Activity-guided fractionation of the EtOH extract of flowers of Bidens bipinnata L. have been furnished five flavonoids, sulfuretin(1), butein(2), 7,8,3',4'-tetrahydroxyflavanone(3), maritimetin(4) and okanin(5). All of the compounds showed significant activities on both linoleic acid peroxidation i...
Activity-guided fractionation of the EtOH extract of flowers of Bidens bipinnata L. have been furnished five flavonoids, sulfuretin(1), butein(2), 7,8,3',4'-tetrahydroxyflavanone(3), maritimetin(4) and okanin(5). All of the compounds showed significant activities on both linoleic acid peroxidation inhibition and DPPH radical scavenging effect. The evaluation for protective effect of isolated compounds against tacrine-induced cytotoxicity in human liver-derived Hep G2 cells was conducted. Compounds 1, 3, 4 and 5 showed significant protective effects with the $EC_{50}$ values of $36.1{\pm}0.9$, $23.3{\pm}0.7$, $41.0{\pm}1.0$ and $29.8{\pm}1.1{\mu}M$, respectively. Silybin, one of the well-known hepatoprotective agents, used as a positive control, and also showed protective effect with an $EC_{50}$ value of $84.3{\pm}0.7{\mu}M$.
Activity-guided fractionation of the EtOH extract of flowers of Bidens bipinnata L. have been furnished five flavonoids, sulfuretin(1), butein(2), 7,8,3',4'-tetrahydroxyflavanone(3), maritimetin(4) and okanin(5). All of the compounds showed significant activities on both linoleic acid peroxidation inhibition and DPPH radical scavenging effect. The evaluation for protective effect of isolated compounds against tacrine-induced cytotoxicity in human liver-derived Hep G2 cells was conducted. Compounds 1, 3, 4 and 5 showed significant protective effects with the $EC_{50}$ values of $36.1{\pm}0.9$, $23.3{\pm}0.7$, $41.0{\pm}1.0$ and $29.8{\pm}1.1{\mu}M$, respectively. Silybin, one of the well-known hepatoprotective agents, used as a positive control, and also showed protective effect with an $EC_{50}$ value of $84.3{\pm}0.7{\mu}M$.
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문제 정의
본 연구는 도깨비바늘 꽃의 EtOH 추출물 중 지질과산화 억제활성과 DPPH에 의한 radical 소거능이 우수한 EtOAc 가용부에 대하여 함유성분의 분리를 수행하였고, 이에 얻어진 5종의 화합물에 대한 항산화 및 간세포 보호활성을 검토하였다.
제안 방법
EtOAc 가용부 5.6 g중 2.0 g를 CHCl3:MeOH:H2O (8:1:0.1→8:2:0.2→7:3:0.3)→MeOH을 용출 용매로 하여 silica gel column chromatography에 의하여 7개의 소분획 (Fr. 1~7)으로 나누었다.
EtOAc 가용부로부터 분리한 5종의 화합물은 문헌에 기재 되어 있는 1 H-NMR, 13C-NMR의 data와 비교하여 각각 Sulfuretin,15) butein,16) 7,8,3',4'-tetrahydroxyflavanone,17)maritimetin,18) okanin19)으로 동정하였다(Fig. 1).
D 10mm을 사용하였다. NMR spectrum 은 JEOL JNM-ECP 500 (1 H, 500 MHz; 13C, 125 MHz)을, ESI-MS는 API-2000 spectrometer를 사용하여 측정하였다. linoleic acid, ammonium thiocyanate, butylated hydroxyanisole(BHA), butylated hydroxytoluene(BHT), α-tocopherol, 1,1-diphenylpicryl-2-hydrazyl(DPPH), 3'-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) tacrine, silybin 은 Sigma사에서 구입하였다.
각 시료 용액 100 µl를 시험관에 첨가한 후 EtOH 4.0을 넣고 2×10-4M DPPH용액 1.0 ml을 가한 후 vortex mixer로 교반하였고, 실온에서 30분간 반응시키고 517nm에서 흡광도를 측정하여 분획물의 DPPH radical 소거능(%)을 측정하였고, 화합물의 활성은 IC50 값으로 나타내었다.
간략하게 설명하면, Hep G2 세포 (1×104 cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G(100 µg/ ml)와 streptomycin(100µg/ml)을 함유한 RPMI 1640배지에 분주하고 5% CO2 배양기 내에서 37℃에서 24시간 배양한 다음, 분리된 화합물의 시료 용액 (10, 20, 40, 80 µM)과 200 µM tacrine을 처리한 후 24시간 동안 5% CO2 배양기 내에서 배양하였으며, 세포생존율은 MTT법을 활용하여 측정하였으며, positive control은 silybin을 사용하였다.
1 ml)와 혼합하여 3분이 지난 후에 500 nm 에서 흡광도를 측정하여 산화양상을 관찰하였다. 결과는 5일째의 흡광도를 기준으로 하여 분획물의 지질과산화 억제 활성(%)을 측정하였고, 화합물의 활성은 IC50 값으로 나타 내었다. 대조구는 시료대신 EtOH를 첨가하였으며, positive control은 BHA, BHT, a-tocopherol을 사용하여 활성을 비교 하였고, 각 실험은 3회 반복하여 실시하였다.
대조 구는 시료 대신에 EtOH을 첨가하여 실험하였으며, positive control은 BHA, BHT, α-tocopherol을 사용하여 활성을 비교하였고, 각 실험은 3회 반복하여 실시하였다.
결과는 5일째의 흡광도를 기준으로 하여 분획물의 지질과산화 억제 활성(%)을 측정하였고, 화합물의 활성은 IC50 값으로 나타 내었다. 대조구는 시료대신 EtOH를 첨가하였으며, positive control은 BHA, BHT, a-tocopherol을 사용하여 활성을 비교 하였고, 각 실험은 3회 반복하여 실시하였다.
따라서 유의한 활성을 나타낸 EtOAc 가용부를 대상으로 그에 함유된 화합물을 분리·정제하고 그 구조를 구명하였다.
또한, 모든 실험치는 대조군에 대한 세포보호율을 mean±S.D.로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.
본 연구는 천연 항산화 또는 간보호 활성 물질을 찾기 위해 도깨비바늘 꽃의 EtOH 추출물로부터 5종의 화합물을 분리하였으며, 각각의 화합물을 sulphuretin(1), butein(2), 7,8,3',4'-tetrahydroxyflavanone(3), maritimetin(4), okanin(5) 로 동정하였다.
1 ml)을 첨가하여 40℃의 암소에 방치하였다. 이 반응 액을 매 24시간마다 0.1 ml을 취해 75% EtOH(9.7 ml), 30% ammonium thiocyanate(0.1 ml), 3.5% HCl에 녹인 0.02 M ferrous chloride(0.1 ml)와 혼합하여 3분이 지난 후에 500 nm 에서 흡광도를 측정하여 산화양상을 관찰하였다. 결과는 5일째의 흡광도를 기준으로 하여 분획물의 지질과산화 억제 활성(%)을 측정하였고, 화합물의 활성은 IC50 값으로 나타 내었다.
대상 데이터
기타 시약은 Junsei 사의 특급 제품을 사용하였다. 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다.
Hep G2 세포배양 및 간세포 보호활성 측정 − 사람 간 암 세포 유래 Hep G2 세포주는 American Type Culture Collection에서 분양하여 사용하였으며, 타크린으로 독성을 유발한 세포주에 대한 보호활성 측정은 송 등의 방법14)에 따라 실시하였다.
linoleic acid, ammonium thiocyanate, butylated hydroxyanisole(BHA), butylated hydroxytoluene(BHT), α-tocopherol, 1,1-diphenylpicryl-2-hydrazyl(DPPH), 3'-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) tacrine, silybin 은 Sigma사에서 구입하였다. RPMI 1640 배지와 trypsinethylene diaminetetraacetic acid (EDTA)는 Gibco Laboratories 사에서 구입하였으며, fetal bovine serum (FBS)는 Hyclone Laboratories사에서 구입하였다. 기타 시약은 Junsei 사의 특급 제품을 사용하였다.
시약 및 기기 − Column chromatography용 담체는 silica gel 60(0.063~0.200mm, Merck), HPLC는 BECKMAN, SYSTEM GOLD(128 Solvent Module, 168 Detector)를 사용하였고, HPLC용 column은 Alltech apollo C18 5 µ, Length 250 mm, I.D 10mm을 사용하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용한 도깨비바늘 꽃은 2008년 9월 익산시 원광대학교 자연식물원에서 채집하여 동정한 것으로 시료의 일부는 원광대학교 자원식물학연구실(No. TO140)에 보관하고 있다.
이론/모형
DPPH radical 소거능 측정 − 항산화 활성을 조사하기 위하여 자유라디칼인 DPPH를 사용한 항산화활성 측정법13)을 이용하였다.
지질과산화 억제활성 측정 − linoleic acid의 지질과산화에 대한 억제활성 검정은 Inatani 등12)의 방법에 따라 실시하였다.
성능/효과
DPPH radical 소거능의 활성은 화합물 2, 3, 5가 각각 IC50 값 19.6±0.4, 15.6±0.5, 19.3±0.4 µM로 αtocopherol 47.1±0.5 µM 보다 우수하였으며, 화합물 1, 4은 59.3±1.0 µM, 60.1±0.9 µM로 α-tocopherol 보다는 낮았지만 BHA 79.8±0.9 µM, BHT 193.1±1.0 µM에 비하여 우수하였다.
DPPH에 의한 radical 소거능 실험 결과는 EtOAc 가용부가 79.4%로 α-tocopherol 78.2%, BHA 75.5%, BHT 70.5% 보다 높은 활성을 나타내었고, n-hexane 25.1%, nBuOH 59.1%, H2O 28.1%를 보였다.
EtOAc 가용부가 89.7%를 나타내어 합성 항산화제인 BHA 93.7%, BHT 93.4% 보다는 낮았지만 천연 항산화제인 α-tocopherol 89.4% 비슷한 지질과산화 억제활성을 나타내어 가장 우수하였으며, n-hexane 2.0%, n-BuOH 5.7%, H2O 1.4%를 보였다.
각 항산화활성에 대한 IC50 값을 측정한 결과 지질과산화 억제 활성은 BHA, BHT, α-tocopherol의 IC50 값 32.4±0.7~ 59.4±0.8 µM에 대하여 화합물 5의 IC50 값이 7.7±0.3µM로 가장 낮았으며, 화합물 1~4의 IC50 값은 각각 10.1±0.2, 10.3±0.3, 11.3±0.7, 27.9±1.0 µM를 나타내었다.
분리한 5종의 화합물의 간보호 활성을 보면 화합물 1, 3, 4, 5이 타크린으로 유발한 Hep G2 세포주에 대하여 유의한 간 세포보호 활성을 나타내었으며, 각각 36.1±0.9, 23.3±0.7, 41.0±1.0, 29.8±1.1 µM의 EC50 값을 나타냈다.
분리한 화합물의 지질과산화 억제활성은 화합물 1~5의 IC50 값이 각각 10.1±0.2, 10.3±0.3, 11.3±0.7, 27.9±1.0, 7.7±0.3µM로 BHA 39.4±0.4µM, BHT 32.4±0.7 µM, α-tocopherol 59.4±0.8 µM 보다 우수하게 나타났다.
후속연구
20) 따라서 본 연구에서 간 세포보호 활성이 인정된 4종 화합물에 대한 추가적인 기전연구가 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
합성항산화제인 BHA, BHT의 문제점은 무엇인가?
기존의 항산화제로 BHA(butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxytoluene) 등과 같은 합성 항산화제와 tocopherol류, carotenoid, flavonoid, tannin 등과 같은 천연 항산화제가 개발되어 이용되고 있으나, 합성항산화제인 BHA, BHT는 그 효과와 경제성 그리고 안정성 때문에 많이 사용해 왔지만 다량을 섭취하면 간, 신장, 순환계 등에 심각한 독성작용을 일으키는 것으로 알려져 안전한 대체 항산화제의 개발이 요구 되고 있다. 3,4)
기존의 항산화제로 어떤 것들이 사용되고 있는가?
기존의 항산화제로 BHA(butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxytoluene) 등과 같은 합성 항산화제와 tocopherol류, carotenoid, flavonoid, tannin 등과 같은 천연 항산화제가 개발되어 이용되고 있으나, 합성항산화제인 BHA, BHT는 그 효과와 경제성 그리고 안정성 때문에 많이 사용해 왔지만 다량을 섭취하면 간, 신장, 순환계 등에 심각한 독성작용을 일으키는 것으로 알려져 안전한 대체 항산화제의 개발이 요구 되고 있다. 3,4)
아세틸콜린에스테라제 저해제인 타크린을 복용하는 환자는 어떤 문제점이 일어날 수 있는가?
타크린(tacrine; 1,2,3,4-tetrahydro-9-aminoacridinehydrochloride) 은 아세틸콜린에스테라제 저해제로서 알츠하이머 증후군의 치료약의 하나로 사용되고 있다. 그러나, 이 약물을 복용하 는 환자의 30~50%에 있어서 가역성 간 손상이 유발되기 때문에 투약의 제한을 비롯한 신중한 투여가요구되고 있다. 6) 따라서, 천연물로부터 타크린의 간 독성을 감소시킬 수 있는 화합물을 발견하는 것은 중요하다고 생각된다.
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