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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 형태적으로 매우 유사한 3종간의 차이를 명확히 밝히고자 유전적 유사도가 가까운 종에서 유전적 변이를 나타내어 집단 구조 분석과 종 특이적인 marker 검출에 효과적인 것으로 알려져 있는 AFLP (Amplified fragment length polymorphism) 분석 (Roa et al., 1997; Liu and Cordes, 2004)을 통한 병어, 덕대 및 중국병어 사이의 유전적 변이를 추정하고 유전학적 동정을 위한 연구를 수행하였다.
제안 방법
- Gel 상에서 확인된 DNA 단편들은 밴드의 유무에 따라 0또는 1로 표시하여 matrix code를 작성한 후, 각 개체간의 유사도 matrix를 NTSYS 프로그램을 이용하여 (Rohlf, 1992) UPGMA로 분석하여 각각을 군집화하고 이를 토대로 dendrogram를 작성하였다. 각 집단별의 유전적 유사도 (genetic similarity)는 Nei and Li (1979)의 공식을 적용하여 계산하였다.
- Genomic DNA 1μg을 EcoRI/MseI 제한효소 (Promega, USA)를 첨가하여 반응시켜 이중 절단한 후 순수 분리하고 T4 DNA ligase (Promega, USA)와 EcoRI/MseI adapter를 첨가하여 ligation 반응을 수행하였다.
- 각 집단별의 유전적 유사도 (genetic similarity)는 Nei and Li (1979)의 공식을 적용하여 계산하였다. 또한 TFPGA (ver. 1.3) 프로그램을 사용하여 (Miller, 1997) 병어 덕대 및 중국병어의 평균 이형접합율 (heterozygosity)과 유전적 거리 (genetic distance)를 구하였고, 또한 ARLEQUIN (ver. 2.000) 프로그램 (Schineider et al., 2000)을 사용하여 평균 유전 다양성 (genetic diversity) 수준을 구하였다.
- 반응액을 1TE로 50배 희석하고 희석산물 5μL를 대상으로 EcoRI/ MseI selective primer, 10×PCR, dNTP, Taq DNA polymerase (Promega, USA) 1 unit을 이용하여 2차 PCR 을 수행하였다.
- 반응이 종료된 DNA를 대상으로 AFLP® Pre-amp Primer Mix I (Invitrogen, USA), Taq DNA polymerase (Promega, USA) 1 unit, 10×PCR 용액을 첨가하여 pre-amplification 반응을 수행하였다.
- 반응액을 1TE로 50배 희석하고 희석산물 5μL를 대상으로 EcoRI/ MseI selective primer, 10×PCR, dNTP, Taq DNA polymerase (Promega, USA) 1 unit을 이용하여 2차 PCR 을 수행하였다. 이때 PCR 반응은 touch-down PCR법을 이용하여 94℃ 30초, 65-56℃ (회당 0.7℃씩 감소) 30초, 72℃ 60초 간 12회 순환 반응을 실시 후 annealing 반응을 56℃ 30초로 고정하여 총 24회 반복 수행하였다. 최종 PCR product는 6% denaturing polyacrylamide gel에 전기영동하여 DNA 단편을 분리한 다음, silver staining kit (Promega, USA)로 염색하여 결과를 분석하였다.
- 자연산 병어와 덕대, 양식산인 중국병어 각각 10마리씩 4개의 primer 조합 (E/ACT-M/CAG, E/ACG-M/CAT, E/ATGM/CCC, E/AAT-M/CGC)으로 AFLP를 수행한 결과 중 총 밴드수, 다형성 밴드수준, 집단 내 유사도, 이형접합율, 그리고 유전다양성은 Table 1에 정리하였다. 총 304 개의 밴드가 관찰되었으며, 각 집단별 전체 밴드의 수는 병어 251개, 덕대 234개, 중국병어 153개로 분석되어 양식산인 중국병어 집단의 밴드수가 가장 적게 나타났다.
- 7℃씩 감소) 30초, 72℃ 60초 간 12회 순환 반응을 실시 후 annealing 반응을 56℃ 30초로 고정하여 총 24회 반복 수행하였다. 최종 PCR product는 6% denaturing polyacrylamide gel에 전기영동하여 DNA 단편을 분리한 다음, silver staining kit (Promega, USA)로 염색하여 결과를 분석하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 병어 P. argenteus와 덕대 P. echinogaster 는 전남 신안군 흑산도 근해에서 자연산을 채집하였고, 중국 병어 P. chinensis는 중국 푸젠성 샤먼시 소재 가두리양식장에서 사육 중인 양식산을 확보하여 Asahida et al. (1996)의 방법에 따라 꼬리지느러미에서 genomic DNA를 추출하여 AFLP 분석에 각각 10마리씩을 사용하였다.
이론/모형
- Gel 상에서 확인된 DNA 단편들은 밴드의 유무에 따라 0또는 1로 표시하여 matrix code를 작성한 후, 각 개체간의 유사도 matrix를 NTSYS 프로그램을 이용하여 (Rohlf, 1992) UPGMA로 분석하여 각각을 군집화하고 이를 토대로 dendrogram를 작성하였다. 각 집단별의 유전적 유사도 (genetic similarity)는 Nei and Li (1979)의 공식을 적용하여 계산하였다. 또한 TFPGA (ver.
성능/효과
- 각 개체간의 유사도 matrix에 따른 전체개체의 UPGMA dendrogram 결과 3종간 명확하게 분리되어 독립된 분지를 형성하였고, 병어와 덕대는 유전적 거리와 유사한 근연관계를 보였고, 중국병어는 유전적 거리가 가장 멀게 나타났다 (Fig. 2).
- 각 어종별 10개체 모두에서 검출되는 specific marker band는 E/ACT-M/CAG 조합에서 2개의 중국병어 specific marker band, E/ACG-M/CAT 조합에서는 덕대와 중국병어 각각 1개의 specific marker band, E/ATG-M/CCC 조합에서 덕대 1개, 중국병어 10개의 specific marker band, E/AAT-M/CGC 에서는 병어 1개, 중국병어 5개의 specific marker band가 각각 확인되었다 (Fig. 1). AFLP 기술을 이용하여 은어와 아종인 P.
- 위의 결과는 병어과 어류 3종을 형태학적으로 구분할 수 있다는 연구결과 (Kim and Han, 1989)와도 잘 일치하였으며, 유전학적 분석에서도 3종간 특이 marker의 존재 및 유전적 거리차이로 뚜렷히 구분되었다. 본 연구 결과 각 종별 특이 band는 primer 제작을 통해 유전적 동정을 위한 specific marker 로 활용이 가능할 것으로 판단된다.
- 유전적 거리는 병어와 중국병어가 0.646, 덕대와 중국병어가 0.584, 병어와 덕대가 0.335로 나타나 병어와 덕대가 가깝게 나타났으며, 병어와 중국병어가 가장 멀게 분석되었다 (Table 2). Shaklee and Pauly (1982)와 Thorpe and Sole-Cava (1994)는 단백질 또는 allozyme의 전기영동에 의한 유전적 거리에 의해 계통적인 차이를 구분한 바 있으며, Chen et al.
- 집단 내 유전적 유사도는 병어 0.666, 덕대 0.681, 중국병어가 0.944로 나타나 중국병어는 자연산 넙치 (Paralichthys olivaceus)의 0.90-0.91 (Xu et al., 2006)보다 높은 결과를 보여 개체간 유전적 유사도가 매우 높게 나타났으나, 병어와 덕대는 비교적 낮은 결과를 보였다. 평균 이형접합율은 병어 0.
- 자연산 병어와 덕대, 양식산인 중국병어 각각 10마리씩 4개의 primer 조합 (E/ACT-M/CAG, E/ACG-M/CAT, E/ATGM/CCC, E/AAT-M/CGC)으로 AFLP를 수행한 결과 중 총 밴드수, 다형성 밴드수준, 집단 내 유사도, 이형접합율, 그리고 유전다양성은 Table 1에 정리하였다. 총 304 개의 밴드가 관찰되었으며, 각 집단별 전체 밴드의 수는 병어 251개, 덕대 234개, 중국병어 153개로 분석되어 양식산인 중국병어 집단의 밴드수가 가장 적게 나타났다.
- 9%의 다형성 밴드를 보였다. 평균 유전 다양성은 병어 0.311, 덕대 0.290, 중국병어 0.038로 중국병어의 다양성이 낮은 것으로 분석되었다. 중국병어 내의 유전적 다양성이 감소된 경향은 양식된 집단의 다형성 밴드 및 유전 다양성의 수준이 자연집단에 비해 낮은 결과를 나타낸다는 보고와 같은 양상을 나타내었다 (Murakaeva et al.
후속연구
- 그러나 중국병어는 2000년대 초부터 양식이 시작된 것으로 알려져 근친교배가 지속적으로 이루어졌을 가능성보다는 적은 수의 친어를 사용하여 인공종묘생산을 함으로서 다형성 밴드 및 유전 다양성이 낮아졌을 가능성을 배제할 수 없을 것으로 판단된다. 또한 중국병어가 낮은 유전다양성을 보유할 가능성이 있어 자연산 집단과 양식집단의 유전다양성에 대한 추가연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 위의 결과는 병어과 어류 3종을 형태학적으로 구분할 수 있다는 연구결과 (Kim and Han, 1989)와도 잘 일치하였으며, 유전학적 분석에서도 3종간 특이 marker의 존재 및 유전적 거리차이로 뚜렷히 구분되었다. 본 연구 결과 각 종별 특이 band는 primer 제작을 통해 유전적 동정을 위한 specific marker 로 활용이 가능할 것으로 판단된다.
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