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문제 정의
- cereus 간 독소 유전자들의 서열 다양성 때문에 검출 오류가 생기기 쉽다. 이 연구는 독소 발현 제어 유전자 plcR-papR의 PCR 확인이 설사 독소 생산 B. cereus 검출방법으로 적당한지 여부를 확인하고 만일 가능하다면 설사 및 구토 독소의 동시 검출을 위한 PCR 조건 확립에 목표를 두었다. 이를 위해 첫째, GenBank database에 등록된 plcR-papR 서열들로부터 가장 잘 보존된 영역들에 대한 PCR 프라이머들을 설계한 뒤 설사 독소 유전자를 가진 것으로 확인된 96균주의 B.
- 설사 독소 유전자를 함유한 균주의 간편한 확인 방법으로서 plcR-papR의 PCR 검출 방법을 개발하고자 하였다. 독소 유전자 hclACD, nheABC, cytK 검출용 프라이머 쌍을 사용하여 8종류의 표준 균주(6종은 무독성 균주, 2종은 독성 균주)들에 대해 각각 PCR한 결과 B.
- cereus 그룹이 생산하는 설사형 독소 유전자인 nheABC, hblACD, cytK와 구토형 독소 유전자인 ces 검출을 위해 지금까지는 균주 당 8번의 반복적인 PCR을 수행하는 것이 일반적인 방법이었다. 이 연구는 이러한 번거로움을 줄이기 위해 설사 독소들의 전사조절 유전자인 plcR 및 papR을 기존 검출법의 대체 수단으로 사용할 수 있는지를 검증하였고, plcR-papR 단독 또는 ces로부터 제작한 프라이머를 함께 이용하여 한번의 PCR로 균의 설사 및 구토 독소 생산 유무를 동시에 확인하는 방법을 시도하였다. 144균주에 대해 이 방법을 수행한 결과 기존의 PCR 방법에 의해 얻어진 결과들과 일치하였으므로 앞으로 이 기술은 식중독 예방을 위한 조기 감지와 모니터링, 식중독 발생 시 정확한 진단을 위한 표지 수단 등으로 간편하게 사용될 수 있을 것으로 예상한다.
제안 방법
- B. cereus의 선택적 배양 및 분리를 위해 polymyxin B, methoprim 및 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucopyranoside가 함유된 chromogenic Bacillus cereus selective medium (Oxoid, UK)에 시료 0.2 ml을 도말하고, 30℃에서 24시간 배양하였다.
- PCR 산물들은 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems Inc., USA)을 이용한 dideoxy sequencing 염기서열 분석을 하여 각 독소 유전자의 증폭여부를 검증하였다.
- Cereulide 독소 생산 균주인 B. cereus (GenBank accession no. AB248763)의 cesA 및 cesB의 염기서열로부터 PRIMER3(12) 프로그램을 이용하여 PCR용 cesA 프라이머 쌍(cesAF, 5'-GTTGGCGTGTTATGTGATCG-3'; cesAR, 5'-GGTGAAACAGCTTCTCCTGC-3')과 cesB 프라이머 쌍(cesBF, 5'-AAAGAATGTTTCACCGAAGACGGTT-3'; cesBR, 5'-ACACACTTCTTTTCCGATTCCACCT-3')을 합성하였으며, AB248763 균주를 기준으로 cesA 및 cesB의 PCR 예상 서열 길이는 각각 662 bp 및 1161 bp이었다.
- cereus 검출방법으로 적당한지 여부를 확인하고 만일 가능하다면 설사 및 구토 독소의 동시 검출을 위한 PCR 조건 확립에 목표를 두었다. 이를 위해 첫째, GenBank database에 등록된 plcR-papR 서열들로부터 가장 잘 보존된 영역들에 대한 PCR 프라이머들을 설계한 뒤 설사 독소 유전자를 가진 것으로 확인된 96균주의 B. cereus들에 대해 최적 PCR 조건에서 이들 유전자 존재 유무를 검증하였고, 둘째, 설사 및 구토 독소유전자의 동시 검출을 위해 plcR-papR 및 cesA 또는 cesB를 검출하기 위한 multiplex PCR 방법을 확립하고자 하였다.
- 2008.12~2009.05월 사이에 전통 방법에 따라 제조한 75종의 된장, 고추장, 청국장들을 구입 후 5 g을 취해 0.3 mM 인산 완충액(pH 7.2)으로 희석하였다. B.
- , USA)을 이용한 dideoxy sequencing 염기서열 분석을 하여 각 독소 유전자의 증폭여부를 검증하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 초기 변성 후, 94℃ 1분간 변성, 58℃ 1분간 결합, 72℃ 1분간 증폭 과정을 30회 반복과 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다. B.
- plcR 및 papR 유전자 서열 중 잘 보존된 영역을 찾기 위해 B. cereus strain NVH 0075-95의 1,445 bp 염기 서열(GenBank accession no. DQ153391) 중 plcR-papR 영역인 1,093 bp 염기 서열을 대상으로 BLASTN program을 수행하였다. 84 종류의 plcR-papR 유전자 서열들 중 서열 일치성이 높은 영역들을 1차로 선정한 뒤, PRIMER3 program을 사용해 이들 보존 영역들끼리 프라이머 쌍이 이루어지도록 설계하였다.
- DQ153391) 중 plcR-papR 영역인 1,093 bp 염기 서열을 대상으로 BLASTN program을 수행하였다. 84 종류의 plcR-papR 유전자 서열들 중 서열 일치성이 높은 영역들을 1차로 선정한 뒤, PRIMER3 program을 사용해 이들 보존 영역들끼리 프라이머 쌍이 이루어지도록 설계하였다. 최종적으로 선정한 3쌍의 서열은 다음과 같다: plcRpapR1F, 5'-CAGCARTTTCTTCAATGGCAA-3'; plcRpapR1R, 5'-CCATGCYATYGCTAACGTTAA-3'; plcRpapR2F, 5'-CAGCARTTTCTTCAATGGCA-3'; plcRpapR2R, 5'-ARTTTYTTCATATTCCATCACCCRC-3'; plcRpapR11F, 5'-CRGGYGCRGTATACCCAAGT-3'; plcRpapR11R, 5'-TGAAATACCCCATGYCATYG-3'.
- cereus는 cytK 유전자를 함유하고 있었다(결과 미제시). plcR-papR 프라이머 쌍이 독소 유전자 함유 균주의 확인에 적합하게 설계되었는지 검증하기 위하여 같은 표준 균주의 genomic DNA와 plcRpapR11 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 한 뒤 전기 영동 결과는 Fig. 1과 같았다. B.
- 1의 실험 결과와 잘 일치한다. 다양한 시료로부터 plcR-papR 이용 가능성을 얻기 위하여, 분석 균주로서 적어도 한가지 이상의 설사 독소 유전자를 함유한 B. cereus의 96균주들을 전통 장류에서 분리했고, 대조 균주로서 각 독소들에 대한 PCR 후 설사 독소 유전자를 함유하지 않은 걸로 확인된 B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens를 포함하는 48균주들을 사용했다. 각 독소 유전자 특이적 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 했을 때 96균주들이 함유한 독소 유전자 패턴은 Table 1과 같았다.
- 각 독소 유전자 프라이머를 사용한 PCR 반응에서 음성을 보였던 것과 동일하게 독소 유전자를 가지지 않은 대조 균주들에서도 plcR 및 papR 역시 함유하지 않는다는 것을 보여주었다. 설사형 독소 유전자만 함유하는 48균주의 B. cereus (균주 no. 49-96) DNA를 분리한 뒤 plcRpapR1, plcRpapR2 또는 plcRpapR11을 사용하여 PCR을 수행 하였다(Fig. 2B~D, lanes no 49-96). 각 독소 유전자 프라이머 쌍을 사용한 PCR 반응에서 모두 양성 반응을 나타냈던 것과 동일하게 plcRpapR1을 사용한 PCR에서 660 bp (Fig.
- 분리 정제한 이 PCR 산물들의 염기 서열을 판독했을 때 plcR-papR 유전자로 나타나(결과 미제시), 각 설사형 독소 유전자를 검출하는 기존의 PCR 방법 대신 plcRpapR 유전자를 검출하는 PCR 방법으로 대체하는 것이 가능함을 확인할 수 있었다. 설사형 및 구토형 유전자를 동시에 지니는 48균주들의 B. cereus (균주 no. 97-144)들을 대상으로 plcRpapR11 및 cesA 프라이머, 또는 plcRpapR11 및 cesB 프라이머를 사용하여 동일한 조건으로 multiplex PCR을 수행하였다. 전기영동 결과 두 개의 밴드가 확인되는 양성 반응(plcRpapR11과 cesA를 사용한 PCR 경우 888 bp와 662 bp 위치에서 두 밴드, plcRpapR11과 cesB의 경우 1,161 bp와 888 bp 위치에서 두 밴드)을 나타냈다(Fig.
- 2 ml을 도말하고, 30℃에서 24시간 배양하였다. 한 시료 내 같은 종류의 균주들만 선택하지 않기 위해 청색 집락 주위로 백색 환을 가진 균들을 75종 장류 시료별로 각 1~2개씩만 택하여 nutrient broth (NB)에 접종한 뒤, 30℃에서 12시간 배양하여 genomic DNA를 추출하였다. 윤 등(1)의 방법에 따라 설계한 프라이머와 추출한 genomic DNA를이용하여 B.
대상 데이터
- cereus로 판정된 96균주들을 분석 균으로 최종 선발하였다. 대조 균주로서 B. cereus 선택 배지에서 자라지 않지만 Nutrient Agar (NA)에서 자란 균들 중 PCR을 수행하여 독소 유전자를 함유하지 않은 43균주들과 B. subtilis KCTC 1021, B. subtilis KCTC 1023, B. subtilis KCTC 1027, B. subtilis KCTC 1107, B. subtilis KCTC 1326을 사용하였다. 실험 방법의 적절성 검증을 위해 표준 균주(type strain)로 B.
- subtilis subsp. spizizenii KCTC 3705, B. mojavensis KCTC 3706을 사용하였다.
이론/모형
- 한 시료 내 같은 종류의 균주들만 선택하지 않기 위해 청색 집락 주위로 백색 환을 가진 균들을 75종 장류 시료별로 각 1~2개씩만 택하여 nutrient broth (NB)에 접종한 뒤, 30℃에서 12시간 배양하여 genomic DNA를 추출하였다. 윤 등(1)의 방법에 따라 설계한 프라이머와 추출한 genomic DNA를이용하여 B. cereus의 독소 유전자 함유 여부는 PCR로 확인하였다. Cereulide 독소 생산 균주인 B.
성능/효과
- PCR 조건은 94℃에서 2분간 초기 변성 후, 94℃ 1분간 변성, 58℃ 1분간 결합, 72℃ 1분간 증폭 과정을 30회 반복과 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다. B.cereus 선택 배지에서 배양과 PCR 산물의 유전자 서열 분석 결과 독소 유전자 함유 B. cereus로 판정된 96균주들을 분석 균으로 최종 선발하였다. 대조 균주로서 B.
- subtilis subsp. spizizenii, B. mojavensis에서는 PCR 산물이 없었던 반면, B. thuringiensis는 nheABC, cytK 유전자들을, B. cereus는 cytK 유전자를 함유하고 있었다(결과 미제시). plcR-papR 프라이머 쌍이 독소 유전자 함유 균주의 확인에 적합하게 설계되었는지 검증하기 위하여 같은 표준 균주의 genomic DNA와 plcRpapR11 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 한 뒤 전기 영동 결과는 Fig.
- cereus (lane 10)에서는 예상된 888 bp 위치에서 분명한 PCR 산물이 나타났다. 즉, plcRpapR 프라이머를 이용한 PCR 방법은 독소 함유 B. cereus group 표준 균주들과 무독소 Bacillus 표준 균주들 사이를 정확히 구분할 수 있었으며, 설사 독소 유전자들을 함유한 Bacillus 표준 균주들은 예상대로 plcR-papR 유전자를 함께 함유하고 있음을 보여주었다. GenBank database에 따르면 현재까지, 10균주의 B.
- 각 독소 유전자 특이적 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 했을 때 96균주들이 함유한 독소 유전자 패턴은 Table 1과 같았다. 특징적으로 B. cereus 균들은 균주에 따라 함유 독소 유전자 종류가 달랐으며, 96균주 모두에서 nheABC 유전자들 중 최소 하나 이상을 함유하였다(균주 no. 49-144). 이 결과는 B.
- cereus의 분리 균들을 대상으로 nheABC와 plcR-papR 두 유전자 존재에 대한 상관 관계를 더 조사해야 할 필요가 있지만, plcR-papR 검출의 장점은 nheABC 이외에 다른 설사 독소 유전자인 hblACD 과 cytK의 유전자를 함유한 균들도 함께 검출할 수 있어 nheABC 보다 더 일반화되고 간편한 독소 균주 검출법으로 사용될 수 있다는 점이다. 전체 B. cereus 균주들을 대상으로 hblACD, cytK, ces 유전자 분포 비율은 각각 30.6%, 31.3%, 33%를 나타냈다. 한편 표준 균주를 포함해 설사 및 구토 독소 유전자들이 음성으로 나타난 균들(균주 no.
- 3%, 33%를 나타냈다. 한편 표준 균주를 포함해 설사 및 구토 독소 유전자들이 음성으로 나타난 균들(균주 no. 1-48)을 동정한 결과 B. cereus가 아닌 B. subtilis, B. licheniformis 또는 B. amyloliquefaciens 중 하나로 분류되었다. 이는 각 독소 특이적 PCR 프라이머들과 반응 조건이 독소 유전자 비함유 균주들을 구분하는데 적합하게 설계되었다는 것을 의미한다.
- 1-48)와 같았다. 각 독소 유전자 프라이머를 사용한 PCR 반응에서 음성을 보였던 것과 동일하게 독소 유전자를 가지지 않은 대조 균주들에서도 plcR 및 papR 역시 함유하지 않는다는 것을 보여주었다. 설사형 독소 유전자만 함유하는 48균주의 B.
- 2B~D, lanes no 49-96). 각 독소 유전자 프라이머 쌍을 사용한 PCR 반응에서 모두 양성 반응을 나타냈던 것과 동일하게 plcRpapR1을 사용한 PCR에서 660 bp (Fig. 2B), plcRpapR2에서 623 bp (Fig. 2C), plcRpapR11에서 888 bp (Fig. 2D) 위치의 단일 밴드를 각각 보여 48 균주 모두 양성 반응을 나타냈다. 분리 정제한 이 PCR 산물들의 염기 서열을 판독했을 때 plcR-papR 유전자로 나타나(결과 미제시), 각 설사형 독소 유전자를 검출하는 기존의 PCR 방법 대신 plcRpapR 유전자를 검출하는 PCR 방법으로 대체하는 것이 가능함을 확인할 수 있었다.
- 97-144)들을 대상으로 plcRpapR11 및 cesA 프라이머, 또는 plcRpapR11 및 cesB 프라이머를 사용하여 동일한 조건으로 multiplex PCR을 수행하였다. 전기영동 결과 두 개의 밴드가 확인되는 양성 반응(plcRpapR11과 cesA를 사용한 PCR 경우 888 bp와 662 bp 위치에서 두 밴드, plcRpapR11과 cesB의 경우 1,161 bp와 888 bp 위치에서 두 밴드)을 나타냈다(Fig. 2E and F). 따라서 plcRpapR11와 함께, cesA 또는 cesB를 동시에 사용하는 PCR이 설사형 및 구토형 독소 유전자를 동시에 지닌 B.
- 2E and F). 따라서 plcRpapR11와 함께, cesA 또는 cesB를 동시에 사용하는 PCR이 설사형 및 구토형 독소 유전자를 동시에 지닌 B. cereus의 검출법으로 사용할 수 있음을 보여주었다.
- 분리 정제한 이 PCR 산물들의 염기 서열을 판독했을 때 plcR-papR 유전자로 나타나(결과 미제시), 각 설사형 독소 유전자를 검출하는 기존의 PCR 방법 대신 plcRpapR 유전자를 검출하는 PCR 방법으로 대체하는 것이 가능함을 확인할 수 있었다.
후속연구
- cereus를 대상으로 nheABC 유전자의 PCR 검출에서는 nheA의 경우 3균주, nheB는 5균주, nheC는 5균주에서 음성을 보였고, 한 균주에서는 nheABC 유전자 모두를 함유하지 않아 균주에 따라 일치하지 않은 결과를 보였다(9). 앞으로 B. cereus의 분리 균들을 대상으로 nheABC와 plcR-papR 두 유전자 존재에 대한 상관 관계를 더 조사해야 할 필요가 있지만, plcR-papR 검출의 장점은 nheABC 이외에 다른 설사 독소 유전자인 hblACD 과 cytK의 유전자를 함유한 균들도 함께 검출할 수 있어 nheABC 보다 더 일반화되고 간편한 독소 균주 검출법으로 사용될 수 있다는 점이다. 전체 B.
- 이 연구는 이러한 번거로움을 줄이기 위해 설사 독소들의 전사조절 유전자인 plcR 및 papR을 기존 검출법의 대체 수단으로 사용할 수 있는지를 검증하였고, plcR-papR 단독 또는 ces로부터 제작한 프라이머를 함께 이용하여 한번의 PCR로 균의 설사 및 구토 독소 생산 유무를 동시에 확인하는 방법을 시도하였다. 144균주에 대해 이 방법을 수행한 결과 기존의 PCR 방법에 의해 얻어진 결과들과 일치하였으므로 앞으로 이 기술은 식중독 예방을 위한 조기 감지와 모니터링, 식중독 발생 시 정확한 진단을 위한 표지 수단 등으로 간편하게 사용될 수 있을 것으로 예상한다.
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