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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 건조 마로부터 메탄올 추출물을 조제하고, 이로부터 다양한 유기용매 분획을 조제하여, 이들의 항균, 항혈전 및 항산화 활성을 평가하였다. 그 결과, 마의 메탄올 추출물에서 우수한 항혈전 활성을 확인하였으며, 메탄올 추출물의 헥산 및 에틸아세테이트 분획에서 우수한 항세균 활성 및 항산화 활성을 확인하였기에 보고하는 바이다.
- 따라서, 본 연구에서는 건조 마로부터 메탄올 추출물을 조제하고, 이로부터 다양한 유기용매 분획을 조제하여, 이들의 항균, 항혈전 및 항산화 활성을 평가하였다. 그 결과, 마의 메탄올 추출물에서 우수한 항혈전 활성을 확인하였으며, 메탄올 추출물의 헥산 및 에틸아세테이트 분획에서 우수한 항세균 활성 및 항산화 활성을 확인하였기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 마의 부가적인 생리활성 탐색을 위해 건조마로부터 메탄올 추출물을 조제하고, 이로부터 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올의 다양한 유기용매 분획물 및 물 잔류물을 조제하여 각각의 항균, 항혈전 및 항산화 활성을 평가하였다. 마 추출물의 66.
제안 방법
- 37℃에서 0.5 U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50 µL와 20 mM CaCl 250 µL, 다양한 농도의 시료 추출액 10 µL를 coagulometer의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100 µL를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, 시료 대조군으로는 아스피린(Sigma Co.)을, 용매 대조군으로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다.
- DPPH free radical 소거능은 시료첨가구와 비첨가구의 백분율로 표시하였으며, IC50는 50% 소거능을 나타내는 농도로 계산하였고 최종 결과는 3회 측정값의 평균과 편차로 나타내었다. Superoxide dismutase(SOD) 유사활성 평가는 superoxide와 반응하여 갈변물질을 만드는 pyrogallol 자동산화를 측정하는 Marklund와 Marklund의 방법[15]을 변형하여 측정하였다. 즉 시료용액 0.
- 대조구로는 항세균제인 ampicillin과 항진균제인 miconazole(Sigma Co., USA)을 각각 5 µg/disc 농도로 사용하였으며, 생육저지환의 크기는 육안으로 생육이 나타나지 않는 부분의 지름을 mm 단위로 측정하였고, 3회 이상 평가 후 대표 결과로 나타내었다.
- 먼저, 항세균 활성 평가의 경우, Nutrient broth(Difco Co., USA)에 각각의 세균을 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 각 균주를 O.D.600 0.1로 조정하여 Nutrient agar(Difco Co., USA) 배지를 포함하는 멸균 petri dish(90 × 15 mm, 녹십자, 한국)에 100 µL 도말하고, 각각의 시료 5 µL를 멸균 disc-paper(지름 6.5 mm, Whatsman No.2)에 가하여, 37℃에서 24시간 동안 배양하였으며, 효모 및 식물병원성 곰팡이의 경우에는 Sabouraud dextrose 배지 및 Potato dextrose agar(Difco Co. USA)를 이용하여 동일한 방법으로 37℃에서 24시간 동안 배양 후, 생육저지환의 크기를 측정하여 항균활성을 평가하였다[24-26].
- 1%(w/w)를 나타내었다. 메탄올 추출물은 물에 현탁한 후, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하였으며, 분획물과 물 잔류물은 동일한 방법으로 감압건조하여 분말화 하였다. 각각의 시료 분말은 DMSO에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 항균 활성, 항혈전 활성 및 항산화 활성에 사용하였다.
- 생마 30 kg을 세절 및 건조하여 건조 마 8.9 kg을 회수하였으며, 이 중 4 kg을 이용하여 메탄올 추출물 44 g을 조제하였다(추출율 1.1% w/w). 메탄올 추출물의 순차적 분획 결과는 Table 1에 나타내었으며, 물 잔류물이 66.
- 3 cm로 절단하여 60℃에서 항량 건조시켰다. 이때 생마의 수분함량은 70.3%이었으며, 메탄올 추출물 조제를 위해 건조 마 4 kg에 8L의 메탄올을 가하여 상온에서 24시간씩 3회 추출하였다. 이후, 추출액은 filter paper(Whatsman No.
- 총 polyphenol 함량은 추출 검액 400 µL에 50 µL의 Folin-ciocalteau, 100 µL의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다[19, 24, 25].
- 항혈전 활성은 시료의 thrombin time을 측정하여 평가하였다. 트롬빈 저해 활성은 기존의 보고한 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)를 이용하여 혈액 응고시간을 측정하여 평가하였다[19, 24, 25]. 37℃에서 0.
- SOD 유사활성은 시료 첨가군과 무첨가군과의 흡광도 비로 나타내었다. 한편 환원력 평가는 Oyaizu 등의 방법을 변형하여 측정하였다[16, 24]. 에탄올에 용해한 시료 2.
- 각각의 시료 분말은 DMSO에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 항균 활성, 항혈전 활성 및 항산화 활성에 사용하였다. 항혈전 활성 평가를 위한 thrombin time 측정시, 혈장은 최근 1개월 동안 약물투여를 받지 않은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 4℃에서 5,000 g로 5분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며(신선동결혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다. 기타 시약은 Sigma Co.
- 항혈전 활성은 시료의 thrombin time을 측정하여 평가하였다. 트롬빈 저해 활성은 기존의 보고한 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)를 이용하여 혈액 응고시간을 측정하여 평가하였다[19, 24, 25].
- 5 mL를 첨가하여 반응을 종료하고 4000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 증류수로 2배 희석한 후, 신선하게 조제된 0.1% ferric chloride 용액과 5:1(v/v)비율로 혼합하고 700 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였으며, 대조구로는 butyl hydroxytoluene을 사용하였다. SOD 유사활성 평가 및 환원력 평가 결과는 3회 반복실험 후, 평균과 표준편차로 나타내었다.
대상 데이터
- 메탄올 추출물은 물에 현탁한 후, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하였으며, 분획물과 물 잔류물은 동일한 방법으로 감압건조하여 분말화 하였다. 각각의 시료 분말은 DMSO에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 항균 활성, 항혈전 활성 및 항산화 활성에 사용하였다. 항혈전 활성 평가를 위한 thrombin time 측정시, 혈장은 최근 1개월 동안 약물투여를 받지 않은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 4℃에서 5,000 g로 5분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며(신선동결혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다.
- 2에 나타내었다. 대조구로는 BHT를 사용하였으며, 0.05 mg/mL 농도에서 0.84의 흡광도를 나타내어 강력한 환원력을 나타내었다. 마의 메탄올 추출물 및 각각의 분획물들은 농도 증가에 따라 환원력이 증가되었으며, 헥산 및 에틸아세테이트 분획에서 가장 강력한 활성이, 그리고 물 잔류물에서 가장 미약한 활성이 나타났다.
- , Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 butyl hydroxytoluene, vitamin C 및 vitamin E(Sigma Co., USA)를 사용하였다. DPPH free radical 소거능은 시료첨가구와 비첨가구의 백분율로 표시하였으며, IC50는 50% 소거능을 나타내는 농도로 계산하였고 최종 결과는 3회 측정값의 평균과 편차로 나타내었다.
- 마의 메탄올 추출물 및 이들의 분획물의 항균 활성을 평가하기 위해 그람 음성균으로 Escherichia coli KCTC 1682, Proteus vulgaris KCTC 2433, Salmonella typhimurium KCTC 1926을, 그람 양성균으로는 Staphylococcus aureus KCTC 1916, Listeria monocytogenes KACC 10550, Bacillus subtilis KCTC 1924를 사용하였다. 한편 항진균 활성 평가를 위해서는 Saccharomyces cerevisiae IF0 0233 및 캔디다증 진균감염증 원인균 Candida albicans KCTC 1940를 사용하였으며, 항곰팡이 활성을 위해서는 Botrytis cinerea KACC 40574, Pyricularia grisea KACC 40414, Rhizoctonia solani KACC 40101, Glomerella cingulata KCTC 6075, Collectotrichum gloeosporioides KCTC 6169, Phytophthora capsici KACC 40157와 Botryosphaeria dothidea(겹무늬 썩음병 분리균)을 사용하였다.
- 실험에 사용한 마 시료는 2006년 11월 경북 안동에서 재배한 장마로, 수확 후 2개월간 움 저장된 생마를 시장에서 구입하여 사용하였다. 장마 시료는 안동대학교 식품영양학과에 보관되어 있다(시료번호: A0304).
- 총 polyphenol 함량은 추출 검액 400 µL에 50 µL의 Folin-ciocalteau, 100 µL의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다[19, 24, 25]. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenolsulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[19, 24].
- 마의 메탄올 추출물 및 이들의 분획물의 항균 활성을 평가하기 위해 그람 음성균으로 Escherichia coli KCTC 1682, Proteus vulgaris KCTC 2433, Salmonella typhimurium KCTC 1926을, 그람 양성균으로는 Staphylococcus aureus KCTC 1916, Listeria monocytogenes KACC 10550, Bacillus subtilis KCTC 1924를 사용하였다. 한편 항진균 활성 평가를 위해서는 Saccharomyces cerevisiae IF0 0233 및 캔디다증 진균감염증 원인균 Candida albicans KCTC 1940를 사용하였으며, 항곰팡이 활성을 위해서는 Botrytis cinerea KACC 40574, Pyricularia grisea KACC 40414, Rhizoctonia solani KACC 40101, Glomerella cingulata KCTC 6075, Collectotrichum gloeosporioides KCTC 6169, Phytophthora capsici KACC 40157와 Botryosphaeria dothidea(겹무늬 썩음병 분리균)을 사용하였다. 먼저, 항세균 활성 평가의 경우, Nutrient broth(Difco Co.
데이터처리
- , USA)를 사용하였다. DPPH free radical 소거능은 시료첨가구와 비첨가구의 백분율로 표시하였으며, IC50는 50% 소거능을 나타내는 농도로 계산하였고 최종 결과는 3회 측정값의 평균과 편차로 나타내었다. Superoxide dismutase(SOD) 유사활성 평가는 superoxide와 반응하여 갈변물질을 만드는 pyrogallol 자동산화를 측정하는 Marklund와 Marklund의 방법[15]을 변형하여 측정하였다.
- 1% ferric chloride 용액과 5:1(v/v)비율로 혼합하고 700 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였으며, 대조구로는 butyl hydroxytoluene을 사용하였다. SOD 유사활성 평가 및 환원력 평가 결과는 3회 반복실험 후, 평균과 표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- 마의 메탄올 추출물 및 이의 분획물의 항산화 활성은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) radical 소거능[7, 8, 17], superoxide dismutase 유사활성 및 환원력 측정[15, 16, 24]에 의해 평가하였다. 먼저 DPPH 소거능의 경우, 다양한농도로 희석한 시료 20 µL에 99.
- 총 flavonoid의 함량 측정은 기존의 보고한 방법[19, 24, 25]에 따라 측정하였으며, 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고 여과한 추출 검액 400 µL에 90% diethylene glycol 4 mL를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 µL를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenolsulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[19, 24].
성능/효과
- 마의 메탄올 추출물 및 각각의 분획물들은 농도 증가에 따라 환원력이 증가되었으며, 헥산 및 에틸아세테이트 분획에서 가장 강력한 활성이, 그리고 물 잔류물에서 가장 미약한 활성이 나타났다. BHT의 환원력과 비교할 경우, 메탄올 추출물, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물 및 물 잔류물은 각각 35.7%, 73.4%, 82,7%, 27.8% 및 20.2%의 환원력을 나타내었다(Fig. 2). 이상의 결과는 마 추출물의 에틸아세테이트 분획이 강력한 항산화 활성물질을 포함하고 있음을 나타내며, 현재 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 활성물질의 정제가 진행 중에 있다.
- )을, 용매 대조군으로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 평균 33.0초의 응고시간을 나타내었으며, 트롬빈 저해 활성은 3회 이상 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다.
- 조제된 마의 메탄올 추출물은 500 µg/disc 농도에서 Salmonella typhimurium에는 강한 항균력을 나타내었으며, Listeria monocytogenes 및 Bacillus subtilis에 대해서는 미약한 항균 활성이 나타났으며, 그 외의 실험균주에서는 항균력이 인정되지 않았다. 그러나 헥산 및 에틸아세테이트 분획에서는 Proteus vulgaris 및 Escherichia coli에 대한 항세균 활성이 부가적으로 나타났으며, 특히 에틸아세테이트 분획의 경우 Staphylococcus aureus를 제외한 5종의 세균에 모두 활성이 인정되었다. 시료 모두에서, 마의 영여자에서 보고된 항진균 활성[9]과 같은 항균 활성은 나타나지 않았다.
- 6%의 활성을 나타내었다. 대조구로 사용된 vitamin C가 0.18 mg/mL 농도에서 58%의 활성을 나타낸 것과 비교하면, 동일 활성을 위해, 에틸아세테이트 분획은 vitamin C의 2.3배, 헥센 분획 및 메탄올 추출물은 vitmain C의 10배 이상의 농도가 필요함을 알 수 있었다. 메탄올 추출물 및 각각의 분획물을 대상으로 환원력을 평가한 경우는 Fig.
- 본 연구에서는 마의 부가적인 생리활성 탐색을 위해 건조마로부터 메탄올 추출물을 조제하고, 이로부터 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올의 다양한 유기용매 분획물 및 물 잔류물을 조제하여 각각의 항균, 항혈전 및 항산화 활성을 평가하였다. 마 추출물의 66.7%는 물 잔류물로서, 메탄올 추출물의 상당량이 수용성 성분임을 확인하였으며, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 에틸아세테이트 분획에서 가장 높게 나타났다. 항균 활성의 경우, 에틸아세테이트 분획물 500 µg/disc에서 Staphylococcus aureus를 제외한 실험세균 모두에서 우수한 항세균 활성이 나타났으며, 항진균 활성은 모든 시료에서 나타나지 않았다.
- 84의 흡광도를 나타내어 강력한 환원력을 나타내었다. 마의 메탄올 추출물 및 각각의 분획물들은 농도 증가에 따라 환원력이 증가되었으며, 헥산 및 에틸아세테이트 분획에서 가장 강력한 활성이, 그리고 물 잔류물에서 가장 미약한 활성이 나타났다. BHT의 환원력과 비교할 경우, 메탄올 추출물, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물 및 물 잔류물은 각각 35.
- 0초)시켜 항혈전제로의 우수성을 확인할 수 있었다(Table 3). 마의 메탄올 추출물의 경우에는, 4.8 mg/mL 농도에서 아스피린 1.5 mg/mL에 해당하는 99.5초의 트롬빈 타임을 나타내어, 우수한 항혈전 활성을 확인하였다. 분획물의 경우에는 헥산 및 에틸아세테이트 분획에서 항혈전 활성이 나타났으나, 메탄올 추출물보다 상대적으로 약하여 활성성분이 각각의 용매 분획으로 나뉘어졌음을 추측할 수 있었다.
- 먼저 vitamin C, BHT 및 vitamin E의 IC50들은 각각 15.2, 18.6, 및 35.6 µg/mL를 나타내어 강력한 DPPH 소거능이 나타났으며, 반면 마의 메탄올 추출물은 602.2 µg/mL의 IC50를 나타내어, 기존의 우수한 항산화 활성이 보고된 토사자, 목향, 당귀, 목통, 골담초, 호이초[7, 24] 등에 비해서는 미약한 활성을 보였다.
- 먼저 항세균제 대조구로 사용된 ampicillin의 경우, 사용한 6종의 세균에 대해 모두 강한 항균활성을 나타났으며, 항진균제인 miconazole의 경우 Collectotrichum gloeosporioides을 제외한 C. albicans, S. cerevisiae 및 식물 병원성 곰팡이에 대해 강력한 활성을 나타내었다(Table 2). 조제된 마의 메탄올 추출물은 500 µg/disc 농도에서 Salmonella typhimurium에는 강한 항균력을 나타내었으며, Listeria monocytogenes 및 Bacillus subtilis에 대해서는 미약한 항균 활성이 나타났으며, 그 외의 실험균주에서는 항균력이 인정되지 않았다.
- 메탄올 추출물 및 유기용매 분획물의 항산화 활성 평가 결과, 에틸아세테이트 분획이 80.5 µg/mL의 IC50를 나타내어 우수한 DPPH 소거능을 나타내었으며, SOD유사활성은 vitamin C의 43%, 환원력의 경우 BHT의 82,7%를 나타내어 매우 강력한 항산화 활성 물질을 포함하고 있음을 확인하였다.
- 이상의 결과는 마 추출물의 에틸아세테이트 분획이 강력한 항산화 활성물질을 포함하고 있음을 나타내며, 현재 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 활성물질의 정제가 진행 중에 있다. 본 연구결과는 마의 메탄올 추출물이 우수한 항혈전 활성을, 또한 마 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 우수한 항세균 및 항산화 활성을 가지고 있음을 나타내며, 마의 또 다른 유용 생리활성의 가능성을 제시하고 있다.
- 분획물 중, 헥산 분획물 및 물 잔류물에서는 510.6 µg/mL 및 1,000 µg/mL 이상의 IC50를 각각 나타내어 DPPH 소거능이 인정되지 않았으며, 부탄올 분획의 경우 263.0 µg/mL의 IC50로 미미한 소거능을 나타낸 반면, 에틸아세테이트 분획은 80.5 µg/mL의 IC50로 우수한 소거능을 나타내었다(Table 4).
- 5초의 트롬빈 타임을 나타내어, 우수한 항혈전 활성을 확인하였다. 분획물의 경우에는 헥산 및 에틸아세테이트 분획에서 항혈전 활성이 나타났으나, 메탄올 추출물보다 상대적으로 약하여 활성성분이 각각의 용매 분획으로 나뉘어졌음을 추측할 수 있었다. 부탄올 분획물 및 물 잔류물에서는 4.
- 1). 에틸아세테이트 분획에서 가장 우수한 활성이, 물 잔류물에서는 거의 활성이 나타나지 않았으며, 0.8 mg/mL 농도에서 에틸아세테이트 분획이 85.2%, 헥산 분획이 38.9%, 메탄올 추출물은 37.6%의 활성을 나타내었다. 대조구로 사용된 vitamin C가 0.
- 2). 이상의 결과는 마 추출물의 에틸아세테이트 분획이 강력한 항산화 활성물질을 포함하고 있음을 나타내며, 현재 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 활성물질의 정제가 진행 중에 있다. 본 연구결과는 마의 메탄올 추출물이 우수한 항혈전 활성을, 또한 마 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 우수한 항세균 및 항산화 활성을 가지고 있음을 나타내며, 마의 또 다른 유용 생리활성의 가능성을 제시하고 있다.
- 조제된 마의 메탄올 추출물은 500 µg/disc 농도에서 Salmonella typhimurium에는 강한 항균력을 나타내었으며, Listeria monocytogenes 및 Bacillus subtilis에 대해서는 미약한 항균 활성이 나타났으며, 그 외의 실험균주에서는 항균력이 인정되지 않았다.
- 71%를 차지하여 마 메탄올 추출물이 다량의 수용성 성분을 함유하고 있음을 알 수 있었다. 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총당함량은 모두 에틸아세테이트 분획에서 가장 높게 나타났으며, 에틸아세테이트 분획 효율도 17.52%로, 다른 용매 분획보다 2.4배 높게 나타났다.
- 이는, 헥산 분획 및 물 잔류물에서 폴리페놀 성분함량이 낮으며, 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획에서는 상대적으로 높은 폴리페놀 함량을 나타내므로(Table 1), DPPH 소거능은 마의 폴리페놀 성분에 기인한다고 추측된다. 한편 메탄올 추출물 및 각각의 분획물을 대상으로 SOD유사활성을 측정한 결과, 모두 농도 의존적으로 활성의 증가가 나타났다(Fig. 1). 에틸아세테이트 분획에서 가장 우수한 활성이, 물 잔류물에서는 거의 활성이 나타나지 않았으며, 0.
- 한편, 250 µg/disc 농도에서는 항균활성을 확인할 수 없었으며(결과 미제시), 마의 추출물 및 각각의 분획물은 500 µg/disc의 고농도에서 부분적인 항세균 활성을 나타냄을 확인하였다.
- 항균 활성의 경우, 에틸아세테이트 분획물 500 µg/disc에서 Staphylococcus aureus를 제외한 실험세균 모두에서 우수한 항세균 활성이 나타났으며, 항진균 활성은 모든 시료에서 나타나지 않았다.
- 활성 대조구로 사용된 아스피린은 1.5 mg/mL 농도에서, 용매 대조구로 사용된 DMSO에 비해 트롬빈 타임을 약 3배 증대(103.0초)시켜 항혈전제로의 우수성을 확인할 수 있었다(Table 3). 마의 메탄올 추출물의 경우에는, 4.
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