 GelDoc-It BioImaging System (UVP, USA)을 사용하여 측정하였다.
- Rosmarinic acid가 HASMC의 cell cycle에 미치는 영향을 알아보기 위하여 PI/RNase staining을 하여 FACS analysis를 수행하였다. 그 결과, TNF-α에 의해 G0/G1 phase의 세포의 비율이 감소하였고 S phase의 세포비율이 약 455.
- Western blot을 수행하여 cell cycle에 관여하는 단백질들의 발현양상을 조사하였다. p53은 tumor suppressor gene으로서 자극에 의해 DNA가 손상되었을 때 활성화되어 cell cycle arrest와 apoptosis의 두 가지 pathway에 관여하게 된다.
- Rosmarinic acid가 세포의 유주능에 미치는 영향을 알아보기 위하여 transwell을 이용한 migtation assay를 수행하였다. HASMC에 100 ng/ml의 TNF-α를 24시간 처리하여 얻은 conditioned medium을 transwell의 lower chamber에 넣고, rosmarinic acid를 1시간 동안 전처리한 후 10 ng/ml의 TNF-α를 24시간 처리한 HASMC를 upper chamber에 loading하였다.
- Rosmarinic acid를 1시간 전처리하고 10 ng/ml의 TNF-α를 처리하여 24시간 후 세포 배양액을 얻어 gelatin zymography assay를 수행하였다.
- HASMC에 100 ng/ml의 TNF-α를 24시간 처리하여 얻은 conditioned medium을 transwell의 lower chamber에 넣고, rosmarinic acid를 1시간 동안 전처리한 후 10 ng/ml의 TNF-α를 24시간 처리한 HASMC를 upper chamber에 loading하였다. 24시간동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 upper chamber에서 lower chamber로 유주한 세포를 관찰하기 위하여 upper chamber의 matrigel filter를 H-E 염색을 하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, TNF-α 처리에 의해 세포의 유주가약 17.
- MMPs는 혈관을 형성하는 내막, 중막, 외막의 구성성분인 세포외 기질이나 기저막을 분해시킴으로써 평활근세포의 유주에 영향을 주는데, 이러한 MMP-9과 MMP-2의 활성을 조사하기 위해 gelatin zymography assay를 수행하였고, 생성량에 대한 영향을 조사하기 위해 MMP-9, MMP-2 ELISA를 수행하였다.
- 또한 최근에는 사람 상피세포에서 NF-κB 활성을 저해함으로써 TNF-α에 의해 유도되는 CCL1과 CCR3를 억제한다는 보고도 있다 18). Rosmarinic acid가 동맥경화 질환의 예방 및 치료에도 활성을 가지는 지 알아보기 위하여 사람동맥평활근세포인 HASMC에 처리하여 분자, 세포생물학적 실험을 수행하였다.
- 먼저, HASMC에 대한 rosmarinic acid의 독성 및 증식에 미치는 영향을 조사하였다. TNF-α에 의해서 약 1.
대상 데이터
- Recombinant human TNF-α는 R&D Systems (MN, USA)에서 구입하였고, rosmarinic acid는 Sigma (CA, USA)에서 구입하였다.
- 1차 항체 중 β-actin, cleaved Poly ADP-ribose polymerase (PARP), cleaved caspase-3, -8, Bcl-xL, Bax는 Cell Signaling Technology (MA, USA)에서 구입하였고 cytochrome c와 Bcl-2는 BD PharMingen (CA, USA)에서 구입하였다.
- 5-bromo, 2'deoxyuridine (BrdU) kit는 Promega사 (WI, USA)에서 구입하였다.
- 세포 배양액인 Smooth Muscle Cell Medium (SMCM), SMC growth supplement는 ScienCell사 (Sandiego, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bis는 Bio-Rad사 (CA, USA)에서 구입하였고, traswell은 Corning사 (CA, USA)에서 구입하였다.
- 세포 배양액인 Smooth Muscle Cell Medium (SMCM), SMC growth supplement는 ScienCell사 (Sandiego, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bis는 Bio-Rad사 (CA, USA)에서 구입하였고, traswell은 Corning사 (CA, USA)에서 구입하였다. Recombinant human TNF-α는 R&D Systems (MN, USA)에서 구입하였고, rosmarinic acid는 Sigma (CA, USA)에서 구입하였다.
- 1차 항체 중 β-actin, cleaved Poly ADP-ribose polymerase (PARP), cleaved caspase-3, -8, Bcl-xL, Bax는 Cell Signaling Technology (MA, USA)에서 구입하였고 cytochrome c와 Bcl-2는 BD PharMingen (CA, USA)에서 구입하였다. 2차 항체인 Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP)와 anti-mouse IgG HRP는 Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)에서 구입하였다. MMP-9의 발현량 측정을 위한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit는 R&D Systems (MN, USA) 에서 구입하였고, Protein assay reagent는 Bio-Rad사 (CA, USA)에서 구입하였다.
- 사람의 동맥 평활근 세포주인 Human Aortic Smooth Muscle Cells (HASMC)은 ScienCell사 (CA, USA)에서 분양받아 SMCM에서 배양하였다. 각각의 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
데이터처리
- 실험결과는 means±SEM으로 표시하고 유의성 검증은 Prism 4.00을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였다.
이론/모형
- 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 BrdU-(5'Bromo-2-deoxyuridine) ELISA assay 12)를 수행하였다.
- 약재 추출물의 세포에 대한 독성 측정은 5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt (MTS) assay 방법 11)으로 분석하였다. 이는 mitochondrial dehydrogenases에 의하여 MTS가 formazan으로 전환되는 것을 측정하는 것이다.
- HASMC were treated with rosmarinic acid for 1 hr before treatment with or without 10 ng/ml TNF-α for 24 hr. HASMC proliferation was assayed by BrdU ELISA assay. Cell viability was measured by MTS assay as described in Materials and Methods.
- HASMC에 rosmarinic acid를 농도별로 처리하고 1시간 후 10 ng/ml의 TNF-α를 처리하여 24시간 후 세포를 수거하였다. Apoptosis의 지표가 되는 poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)의 cleavage되는 정도를 확인하기 위하여 western blot을 수행하였다. 그 결과, rosmarinic acid의 농도가 증가할수록 cleaved PARP의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- Transwell을 이용한 migration assay를 수행하였다. TNF-α처리에 의해 세포의 유주가 증가하였고, 이는 rosmarinic acid 전 처리에 의해 크게 감소되었다.
성능/효과
- TNF-α에 의해서 약 1.5배 세포생존율이 증가하였고 rosmarinic acid에 의해 control 수준 이하까지 감소되는 것으로 나타났다.
- 또한 BrdU assay를 통해 세포의 증식에 미치는 영향을 알아본 결과에서도 TNF-α에 의해 증가되었던 증식율이 rosmarinic acid의 농도에 의존적으로 감소되는 것을 볼 수 있었다(Fig. 1B).
- 세포에 0.1, 1, 10 μM의 rosmarinic acid를 1시간 전처리한 후 10 ng/ml TNF-α를 24시간 처리한 후 MTS assay를 수행하여 세포생존율을 측정한 결과 Fig. 1A에서 보듯이 TNF-α에 의해서 약 1.5배 세포생존율이 증가하였고 rosmarinic acid에 의해 control 수준이하까지 감소되는 것으로 나타났다.
- Apoptosis의 지표가 되는 poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)의 cleavage되는 정도를 확인하기 위하여 western blot을 수행하였다. 그 결과, rosmarinic acid의 농도가 증가할수록 cleaved PARP의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 PARP의 upstream signal인 caspase-3가 rosmarinic acid에 의해 활성화되는 것으로 나타났다(Fig.
- Rosmarinic acid에 의해 유도되는 apoptosis가 mitochondrial pathway에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, pro-apoptotic Bax는 rosmarinic acid 처리 시 점차 증가하였고 anti-apoptotic Bcl-2는 감소하는 것을 확인하였다.
- 그 결과, TNF-α에 의해 G0/G1 phase의 세포의 비율이 감소하였고 S phase의 세포비율이 약 455.3% 증가하였다.
- 또한 TNF-α 에 의해 증가되었던 cyclin D, cyclin E, CDK2, CDK4, CDK6의 발현은 rosmarinic acid에 의해 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과, TNF-α 처리에 의해 세포의 유주가약 17.3배 증가하였고, TNF-α에 의해 증가된 세포의 유주가 rosmarinic acid 전처리에 의해 약 76.6%, 96.3% 감소되었다(Fig. 5).
- MMP-9은 TNF-α에 의해 약 1.7배 증가하였고, 이는 rosmarinic acid 1, 10 μM 처리에 의해 각각 23.5%, 76.5%활성이 감소되었다(Fig 6A).
- 그 결과, TNF-α에 의해 증가 되는 MMP-9과 MMP-2의 활성이 rosmarinic acid에 의해 효과적으로 저해되었다.
- 또한 TNF-α에 의해 증가되었던 증식율이 rosmarinic acid의 농도에 의존적으로 감소되는 것을 볼 수 있 었다.
- Cell cycle 조절에 관여하는 단백질인 p53과 p21, p27의 발현이 rosmarinic acid에 의해 증가하였고, TNF-α에 의해 증가되는 cyclin D, cyclin E, CDK2, CDK4, CDK6의 발현이 효과적으로 감소하였다.
- PI/RNase staining을 통한 FACS analysis를 수행하한 결과, TNF-α에 의해 G0/G1 phase의 세포의 비율이 감소하였고 S phase의 세포비율이 약 455.3% 증가하였다.
- Rosmarinic acid에 의해 apoptosis가 유도되는지 조사하였다. Rosmarinic acid의 농도가 증가할수록 cleaved PARP의 발현이 증가하였고 caspase-3가 활성화되는 것으로 나타났다. 또한 pro-apoptotic Bax는 rosmarinic acid 처리 시 점차 증가하였고 anti-apoptotic Bcl-2는 감소하는 것을 확인하였다.
- Rosmarinic acid의 농도가 증가할수록 cleaved PARP의 발현이 증가하였고 caspase-3가 활성화되는 것으로 나타났다. 또한 pro-apoptotic Bax는 rosmarinic acid 처리 시 점차 증가하였고 anti-apoptotic Bcl-2는 감소하는 것을 확인하였다. 이로써 rosmarinic acid에 의해 mitochondrial pathway을 통한 apoptosis가 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 pro-apoptotic Bax는 rosmarinic acid 처리 시 점차 증가하였고 anti-apoptotic Bcl-2는 감소하는 것을 확인하였다. 이로써 rosmarinic acid에 의해 mitochondrial pathway을 통한 apoptosis가 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
- Cell cycle 조절에 관여하는 단백질인 p53과 p21, p27의 발현이 rosmarinic acid에 의해 증가하였고, TNF-α에 의해 증가되는 cyclin D, cyclin E, CDK2, CDK4, CDK6의 발현이 효과적으로 감소하였다. 이들의 결과로 보아, rosmarinic acid에 의해 G1 phase에서 arrest됨으로써 세포의 증식에 영향을 줄 수 있을 것으로 보인다.
- MMP의 억제제로 알려져 있는 catechin의 유도체인 EGCG나 EGC와 비교해 보았을 경우 EGC 보다 탁월한 유주능 저해 효과를 나타내었다. Rosmarinic acid는 MMP-9과 MMP-2의 활성 및 생성량 저해에도 효과적인 것으로 나타났다.
- 이러한 결과로 보아 rosmarinic acid는 HASMC의 세포의 생존 및 증식을 억제하며, mitochondrial pathway을 통한 apoptosis를 유도하고 cell cycle arrest에 관여하는 것으로 보인다. 또한 MMP-9과 MMP-2의 활성 및 생성을 조절함으로써 세포의 유주를 억제할 수 있는 것으로 보인다.
- 이러한 결과로 보아 rosmarinic acid는 HASMC의 세포의 생존 및 증식을 억제하며, mitochondrial pathway을 통한 apoptosis를 유도하고 cell cycle arrest에 관여하는 것으로 보인다. 또한 MMP-9과 MMP-2의 활성 및 생성을 조절함으로써 세포의 유주를 억제할 수 있는 것으로 보인다. 따라서 rosmarinic acid는 동맥경화 치료제 및 예방물질로서 가능성을 제시할 수 있고, 이에 관여하는 메카니즘 연구 및 in vivo 실험 등 rosmarinic acid에 관한 심도 있는 연구가 수행되어야 할 것이다.
후속연구
- 또한 MMP-9과 MMP-2의 활성 및 생성을 조절함으로써 세포의 유주를 억제할 수 있는 것으로 보인다. 따라서 rosmarinic acid는 동맥경화 치료제 및 예방물질로서 가능성을 제시할 수 있고, 이에 관여하는 메카니즘 연구 및 in vivo 실험 등 rosmarinic acid에 관한 심도 있는 연구가 수행되어야 할 것이다.
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