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문제 정의
- 따라서 본 연구는 집먼지 진드기(Dermatophagoides farinae, Df) 항원을 이용하여 NC/Nga 마우스를 대상으로 인간과 유사한 AD를 유발한 후 고삼추출물을 경구 투여하여 피부질환 스코어(skin dermatitis scores), 피부조직(skin histology), 혈청내 IgE와 Th2 케모카인(TARC/CCL17, MDC/CCL22, CTACK/CCL27)을 조사한 결과 매우 흥미 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구는 NC/Nga 마우스를 대상으로 고삼(Sophora flavescens Aiton) 에탄올 추출물(SFE)을 경구투여 함으로써 아토피 피부염 발생의 억제 효과를 조사하였다. 마우스(6주령)를 대상으로 등쪽 털을 제거하고 8주간 집먼지 진드기(Dermatophagoides farinae, Df) 항원을 1주일에 2회씩 도포함으로 아토피 유사 피부염을 유도하였다.
제안 방법
- Df 항원 면역에 의한 AD 유도는 Matsuoka 등16)과 Yamamoto25) 등의 방법을 약간 변형하여 설계한 후 실험했다(Fig. 1). 요약하면, 6주령의 NC/Nga 마우스의 등쪽털을 안과용가위로 주의 깊게 제거한 후 제모제(한국양행, 서울)를 도포한 후 30℃ 물을 이용하여 털을 완전히 제거한 다음 제모 크림에 의해 파괴된 큐티클층에 마우스당 Df 항원 연고(100 mg)를 도포하였다.
- NC/Nga(6주령) 마우스를 대상으로 8주간 Df 항원 연고를 털이 제거된 등쪽 피부에 마리당 100 mg을 1주일에 2번씩 도포하여 AD을 유도하였다. 정상 대조군은 베이스 연고만 도포(100 mg/마리)하였으며 약물을 투여하지 않았다.
- SFE가 Df 항원으로 면역된 Nc/Nga 마우스의 피부조직과 백혈구 침윤에 미치는 영향을 알아보기 위하여 항원과 약물이 8주간 투여된 마우스를 대상으로 피부조직학적 검사를 수행하였다. 그 결과 Fig.
- SFE가 Df 항원으로 면역된 Nc/Nga 마우스의 혈청 IgE에 미치는 영향을 알아보기 위하여 항원과 약물이 8주간 투여된 마우스를 대상으로 혈청을 얻고 ELISA assay kit를 이용하여 IgE 항체의 양을 조사하였다. 그 결과 Fig.
- 그리고 혈청내 TARC/CCL17, MDC/CCL22 및 CTACK/CCL27의 정량은 혈청은 10배로 희석하여 각 well에 주입하고 R&D사가 제공하는 표준시료를 주입하여 제조회사에서 제시하는 방법에 따라 측정하였다.
- 대조군과 각 실험군에 사용된 마우스는 각각 5마리를 배정하여 실험하였다. 대조군은 4% SDS를 분무만 하였고, 생리식염수를 1일에 1회 경구 투여하였다. 실험군은 100-400 mg/kg의 고삼 에탄올 추출물(Sophora flavescens Aiton ethanol extract, SFE)를 1일에 1회씩 8주간 투여하였다.
- 요약하면, 6주령의 NC/Nga 마우스의 등쪽털을 안과용가위로 주의 깊게 제거한 후 제모제(한국양행, 서울)를 도포한 후 30℃ 물을 이용하여 털을 완전히 제거한 다음 제모 크림에 의해 파괴된 큐티클층에 마우스당 Df 항원 연고(100 mg)를 도포하였다. 두 번째부터 큐티클층을 파괴하기 위하여 도포 부위에 4% SDS를 분무한 후 2시간 동안 완전히 건조한 후 같은 양의 항원을 1주일에 2회로 8주간 도포하였다. 대조군과 각 실험군에 사용된 마우스는 각각 5마리를 배정하여 실험하였다.
- 본 연구는 NC/Nga 마우스를 대상으로 고삼(Sophora flavescens Aiton) 에탄올 추출물(SFE)을 경구투여 함으로써 아토피 피부염 발생의 억제 효과를 조사하였다. 마우스(6주령)를 대상으로 등쪽 털을 제거하고 8주간 집먼지 진드기(Dermatophagoides farinae, Df) 항원을 1주일에 2회씩 도포함으로 아토피 유사 피부염을 유도하였다. SFE는 100-400 mg/kg의 농도로 경구 투여하였다.
- 실험군은 100-400 mg/kg의 고삼 에탄올 추출물(Sophora flavescens Aiton ethanol extract, SFE)를 1일에 1회씩 8주간 투여하였다. 마지막으로 Df 항원으로 면역과 동시에 약물을 투여한 다음 5시간 후에 심장으로부터 혈액을 얻어 실온에 1시간 동안 방치하여 혈액을 응고 시켰다. 응고된 혈액은 3,000 rpm으로 20분간 원심하여 혈청을 얻었다.
- 혈청내 Df 항원에 대한 IgE와 TARC/CCL17, MDC/CCL22 및 CTACK/CCL27의 정량은 ELISA법으로 측정하였다. 먼저 혈청내 IgE 총량은 혈청을 25배 희석하여 각 well에 주입하고 Shibayagi사가 제공하는 표준시료를 주입하여 제조회사에서 제시하는 방법에 준하여 측정하였다. 그리고 혈청내 TARC/CCL17, MDC/CCL22 및 CTACK/CCL27의 정량은 혈청은 10배로 희석하여 각 well에 주입하고 R&D사가 제공하는 표준시료를 주입하여 제조회사에서 제시하는 방법에 따라 측정하였다.
- 실험 과정에 따라 대조군과 실험군을 대상으로 희생시키고, 피부조직을 약 10x10 mm를 적출하여 클립을 이용하여 평평하게 유지하고 4% paraformaldehyde(pH 7.4)로 고정하고 일련의 과정을 통하여 파라핀 블록을 제작한 후 5 ㎛ 간격으로 피부조직을 종단면으로 절편 하였다. 조직학적 검사와 백혈구 침윤을 검사하기 위해서 hematoxylin & eosin 또는 Congo red로 염색하여 저배율(x40)에서 관찰하고 확대하면서 x200 현미경 시야에서 사진을 찍어 제시하였고, 백혈구의 침윤을 확인하기 위해서 x400 현미경 시야에서 검경하였다(Olympus, 일본).
- 대조군은 4% SDS를 분무만 하였고, 생리식염수를 1일에 1회 경구 투여하였다. 실험군은 100-400 mg/kg의 고삼 에탄올 추출물(Sophora flavescens Aiton ethanol extract, SFE)를 1일에 1회씩 8주간 투여하였다. 마지막으로 Df 항원으로 면역과 동시에 약물을 투여한 다음 5시간 후에 심장으로부터 혈액을 얻어 실온에 1시간 동안 방치하여 혈액을 응고 시켰다.
- 양성 대조군은 Df 항원 연고만 도포하고 생리식염수만 투여하였다. 실험군은 하루에 1회씩 마리당 100-400 mg/kg의 SFE를 투여하면서 Df 항원 연고를 동시에 도포하였다. 실험기간동안 피부병변의 변화를 알아보기 위해서 연고 도포 후 2주간격으로 0주째부터 2주 간격으로 8주 동안 사진을 찍어 조사하였다.
- 실험군은 하루에 1회씩 마리당 100-400 mg/kg의 SFE를 투여하면서 Df 항원 연고를 동시에 도포하였다. 실험기간동안 피부병변의 변화를 알아보기 위해서 연고 도포 후 2주간격으로 0주째부터 2주 간격으로 8주 동안 사진을 찍어 조사하였다. 그 결과 정상대조군에 있어서 피부병변의 변화는 경미한 변화가 있었으나, Df 항원 연고가 도포된 양성대조군은 4주째부터 피부병변이 증가되었고 8주까지 그 정도가 심각하게 증가되었으나, SFE 약물이 투여된 실험군에서는 농도에 의존적으로 피부병변이 개선되는 효과가 있었다.
- SFE는 100-400 mg/kg의 농도로 경구 투여하였다. 아토피 유사 피부염은 피부병변 스코어, 피부조직과 면역학적 파라메터(혈청 IgE, TARC/CCL17, MDC/CCL22과 CTACK/CCL27)를 조사하여 평가했다. SFE를 경구투여한 결과 피부병변 스코어와 백혈구 침윤을 포함하는 Df-유도 아토피 피부염의 임상적 징후를 유의하게 억제하는 효과가 있었다.
- 정상 대조군은 베이스 연고만 도포(100 mg/마리)하였으며 약물을 투여하지 않았다. 양성 대조군은 Df 항원 연고만 도포하고 생리식염수만 투여하였다. 실험군은 하루에 1회씩 마리당 100-400 mg/kg의 SFE를 투여하면서 Df 항원 연고를 동시에 도포하였다.
- 조직학적 검사와 백혈구 침윤을 검사하기 위해서 hematoxylin & eosin 또는 Congo red로 염색하여 저배율(x40)에서 관찰하고 확대하면서 x200 현미경 시야에서 사진을 찍어 제시하였고, 백혈구의 침윤을 확인하기 위해서 x400 현미경 시야에서 검경하였다(Olympus, 일본).
- 피부상태는 0주째부터 2주 간격으로 8주 동안 사진을 찍어 조사하였다. 피부의 건조상태(dryness)와 스켈링(scaling) 그리고 미란(erosion), 굴은 상처(excoriation), 출혈 등을 체크하여 병변이 없는 상태를 0점(none), 가벼운 상태를 1점(mild), 중간 상태를 2점(moderate), 심한상태를 3점(severe)을 주어 피부 병변을 평가 하였다.
- 피부상태는 0주째부터 2주 간격으로 8주 동안 사진을 찍어 조사하였다. 피부의 건조상태(dryness)와 스켈링(scaling) 그리고 미란(erosion), 굴은 상처(excoriation), 출혈 등을 체크하여 병변이 없는 상태를 0점(none), 가벼운 상태를 1점(mild), 중간 상태를 2점(moderate), 심한상태를 3점(severe)을 주어 피부 병변을 평가 하였다.
- 한편 SFE가 Df 항원으로 면역된 Nc/Nga 마우스에서 백혈구의 이동에 결정적으로 영향을 미치는 Th2 케모카인의 영향을 알아보기 위해서 항원과 약물이 8주간 투여된 마우스를 대상으로 TARC/CCL17, MDC/CCL22 그리고 CTACK/CCL27에 특이적인 ELISA assay kit를 이용하여 혈청내 Th2 케모카인의 량을 측정하였다. 그 결과 Df 항원으로 면역된 양성대조군은 TARC/CCL17, MDC/ CCL22 그리고 CTACK/CCL27의 양이 각각 3,250.
대상 데이터
- 5주령의 수컷 NC/Nga 마우스는 중앙동물실험실(서울)사로부터 구입하여 1주간 specific pathogen-free(SPF) 상태에서 낮과 밤의 주기를 12시간씩 고정하여 사료(중앙동물실험실)와 멸균 물을 공급하면서 사육한 후 실험에 사용하였다.
- 마우스 TARC/CCL17, MDC/CCL22및 CTACK/CCL27 ELISA kits는 R&D사(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다. Haematoxylin, eosin과 Congo red 그리고 기타 시약은 Sigma사(ST Louis, MO)로부터 구입하였다.
- 두 번째부터 큐티클층을 파괴하기 위하여 도포 부위에 4% SDS를 분무한 후 2시간 동안 완전히 건조한 후 같은 양의 항원을 1주일에 2회로 8주간 도포하였다. 대조군과 각 실험군에 사용된 마우스는 각각 5마리를 배정하여 실험하였다. 대조군은 4% SDS를 분무만 하였고, 생리식염수를 1일에 1회 경구 투여하였다.
- 마우스 TARC/CCL17, MDC/CCL22및 CTACK/CCL27 ELISA kits는 R&D사(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다.
- 집먼지 진드기(Dermatophagoides farinae, Df) 항원 Biostir AD는 Biostir사(일본)로부터 구입하였으며, IgE ELISA kit는 Shibayagi사(일본)로부터 구입하였다. 마우스 TARC/CCL17, MDC/CCL22및 CTACK/CCL27 ELISA kits는 R&D사(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다.
데이터처리
- 모든 실험값은 평균±표준오차로 표시했으며, 통계분석은 ANOVA와 Student’s t-test로 처리했으며, 유의성 한계는 P<0.05로 정하였다.
이론/모형
- 혈청내 Df 항원에 대한 IgE와 TARC/CCL17, MDC/CCL22 및 CTACK/CCL27의 정량은 ELISA법으로 측정하였다. 먼저 혈청내 IgE 총량은 혈청을 25배 희석하여 각 well에 주입하고 Shibayagi사가 제공하는 표준시료를 주입하여 제조회사에서 제시하는 방법에 준하여 측정하였다.
성능/효과
- 본 연구에서 우리는 NC/Nga 마우스를 SPF상태로 유지하면서 Df 항원으로 유도된 AD NC/Nga 마우스에서 고삼 추출액인 SFE의 임상적 영향을 조사한 결과 SFE의 농도에 의존적으로 치료효과가 있었다. Fig. 2에서와 같이 6주령의 마우스를 대상으로 8주간 실험한 결과 피부 병변은 약간 증가했지만 뚜렷한 임상적 결과를 얻지 못했지만, Df 항원으로 면역된 양성대조군은 피부병변이 AD와 유사하였고 시간이 지날 수록 그 특징은 현저했다. 특히 실험 시작일로부터 8주째 마우스에서는 극세포증(acanthosis), 각질증식증(hyperkeratosis), 상처 및 출혈 수준이 3으로 매우 심각했다(Fig.
- 아토피 유사 피부염은 피부병변 스코어, 피부조직과 면역학적 파라메터(혈청 IgE, TARC/CCL17, MDC/CCL22과 CTACK/CCL27)를 조사하여 평가했다. SFE를 경구투여한 결과 피부병변 스코어와 백혈구 침윤을 포함하는 Df-유도 아토피 피부염의 임상적 징후를 유의하게 억제하는 효과가 있었다. 더욱이 SFE 투여는 농도의존적으로 혈청 IgE와 Th2 케모카인(TARC/CCL17, MDC/CCL22, and CTACK/CCL27) 레벨을 유의하게 억제하였다.
- 그 결과 Df 항원으로 면역된 양성대조군은 TARC/CCL17, MDC/ CCL22 그리고 CTACK/CCL27의 양이 각각 3,250.80±530.20 pg/ml, 2,330.32±420.05 pg/ml, 930.05±180.15 pg/ml으로 측정되어 정상대조군에 비해 현저히 높았으나, SFE가 투여된 실험군에서는 TARC/CCL17(Fig. 6A)과 CTACK/CCL27(Fig. 6C)은 농도에 의존적으로 억제되었으며, 그 효과는 200-400 mg/ml 실험군에서 현저했다(p<0.05, p<0.01).
- SFE가 Df 항원으로 면역된 Nc/Nga 마우스의 피부조직과 백혈구 침윤에 미치는 영향을 알아보기 위하여 항원과 약물이 8주간 투여된 마우스를 대상으로 피부조직학적 검사를 수행하였다. 그 결과 Fig. 3과 같이 정상대조군은 피부조직의 변화가 없었지만, Df 항원으로 면역된 마우스의 피부조직은 극세포증(acanthosis), 각질증식증(hyperkeratosis), 상처 및 출혈 수준이 매우 심각했다. 그러나 SFE가 투여된 실험군에서는 피부조직 병변이 농도에 의존적으로 현저히 개선되었다.
- 그 결과 Fig. 5와 같이 정상대조군의 혈청 IgE량은 베이스 수준이었지만, Df 항원으로 면역된 양성대조군은 3,095.57±330.06/ml로 현저히 증가되었다.
- 실험기간동안 피부병변의 변화를 알아보기 위해서 연고 도포 후 2주간격으로 0주째부터 2주 간격으로 8주 동안 사진을 찍어 조사하였다. 그 결과 정상대조군에 있어서 피부병변의 변화는 경미한 변화가 있었으나, Df 항원 연고가 도포된 양성대조군은 4주째부터 피부병변이 증가되었고 8주까지 그 정도가 심각하게 증가되었으나, SFE 약물이 투여된 실험군에서는 농도에 의존적으로 피부병변이 개선되는 효과가 있었다. 특히 200-400 mg/kg가 투여된 실험군에서는 4주째부터 억제하는 효과가 매우 뚜렷하였다(p<0.
- 06/ml로 현저히 증가되었다. 그러나 SFE가 처리된 실험군은 농도에 의존적으로 혈청 IgE의 생산량이 현저히 억제되었다. 200-400 mg/kg가 투여된 실험군에서 그 효과가 뚜렷하였다.
- 이러한 효과는 Th2 케모카인의 생산량을 억제시킴으로써 발휘할 수 있는 것으로 사료된다. 더욱이 AD의 가장 중요한 특징 중의 하나로 알려진, 혈청의 높은 IgE의 량을 SFE 투여로 현저히 억제 시킬 수 있는 결과를 얻었다. 따라서 고삼 추출물은 인간의 AD의 개선에 이용할 수 있는 효과적인 물질이라 사료된다.
- SFE를 경구투여한 결과 피부병변 스코어와 백혈구 침윤을 포함하는 Df-유도 아토피 피부염의 임상적 징후를 유의하게 억제하는 효과가 있었다. 더욱이 SFE 투여는 농도의존적으로 혈청 IgE와 Th2 케모카인(TARC/CCL17, MDC/CCL22, and CTACK/CCL27) 레벨을 유의하게 억제하였다. 이러한 결과는 SFE 경구투여가 Df-유도 아토피 피부염 모델 마우스에서 아토피 피부염의 임상적 징후와 Th2 케모카인을 유의하게 억제시킬 수 있는 것을 제시하였다.
- 3). 더욱이 단핵구, 비만세포, 호산구와 호중구의 침윤이 현저히 높아졌으나, SFE가 투여된 실험군에서는 농도에 의존적으로 백혈구의 침윤이 현저히 억제되었다(Fig. 4). 이러한 결과는 SFE의 투여는 임상적으로 AD을 크게 개선시킬 수 있는 약물로 평가되었다.
- 또한 백혈구 침윤에 미치는 SFE의 효과를 알아보기 위해서 Congo red로 조직을 염색하여 400배 현미경 시야에서 검증한 결과 Fig. 4와 같이 정상대조군에서는 백혈구의 변화가 없었지만, Df 항원으로 면역된 양성대조군에서는 단핵구(mononuclear cells)가 835.54±120.52/mm, 비만세포(mast cells)가 238.67±42.36/mm, 호산구(eosinophils)가 315.02±43.90/mm 그리고 호중구(neutrophils)가 291±32.51/mm로 백혈구 침윤이 현저히 증가했으나, SFE가 투여된 실험군에서는 농도에 의존적으로 단핵구, 비만세포, 호산구 그리고 호중구 등 백혈구 침윤이 현저히 억제되었다(p<0.05, p<0.01).
- 본 연구에서 우리는 NC/Nga 마우스를 SPF상태로 유지하면서 Df 항원으로 유도된 AD NC/Nga 마우스에서 고삼 추출액인 SFE의 임상적 영향을 조사한 결과 SFE의 농도에 의존적으로 치료효과가 있었다. Fig.
- 그러므로 CTACK/CCL27의 과도한 생산은 병변 부위의 심각한 염증반응을 유도하며, cutaneous lymphocyte-associated antigen(CLA) 양성 림프구의 이동을 매게하는 중요한 역할을 한다27). 본 연구의 결과 Df 항원으로 면역된 마우스의 혈청의 TARC/CCL17, MDC/CCL22 및 CTACK/CCL27 등은 정상대조군에 비해 현저히 높았으나, SFE가 투여된 실험군에서는 혈청내 이들 Th2 케모카인의 생산량이 약물의 농도에 다라 현저히 억제되었다(Fig. 6). 이러한 결과는 Df 항원으로 유도되는 Th2 세포의 이동과 침윤을 SFE가 효과적으로 억제하는 것으로 조사되었다.
- Df 항원으로 유도된 AD 모델 NC/Nga 마우스에서 중요한 면역학적 특징은 의간의 외인성 인간의 AD와 유사하게 혈청내 높은 IgE가 검출된다는 사실은 잘 알려져 있다. 본 연구의 결과에서도 Df 항원으로 면역된 마우스의 혈청내 IgE가 매우 높은 량으로 검출되었으나, SFE을 투여한 결과 농도에 의존적으로 그 생산량이 크게 억제되었다(Fig. 5).
- 6). 이러한 결과는 Df 항원으로 유도되는 Th2 세포의 이동과 침윤을 SFE가 효과적으로 억제하는 것으로 조사되었다. 그러나 CCR4와 CCR10의 발현에 미치는 고삼추출물의 영향과 신호전달 기전을 더 조사해야 확실한 AD 억제 약물로 활용될 수 있을 것이라 사료된다.
- 더욱이 SFE 투여는 농도의존적으로 혈청 IgE와 Th2 케모카인(TARC/CCL17, MDC/CCL22, and CTACK/CCL27) 레벨을 유의하게 억제하였다. 이러한 결과는 SFE 경구투여가 Df-유도 아토피 피부염 모델 마우스에서 아토피 피부염의 임상적 징후와 Th2 케모카인을 유의하게 억제시킬 수 있는 것을 제시하였다. 따라서 SFE는 인간의 AD 관리에 효과적인 물질이라 사료된다.
- 이상의 결과를 종합해볼 때 고삼 추출물인 SFE의 투여는 Df 항원 면역으로 유도된 AD 모델 NC/Nga 마우스의 임상적 피부 병변을 개선할 뿐만 아니라 단핵구, 비만세포, 호산구 및 호중구의 침윤을 억제하는데 효과가 있었다. 이러한 효과는 Th2 케모카인의 생산량을 억제시킴으로써 발휘할 수 있는 것으로 사료된다.
후속연구
- 이러한 결과는 Df 항원으로 유도되는 Th2 세포의 이동과 침윤을 SFE가 효과적으로 억제하는 것으로 조사되었다. 그러나 CCR4와 CCR10의 발현에 미치는 고삼추출물의 영향과 신호전달 기전을 더 조사해야 확실한 AD 억제 약물로 활용될 수 있을 것이라 사료된다.
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