비정상적인 미토콘드리아에 의해 산화 스트레스가 증가하면 세포내 신호전달 및 유전자 발현에 손상을 일으켜 인슐린 저항성이나 당뇨병 등의 여러 질환들을 유발한다. 그런데 자식작용은 산화 스트레스로 기능이 저하된 미토콘드리아를 제거하여 인슐린 저항성 등을 억제해준다. 한편 운동도 미토콘드리아 생합성을 강화시켜 조직의 기능저하나 퇴행을 회복시켜준다. 따라서 운동과 자식작용이 서로 연관되어 미토콘드리아 생합성을 유도하는 신호체계로 작용할 가능성이 있고, 이 연구를 통해 운동 혹은 AICAR (aminoimidazole-4-carboxamide-1-${\beta}$-D-ribofuranoside)처치로 활성 화된 AMPK(5'-AMP- activated protein kinase) 신호전달체계가 미토콘드리아 생합성을 증가시키는 경로에 자식작용이 관여하는지의 여부를 확인하고자 하였다. 연구결과에 따르면, 6시간의 급성운동으로 쥐의 골격근에서 PGC-1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1)과 mtTFA (mitochondrial transcription factor A)의 mRNA 발현이 유의하게 증가하였다. 하지만 자식작용 표지제인 LC3(microtubule-associated proteinl light chain 3)의 mRNA 발현은 증가경향을 나타냈지만 유의하지 않았다. 한편 C2C12 근세포에서도 AICAR 처치에 의해 PGC-1, mtTFA mRNA 발현이 모두 증가하였지만, 이러한 증가는 LC3 SiRNA에 의해서 억제되지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과들을 통해 자식작용은 AMPK에 의해 조절되는 신호전달 전달체계와는 다른 경로로 미토콘드리아 생합성에 영향을 미칠 것으로 사료된다.
비정상적인 미토콘드리아에 의해 산화 스트레스가 증가하면 세포내 신호전달 및 유전자 발현에 손상을 일으켜 인슐린 저항성이나 당뇨병 등의 여러 질환들을 유발한다. 그런데 자식작용은 산화 스트레스로 기능이 저하된 미토콘드리아를 제거하여 인슐린 저항성 등을 억제해준다. 한편 운동도 미토콘드리아 생합성을 강화시켜 조직의 기능저하나 퇴행을 회복시켜준다. 따라서 운동과 자식작용이 서로 연관되어 미토콘드리아 생합성을 유도하는 신호체계로 작용할 가능성이 있고, 이 연구를 통해 운동 혹은 AICAR (aminoimidazole-4-carboxamide-1-${\beta}$-D-ribofuranoside)처치로 활성 화된 AMPK(5'-AMP- activated protein kinase) 신호전달체계가 미토콘드리아 생합성을 증가시키는 경로에 자식작용이 관여하는지의 여부를 확인하고자 하였다. 연구결과에 따르면, 6시간의 급성운동으로 쥐의 골격근에서 PGC-1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1)과 mtTFA (mitochondrial transcription factor A)의 mRNA 발현이 유의하게 증가하였다. 하지만 자식작용 표지제인 LC3(microtubule-associated proteinl light chain 3)의 mRNA 발현은 증가경향을 나타냈지만 유의하지 않았다. 한편 C2C12 근세포에서도 AICAR 처치에 의해 PGC-1, mtTFA mRNA 발현이 모두 증가하였지만, 이러한 증가는 LC3 SiRNA에 의해서 억제되지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과들을 통해 자식작용은 AMPK에 의해 조절되는 신호전달 전달체계와는 다른 경로로 미토콘드리아 생합성에 영향을 미칠 것으로 사료된다.
Increased oxidative stress by abnormal mitochondrial function can damage cell signal transduction and gene expression, and induce insulin resistance or diabetes. Autophagy, however, improve insulin resistance by clearance of malfunctioning mitochondria. Exercise also recovers the muscle dysfunction ...
Increased oxidative stress by abnormal mitochondrial function can damage cell signal transduction and gene expression, and induce insulin resistance or diabetes. Autophagy, however, improve insulin resistance by clearance of malfunctioning mitochondria. Exercise also recovers the muscle dysfunction and degeneration by activating mitochondrial biogenesis. As it seems that exercise and autophagy might act as an orchestrated network to induce mitochondrial biogenesis, we investigated whether autophagy is involved in AMPK signal pathway stimulated by exercise or AICAR to increase mitochondrial biogenesis. And it showed that PGC-1 and mtTFA, but not autophagy marker LC3 mRNA expression were significantly increased by 6 hr of acute exercise. On the other hand, PGC-1 and mtTFA mRNA expression were upregulated by AICAR treatment to C2C12 myotube. However these genes were not inhibited by LC3 siRNA transfection. These results provide the evidence that autopahgy affects on mitochondrial biogenesis through different signal pathway from AMPK signal transduction.
Increased oxidative stress by abnormal mitochondrial function can damage cell signal transduction and gene expression, and induce insulin resistance or diabetes. Autophagy, however, improve insulin resistance by clearance of malfunctioning mitochondria. Exercise also recovers the muscle dysfunction and degeneration by activating mitochondrial biogenesis. As it seems that exercise and autophagy might act as an orchestrated network to induce mitochondrial biogenesis, we investigated whether autophagy is involved in AMPK signal pathway stimulated by exercise or AICAR to increase mitochondrial biogenesis. And it showed that PGC-1 and mtTFA, but not autophagy marker LC3 mRNA expression were significantly increased by 6 hr of acute exercise. On the other hand, PGC-1 and mtTFA mRNA expression were upregulated by AICAR treatment to C2C12 myotube. However these genes were not inhibited by LC3 siRNA transfection. These results provide the evidence that autopahgy affects on mitochondrial biogenesis through different signal pathway from AMPK signal transduction.
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문제 정의
(2) AICAR(AMPK 길항제) 처치가 PGC-1의 신호전달을 통해 미토콘드리아 생합성을 향상시킬 때, 자식작용이 그 중간의 매개신호로서 작용하는지의 여부를 알아보고자 한다.
따라서 이 연구에서는 운동으로 유도되는 미토콘드리아 생합성의 신호전달체계에 있어 AMPK가 자식작용과 관련이 있는지의 여부를 가설로 설정하여 증명함 , 으로써, 궁극적으로 운동이 대사기능면에서 긍정적 효과를 미치는 신호전달경로의 일부를 규명할 수 있을 것으로 판단된다. 보다 세부적으로,
이때 이런 처치요법들이 운동 중에 인체에서 활성화되는 물질들과 관련 있는지 혹은 무관하게 작용하는지를 확인하는 것은 필수적이다. 이번 연구에서는 운동 혹은 AICAR에 의해 증가된 AMPK의 활성이 미토콘드리아 생합성을 상승조절하여 대사기능을 향상시키는 일련의 신호전달체계에서, 자식작용이 그 중간 매개 물질로서의 역할을 하는지 여부를 확인하고자 하였다.
이번 연구에서도 선행연구들을 바탕으로 미토콘드리아 생합성을 유도하는 자식작용이 AMPK에 의해 조절되는 미토콘드리아 생합성과도 관련되어 작용할 가능성을 예상하고, 일련의 신호전달물질들의 활성 강화와 억제 처치를 통해 그 신호전달경로를 규명하고자 하였다. 그리고 연구결과들을 종합해보면, 자식작용은 AMPK, PGC-1 그리고 미토콘드리아 생합성에 이르는 신호전달경로에서 중간신호물질로 작용하지는 않으며 , 다른 별도의 신호전달 전달체계를 통해 PGC-1과 미토콘드리아 생합성의 활성에 영향을 미칠 것으로 사료된다.
제안 방법
분석했다. 10) 결과를 목표유전자/18s rRNA 비율로 정량 분석했다.
5) 합성된 cDNA를 아래의 LC3, PGC-1, mtTFA, 18s primer(Bioneer, 한국)를 이용하여 Realtime PCR( ABI Prism SDS 7000, 미국)을 실시하여 각 유전자들의 발현을 측정했다.
7) real-time PCR 반응혼합물(SYBR Green master mix, 영국) 25 ul룰 optical tube에 넣고 다음 조건의 PCR을 실시했다.
8) PCR 이 끝난 후 optical tube를 제거하여 3% agarose gel 에서 5 ul 씩 사용하여 PCR specificity 를 검사했다.
8주령의 SD 계 흰쥐 16마리를 대상으로 36±2℃ 항온수조에서 부하 없이 단기간의 급성운동(3hr 수영, 45min 휴식, 3hr 수영)을 실시한 직후, pentobarbital sodium로 마취하고 가자미근(soleus muscle)을 분리 했다.
AMPK, 자식작용 그리고 미토콘드리아 생합성의 관련 기전을 확립하기 위해 AMPK를 활성화시키는 AICAR를 근세포(C2C12 myotube)에 처치하였고, 이 때 LC3 siRNA를 같이 처치하여, LC3가 AMPK와 미토콘드리아의 생합성의 기전에 중간 매개체 역할을 하는지를 확인하였다.
알아보고, ii) 생체에는 적용하기 힘든 AICAR 이용하여 신호체계의 활성 강화/억제 개입 (interference)0] 가능한 시험관 내(vitro) 실험을 실시하여, 그 결과들을 통해 교차 검증을 하고자 한다.
myotube의 생성을 현미경으로 확인했다.
5 mM AICAR을 4시간 동안 처치하고 2시간동안 회복시킨 후 scrapper를 이용하여 cell을 수집했다. 같은 방법으로 seeding 후 12일 정도 후에 C2C12에 LC3 SiRNA를 transfection시 킨 후 0.5 mM AICAR를 4시간 동안 처치하고 2시간동안 회복시킨 후, scrapper를 이용하여 cell을 수집했다.
주줄했다. 분리한 RNA는 다음의 Reverse Transcription(Fermentus, 미국)을 통해 cDNA를 합성하고 realtime PCR를 실시했다. 이에 대한 세부절차로서,
한편, 이러한 현상을 설명해주는 기전을 제시하기 위한 실험으로서, C2C12 근세포에 LC3 siRNA를 trarmsfection시켜 자식작용을 차단한 뒤 AMPK를 활성화시키는 AICAR를 처치하였다. 그 결과 미토콘드리아 생합성을 조절하는 PGC-1의 mRNA 발현은 LC3 siRNA에 의해서 억제되는 것으로 나타났다.
대상 데이터
TrizoKlnvitrogen, 미국)을 이용하여 2에서 분리해낸 가자미근과 3, 4에서 수집한 C2C12 근세포에서 total RNA를 주줄했다. 분리한 RNA는 다음의 Reverse Transcription(Fermentus, 미국)을 통해 cDNA를 합성하고 realtime PCR를 실시했다.
데이터처리
얻어진 자료들은 평균과 표준오차로 제시하였고, AICAR 혹은 급성운동 처치에 따라 나타나는 변화는 독립 t-test 분석을 이용했고, AICAR와 LC3 siRNA transfection의 처치에 따른 변화를 이원분산 분석법 (two way ANOVA)을 이용하여 분석했다. 처치요인에 대한 사후검증은 Holm-Sidak method을 이용한 다중비교를 실시했다.
처치요인에 대한 사후검증은 Holm-Sidak method을 이용한 다중비교를 실시했다. 통계적 유의수준은 .
성능/효과
(1) 운동은 AMPK 수준을 증가시키고 PGC-1과 미토콘드리 아 생 합성 을 증가시 키 지 만, 자식 작용에는 직접적인 영향을 미치지 않는다.
증가 및 근육의 지방축적, 3) 유전적 원인 (절약유전자 가설, thrifty gene hypothesis)의한 열 발생 억제 등이 있고, 이러한 각각의 기전들은 미토콘드리아와 연관되어 있다.
AICAR를 처치하였다. 그 결과 미토콘드리아 생합성을 조절하는 PGC-1의 mRNA 발현은 LC3 siRNA에 의해서 억제되는 것으로 나타났다. 하지만, AICAR 처치에 의한 PGC-1 mRNA 발현 증가효과는 LC3 SiRNA로 억제되지는 않았다.
그 결과, LC3 siRNA transfectiori을 통해 LC3 mRNA발현이 억제되었다(.p=0.004)[그림 6].
그리고 연구결과들을 종합해보면, 자식작용은 AMPK, PGC-1 그리고 미토콘드리아 생합성에 이르는 신호전달경로에서 중간신호물질로 작용하지는 않으며 , 다른 별도의 신호전달 전달체계를 통해 PGC-1과 미토콘드리아 생합성의 활성에 영향을 미칠 것으로 사료된다.
또한 운동이 미토콘드리아 생합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 측정한 미토콘드리아 전사를 조절하는 보조 활성인자 PGC-1과 미토콘드리아 전사조절인자 mtTFA의 mRNA 발현은 급성운동에 의해 유의한 증가가 나타났다[그림 4][그림 5],
먼저, 운동의 자식작용에 대한 영향을 확인한 결과, 6 시간의 급성 운동으로 쥐의 골격근에서 LC3의 mRNA 발현이 증가하는 경향이 나타났지만 통계적인 유의차는 없었다. 이는 운동이 자식작용을 간접적으로 유도할 가능성은 있지만, 직접적인 신호자극을 일으키지는 않음을 의미한다.
하지만, AICAR 처치에 의한 PGC-1 mRNA 발현 증가효과는 LC3 SiRNA로 억제되지는 않았다. 미토콘드리아 생합성의 전사를 조절하는 mtTFA의 mRNA 발현에 대한결과에서도, mtTFA는 AICAR 처치에 의해 증가했지만 이러한 증가가 LC3 siRNA에 의해서 억제되지 않는 것으로 나타났다. 이러한 일련의 결과들은 미토콘드리아 생합성을 위한 신호전달체계에서, 자식작용이 운동과 AMPK와는 다른 요인들에 의해 주로 활성화어 PGC-1 과 미토콘드리아 생합성에 영향을 미치는 것을 의미한다.
아울러 미토콘드리아 생합성의 전사를 조절하는 mtTFA의 mRNA 발현을 조사한 결과에서는, LC3 siRNA transfection을 통해 mtTFA mRNA 발현이 억제되는 경향을 나타냈지만 통계적으로 유의하지는 않았다(.p=0.056). 그리고 AMPK 길항제인 AICAR처치에의해서는 mtTFA mRNA 발현이 유의하게 증가하였다 (P=O.
운동이 자식작용에 미치는 효과를 확인하기 위해 6시간의 급성운동을 처치한 결과, 쥐의 골격근에서 LC3의 mRNA 발현이 증가하는 경향을 나타냈지만 통계적인 유의차는 없었다(p=0.781)[그림 3],
이어서, PGC-1의 mRNA 발현을 측정한 결과, LC3 siRNA가 transfection을 통해 PGC-1 mRNA 발현을 억제되었고(.p=0.015), AICAR 처치에 의해 PGC-1 mRNA 발현이 다시 증가하였다(p<0.001). 두 처치의 상호작용 효과는 없었다[그림 71.
대한 기전을 일부 설명할 수 있다. 이와 관련하여, 18월령의 노령 생쥐에서는 골격근의 인슐린 저항성과 고인슐린 혈증이 관찰되었으며, 동시에 미토콘드리아의 기능과 mtDNA가 감소되었고, 산화스트레스가 증가되었다. 그리고 IRS-l(insu]in receptor substrate T) 이감소하여 인슐린 저항성을 증가되는 한편, 미토콘드리아의 기능 유지에 중요하다고 여겨지는 자식작용이 억제되는 것을 보고하였다[1].
이는 운동이 자식작용을 간접적으로 유도할 가능성은 있지만, 직접적인 신호자극을 일으키지는 않음을 의미한다. 하지만 미토콘드리아 생합성에 대한 영향에 대해서는 운동에 의해 미토콘드리아 전사를 조절하는 보조활성인자인 PGCT과 미토콘드리아 전사조절인자인 mtTFA의 mRNA 발현이 유의하게 증가함으로써, 운동이 직접적인 자극신호임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 운동과 미토콘드리아 생합성에 관한 선행연구들과도 일치한다[9].
참고문헌 (19)
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